Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны митохондрий в моделях нейрональных клеток

Митохондрии — это эукариотические органеллы эндосимбиотического происхождения, которые отвечают за регуляцию нескольких ключевых клеточных процессов, включая промежуточный метаболизм и производство АТФ, ионный гомеостаз, биосинтез липидов и запрограммированную гибель клеток (апоптоз). Эти органеллы топологически сложны и содержат двойную мембранную систему, которая образует несколько подкомпартментов 1 (рис. 1А). Наружная митохондриальная мембрана (ОММ) взаимодействует с цитозолью и устанавливает прямые межорганелльные контакты ^2,3. Внутренняя митохондриальная мембрана (МПМ) представляет собой энергосберегающую мембрану, которая поддерживает ионные градиенты, хранящиеся в основном в виде электрического мембранного потенциала (ΔΨ_m), для управления синтезом АТФ и другими энергоемкими процессами ^4,5. IMM далее подразделяется на внутреннюю пограничную мембрану (IBM), которая плотно прижата к OMM, и выступающие структуры, называемые кристами, которые связаны кристальной мембраной (CM). Эта мембрана отделяет самый внутренний матриксный отсек от внутрикристаллического пространства (ICS) и межмембранного пространства (IMS).

Митохондрии имеют динамическую морфологию, основанную на непрерывных и сбалансированных процессах деления и слияния, которые регулируются механоферментами динаминного надсемейства⁶. Слияние позволяет увеличить связность и формирование ретикулярных сетей, в то время как деление приводит к фрагментации митохондрий и позволяет удалять поврежденные митохондрии с помощью митофагии⁷. Морфология митохондрий варьируется в зависимости от типа ткани⁸ и стадии развития⁹ и регулируется таким образом, чтобы позволить клеткам адаптироваться к таким факторам, как энергетические потребности^{10, 11} и стрессоры¹². Стандартные морфометрические характеристики митохондрий, такие как степень образования сети (взаимосвязанная или фрагментированная), периметр, площадь, объем, длина (соотношение сторон), округлость и степень ветвления, могут быть измерены и количественно оценены с помощью стандартной оптической микроскопии, поскольку размеры этих признаков превышают дифракционный предел света (~200 нм)¹³.

Архитектура Cristae определяет внутреннюю структуру митохондрий (рис. 1B). Разнообразие морфологий крист можно разделить на плоские (пластинчатые или дискоидальные) или тубулярно-везикулярные¹⁴. Все кристы прикрепляются в IBM через трубчатые или щелевые структуры, называемые кристальными переходами (CJ), которые могут служить для отделения IMS от ICS и IBM от CM¹⁵. Морфология Cristae регулируется ключевыми белковыми комплексами IMM, включая (1) митохондриальный контактный сайт и организационную систему cristae (MICOS), которая находится в CJ и стабилизирует контакты IMM-OMM 16, (2) ГТФазу оптической атрофии 1 (OPA1), которая регулирует ремоделирование крист^17,18,19, и (3) F₁F_O АТФ-синтазу, которая образует стабилизирующие олигомерные сборки на концах кристаллов (CTs)^{20, 21}. См. Кроме того, IMM обогащен недвухслойными фосфолипидами, фосфатидилэтаноламином и кардиолипином, которые стабилизируют сильно изогнутый IMM²². Кристы также динамичны, демонстрируя морфологические изменения в различных условиях, таких как различные метаболические состояния 23,24, с различными респираторными субстратами 25, при голодании и окислительном стрессе 26,27, при апоптозе ^28,29 и при старении ³⁰. Недавно было показано, что кристы могут претерпевать крупные изменения в течение нескольких секунд, что подчеркивает их динамическую^{природу.} Некоторые характеристики крист могут быть количественно определены, в том числе размеры структур внутри отдельных крист (например, ширина CJ, длина и ширина кристы) и параметры, которые связывают отдельные кристы с другими структурами (например, расстояние между кристаллами и угол падения крист относительно ОММ)³². Эти количественно поддающиеся количественной оценке параметры cristae показывают прямую корреляцию с функцией. Например, степень производства митохондриальной АТФ положительно связана с обилием крист, количественно определяемым как плотность кристаллов или число крист, нормированное по другому признаку (например, кристы на площадь ОММ)^33,34,35. Поскольку морфология ИММ определяется наноразмерными особенностями, она включает в себя митохондриальную ультраструктуру, что требует методов визуализации, обеспечивающих разрешение, превышающее предел дифракции света. Как описано ниже, к таким методам относятся электронная микроскопия и микроскопия сверхвысокого разрешения (наноскопия).

Нервные и глиальные клетки центральной нервной системы (ЦНС) особенно зависят от функции митохондрий. В среднем, мозг составляет всего 2% от общей массы тела, но использует 25% общей глюкозы в организме и на его долю приходится 20% потребления кислорода организмом, что делает его уязвимым к нарушениям энергетического метаболизма^. Прогрессирующие нейродегенеративные заболевания (НД), включая болезнь Альцгеймера (БА), боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Хантингтона (БГ), рассеянный склероз (РС) и болезнь Паркинсона (БП), являются одними из наиболее широко изученных патологий на сегодняшний день, причем исследовательские усилия варьируются от понимания молекулярных основ этих заболеваний до поиска потенциальных терапевтических профилактики и вмешательств. НД связаны с повышенным окислительным стрессом, частично вызванным активными формами кислорода (АФК), генерируемыми митохондриальной цепью переноса электронов (ETC)³⁷, а также с изменением митохондриального кальциевого управления 38 и митохондриального липидного метаболизма³⁹. Эти физиологические изменения сопровождаются отмеченными дефектами морфологии митохондрий, которые связаны с AD 40,41,42,43,44, ALS^45,46, HD^47,48,49, MS⁵⁰ и PD ^51,52,53. Эти структурные и функциональные дефекты могут быть связаны сложными причинно-следственными связями. Например, учитывая, что морфология кристы стабилизирует ферменты OXPHOS⁵⁴, митохондриальные АФК не только генерируются ETC, но и повреждают инфраструктуру, в которой находится ETC, способствуя циклу прямых АФК, который повышает восприимчивость к окислительному повреждению. Кроме того, было показано, что дезорганизация крист запускает такие процессы, как высвобождение митохондриальной ДНК (мтДНК) и воспалительные пути, связанные с аутоиммунными, метаболическими и возрастными расстройствами. Таким образом, анализ митохондриальной структуры является ключом к полному пониманию НД и их молекулярных основ.

Популярные методы исследования крист, включая просвечивающую электронную микроскопию, электронную томографию и криоэлектронную томографию (крио-ЭТ), а также рентгеновскую томографию, в частности крио-мягкую рентгеновскую томографию, позволили получить важные результаты и работать с различными типами образцов 56,57,58,59,60 . Несмотря на недавние достижения в области лучшего наблюдения за ультраструктурой органелляров, эти методы по-прежнему имеют оговорку, требующую фиксации образца и, следовательно, не могут напрямую фиксировать динамику кристаллов в реальном времени. Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения, особенно в формах микроскопии со структурированным освещением (SIM), стохастической оптической реконструктивной микроскопии (STORM), фотоактивированной локализованной микроскопии (PALM), расширительной микроскопии (ExM) и микроскопии с вынужденным эмиссионным истощением (STED), стали популярными способами просмотра структур, требующих разрешения ниже дифракционного предела, который ограничивает классические методы оптической микроскопии. При использовании ExM в сочетании с другим методом сверхвысокого разрешения результаты впечатляют, но образец должен быть зафиксирован и окрашен в гель⁶¹. Для сравнения, SIM, PALM/STORM и STED были успешно использованы с живыми образцами, а новые и перспективные красители, которые обычно окрашивают IMM, обеспечивают новый и простой подход к визуализации митохондрий cristae^dynamics 62,63,64,65,66. Недавние достижения в области живых красителей для визуализации ЗППП улучшили яркость и фотостабильность красителей, и эти красители нацелены на IMM с более высокой степенью специфичности, чем их предшественники. Эти разработки позволяют собирать долгосрочные эксперименты с таймлапсом и z-стеком с визуализацией сверхвысокого разрешения, открывая дверь для лучшего анализа ультраструктуры и динамики митохондриальных клеток в живых клетках.

В данной работе представлены протоколы визуализации живых клеток недифференцированных и дифференцированных клеток SH-SY5Y, окрашенных красителем PKmito Orange (PKMO) с использованием STED⁶³. Клеточная линия SH-SY5Y представляет собой трижды клонированное производное родительской клеточной линии SK-N-SH, полученное из биопсии костного мозга метастатической нейробластомы 67,68,69,70. Эта клеточная линия является широко используемой моделью in vitro в исследованиях НД, особенно при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, БГ и болезнь Паркинсона, в которых митохондриальная дисфункция в значительной степени вовлечена 10,43,71,72,73. Способность дифференцировать клетки SH-SY5Y в клетки с нейроноподобным фенотипом путем манипулирования питательными средами оказалась подходящей моделью для исследований в области неврологии, не полагаясь на первичные нейрональные клетки^10,74. В этом протоколе ретиноевая кислота (РА) добавлялась в питательную среду для клеточной культуры, чтобы индуцировать дифференцировку клеток SH-SY5Y. Ревматоидный артрит является производным витамина А и, как было показано, регулирует клеточный цикл и способствует экспрессии транскрипционных факторов, регулирующих дифференцировку нейронов⁷⁵. Также представлен протокол культивирования и визуализации живых клеток нейронов, выделенных из гиппокампа крысы. Было показано, что гиппокамп подвержен митохондриальной дегенерации и, наряду с корой головного мозга, играет важную роль в старении и ND 76,77,78,79,80.

1. Размножение и дифференцировка клеток SH-SY5Y

1. Подготовка среды для роста и поддержания клеток
   1. Приготовьте полноценную модифицированную орлиную среду Dulbecco с высоким содержанием глюкозы (DMEM, 4,5 г/л D-глюкозы, 4 мМ L-глютамина, 110 мг/л пирувата натрия) с добавлением 1% (v/v) антибиотика-антимикотика (10 000 ЕД/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл амфотерицина B) и различных количеств фетальной бычьей сыворотки (FBS) (см. Таблицу материалов). Количество FBS в дифференцированных средах варьируется в пределах 10%, 5% или 2% (v/v) FBS.
2. Обслуживание клеток
   1. Поддерживайте клетки в DMEM с добавлением 10% (v/v) FBS и помещайте их при 37 °C и 5% CO₂, затем засевайте в DMEM с содержанием 5% (v/v) FBS для дифференцировки. Замороженные запасы клеток хранили в FBS с 10% (v/v) диметилсульфоксидом (ДМСО) в концентрации 1-2 x 10⁷ клеток/мл.
3. Приготовление ретиноевой кислоты (РА)
   1. Растворите 7,51 мг all-trans-RA (см. таблицу материалов) в 5 мл свежеприготовленного 95% этанола до получения 5 мМ исходного раствора. Проверяют концентрацию с абсорбцией при 350 нм (ɛ = 44 300 М-1 ^см-1), полученную из паспорта продукта из протокола производителя⁸¹, используя разбавление исходного раствора при 5 мкМ в этаноле. Храните 5 мМ в защищенном от света месте при температуре 4 °C до 6 недель.
4. Приготовление поли-D-лизина для покрытия покровным покрытием
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол поли-D-лизина (PDL), который можно найти в разделе «Документы и загрузки» на сайте^{поставщика 82}, содержит информацию о нанесении покрытий на различные сосуды для культивирования.
   1. Данный протокол включает в себя объемы на основе 2-луночного камерного сосуда площадью 4^см2 на лунку со стерильным боросиликатным покровным дном #1,5 (см. таблицу материалов). Разбавьте исходный раствор PDL в два раза до 50 мкг/мл PBS Dulbecco (DPBS; без кальция и магния).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покровное стекло #1.5 или #1.5H является приемлемой толщиной, что имеет важное значение для качества изображения. Другие толщины вызывают сферическую аберрацию, и их следует избегать.
5. Покрытие покровного стекла PDL
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покровные стекла можно подвергать воздействию ультрафиолетового (УФ) света в течение 10-15 минут в шкафу биобезопасности для дальнейшей стерилизации.
   1. Наносят по 1,2 мл раствора PDL 50 мкг/мл на каждую лунку стерильных камерных покровных стекол в шкафу для клеточных культур и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Удалите раствор PDL и трижды промойте 3,6 мл дистиллированной воды. После завершения окончательной стирки дайте камере с покрытием высохнуть в течение 2 часов на воздухе, прежде чем ополаскивать и использовать сразу или хранить в герметичном контейнере при температуре 4 °C до 2 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно промойте покровные стекла, так как избыток PDL может быть токсичным для клеток.
6. Дифференцировка клеток SH-SY5Y с РА
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте ячейки выше прохода 15. Клетки проходят при слиянии 80%-90%. Процедуры дифференциации различаются, но следуют схожим этапам. Дополнительная дифференцировка от нейробластом к зрелым нейронам получена при дальнейшем лечении нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF)68,83,84,85^, но в данном протоколе не проводилась.
   НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Установите ячейки не менее чем за 24 часа до посева на покровное стекло. Чтобы получить клетки из замороженных запасов, быстро разморозьте 1 мл замороженного флакона клеток и добавьте к 9 мл предварительно подогретой среды с добавлением 10% FBS, затем отжим при 350 x g в течение 10 мин (при комнатной температуре) и выбросьте надосадочную жидкость для удаления ДМСО. Повторно суспендируйте гранулы в 5 мл предварительно подогретой среды и семенные ячейки в колбе Т-25. Как только клетки достигнут 80%-90% слияния, пассажируйте клетки, подсчитывая и засевая их для дифференцировки, когда это применимо.
   1. День 0: Семенные клетки.
      1. Высевают клетки на камерное покровное стекло из замороженных запасов или рабочую колбу. Используйте плотность посева 1,5 x 10⁴ клетки/^см2.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для одной лунки в стандартном 2-луночном покровном стекле с площадью культивирования 4 см² потребуется 6,0 x 10⁴ ячейки. Клетки, которые останутся недифференцированными, должны быть засеяны DMEM с добавлением 10% (v/v) FBS, а клетки, которые будут дифференцированы, должны быть засеяны DMEM с добавлением 5% (v/v) FBS.
   2. День 1: Начать дифференцировку РА.
      1. Приготовьте DMEM с добавлением 5% (v/v) FBS, 1% (v/v) антибиотика-антимикотика и конечной концентрации 10 мкМ RA или этанола того же объема добавки, чтобы служить в качестве транспортного средства для этой процедуры дифференциации. Удалите фильтрующий материал из защитного стекла, используемого для посева, промойте 1x PBS и добавьте новый DMEM в лунки.
   3. День 3: Замените носитель свежим материалом, содержащим RA или этанол.
      1. Удалите среду с 1-го дня и замените свежей средой с добавлением 2% (v/v) FBS, 1% (v/v) антибиотик-антимикотик и либо 10 мкМ RA, либо 95% этанола того же объема добавки, чтобы служить в качестве средства контроля для этой процедуры дифференциации. Удалите фильтрующий материал из покровного стекла, используемого для посева, промойте 1x PBS и добавьте новую среду в лунки.
   4. День 6: Визуализация клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время дифференцировки клеток варьируется в зависимости от протокола, но шести дней воздействия РА достаточно, чтобы индуцировать нейроноподобный фенотип в клетках SH-SY5Y⁸⁶.
      1. Выполните визуализацию в реальном времени, подробности описаны в разделах 3 и 4 (рис. 2).

2. Первичная культура нейронов гиппокампа крыс

1. Подготовка материалов для выделения нейронов гиппокампа крыс.
   1. Приготовьте свежий дополненный ДМЭМ.
      1. Отфильтруйте-стерилизуйте смесь DMEM (с высоким содержанием глюкозы, без пирувата натрия) с добавлением 10% (v/v) термоинактивированного FBS, 1% (v/v) раствора пирувата натрия и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина (10 000 Ед/мл). Хранить до 2 недель при температуре 4 °C.
   2. Приготовьте свежую питательную среду для роста нейронов.
      1. Отфильтруйте-стерилизуйте смесь питательных сред нейронов с добавлением 2% (v/v) добавки B27, 0,25% (v/v) добавки глутамина и 1% (v/v) пенициллина-стрептомицина (см. таблицу материалов). Хранить до 2 недель при температуре 4 °C.
2. Подготавливают первичную культуру нейронов гиппокампа.
   1. Готовят первичную культуру нейронов гиппокампа в соответствии с ранее опубликованной работой⁸⁷ и протоколом продукта на сайте производителя, из которого получен препарированный гиппокамп крысы Е18⁸⁸ (см. таблицу материалов). Этот протокол приводит к тому, что популяция в основном нейронов содержит <2% астроцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для гибернации, с которой поставляется эта ткань, будет использоваться для будущих этапов этого протокола. Не выбрасывайте его.
   2. Подготовьте материалы и среды для диссоциации тканей.
      1. Подожгите пипетку Пастера, чтобы уменьшить диаметр отверстия, и храните ее в фольге, чтобы предотвратить загрязнение до использования. Разогрейте подготовленный DMEM, 1X буферный солевой раствор Хэнка (HBSS) и питательную среду для нейронов до 37 °C. Добавьте 2 чешуйки ДНКазы стерильным пинцетом в коническую пробирку объемом 15 мл.
   3. Провести диссоциацию тканей.
      1. Удалите как можно больше гибернальной среды, в которой хранится препарированный гиппокамп крысы E18, прежде чем поместить ткань в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую ДНКазу, и провести непродолжительную инкубацию при 37 °C. Добавьте 900 мкл 1X HBSS, а затем 100 мкл 0,5% трипсина. Инкубируйте ткань при температуре 37 °C в течение 15 мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты с покрытием PDL можно извлечь из хранилища и поместить в инкубатор до использования в течение этого инкубационного периода.
   4. Провести гомогенизацию тканей и подсчет клеток.
      1. После инкубации с трипсином удалите среду и добавьте в ткань 1 мл предварительно подогретой гибернированной среды-ДНКазы из предыдущего этапа и гомогенизируйте пипеткой Пастера. Среда будет выглядеть непрозрачной, а затем постепенно прозрачной по мере продолжения гомогенизации.
      2. Добавьте диссоциированные нейроны в новую пробирку с 4 мл предварительно подогретого DMEM, а затем подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток.
   5. Выполнение покрытия клеток и выращивание первичных клеток.
      1. Пластинчатые ячейки с плотностью примерно 1,65 x 10⁴ ячейки/^см2 в DMEM. Для 2-луночного покровного стекла (4 см 2) высевают 65 000 – 70 000 клеток на лунку с² мл DMEM. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO 2 в течение₂ ч перед проверкой на адгезию. Как только клетки начнут прилипать, удалите 1 мл среды и замените ее таким же объемом гибернированной среды, затем осторожно перемешайте, чтобы перемешать. После того, как среда будет смешана, повторите этот процесс и удалите половину присутствующей среды и замените тем же объемом среды для роста нейронов, затем осторожно перемешайте.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Днем нанесения покрытия считается день in vitro (DIV) 0, а клетки готовы к изображению в DIV 7 (рис. 2).

3. Подготовка клеток к визуализации живых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Типы и происхождение клеток (т.е. культивируемые и первичные клетки) могут различаться по требованиям к окрашиванию; Подробнее см. опубликованные отчеты^62,63.

1. Приготовление PKmito Orange
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие красители, которые обычно окрашивают IMM, были зарегистрированы^{как 64,65,66} и являются коммерчески доступными. PKMO является единственным, используемым в этом протоколе.
   1. Ресуспендировать порошок ПКМО (см. таблицу материалов) в ДМСО в соответствии с инструкциями изготовителя⁸⁹. Отсасывайте среду из клеток и промывают в предварительно подогретых свободных от фенола средах. Перед окрашиванием клеток готовят запас ПКМО в предварительно подогретом ДМЭМ, не содержащем фенолового красного, с добавлением 2% (v/v) FBS или 10% (v/v) в зависимости от степени дифференцировки, HEPES до конечной концентрации 20 мМ и 1% (v/v) антибиотика-антимикотика перед окрашиванием клеток. Эта формула, без PKMO, представляет собой среду для визуализации живых клеток.
2. Окрашивание клеток с помощью ПКМО
   1. Инкубируют клетки с красителем при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение 30 мин. Промойте клетки трижды с помощью среды для визуализации живых клеток, а для окончательной промывки инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C, 5%_CO2.
   2. Добавьте свежие, предварительно подогретые носители для визуализации живых клеток. Теперь клетки готовы к визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неотложные методы лечения (например, лекарственные препараты и/или стрессоры), если они используются, добавляются перед визуализацией в реальном времени; см. раздел «Обсуждение» и дополнительный рисунок 1.

4. Визуализация живых клеток с помощью STED-микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется система STED, построенная на основе инвертированного микроскопа, с системой, указанной в таблице материалов. Эта система оснащена импульсными возбуждающими лазерами (лазер 561 нм с номинальной мощностью ~300 мкВт) и импульсным лазером истощения STED 775 нм (номинальная мощность 1,2 Вт), бесступенчато регулируемым гальваносканером и лавинным фотодиодным детектором (APD) на основе фильтра 615/20 нм. Здесь используется 100x/1.40 масляный иммерсионный объектив для STED. Для получения изображений используется программное обеспечение Lightbox. Все предоставленные детали имеют непосредственное отношение к данному программному обеспечению и настройке системы.

1. Общие рекомендации и этапы визуализации
   1. Используйте инкубатор или климатическую камеру для поддержания жизнеспособности клеток, но краткосрочные эксперименты при комнатной температуре также приемлемы. Эти шаги относятся к описанной выше настройке STED.
   2. Выберите набор лазеров и фильтров для визуализации.
      1. Используйте параметры для оранжевого красителя, выбрав краситель(и), используемый в окрашивании, из списка красителей или тот, у которого спектральные свойства наиболее близки к используемому красителю. Сделайте их активными, дважды щелкнув или перетащив их в список образцов, где написано «Перетащите сюда красители».
   3. Выберите регион для изображения.
      1. В обзоре создайте область интереса (ROI) вокруг интересующей митохондрии, выбрав прямоугольную кнопку ROI , щелкнув и перетащив ее, чтобы сформировать область. Размер ROI можно изменять и поворачивать с помощью углов ROI или изогнутых краев, которые появляются при наведении курсора мыши на угол.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Сводку предлагаемых параметров визуализации можно найти в таблице 1. Эти параметры были эмпирически скорректированы с использованием ранее описанных параметров для этой установки STED и комбинации красителей⁶³.
   4. Настройте стробирование.
      1. Рядом с меню « Общие » выберите меню « Стробирование » или нажмите и удерживайте, чтобы добавить меню в представление. Рекомендуется настроить стробирование детектора STED на длину от 1-1,05 до 7,8-7,85 нс, как показано здесь. Время стробирования может варьироваться и составлять от 1-1,05 до 7-7,05 нс.
   5. Отрегулируйте интенсивность соответствующим образом в соответствии с образцом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мощность возбуждения, используемая для STED, в 2-3 раза превышает мощность, используемую для конфокального, поэтому образец, требующий 5% мощности возбуждающего лазера для конфокального сигнала, может использовать 10%-15% мощности возбуждающего лазера во время регистрации STED.
      1. Установите лазер возбуждения для STED на 15%-20% и лазер истощения STED на 20%-25% с накоплением 10 линий. Используйте время задержки пикселя 4 мкс при размере пикселя 20-25 нм. Точечное отверстие было сохранено на уровне 1,0 а.е. для культивируемых клеток и 0,7 а.е. для первичных клеток гиппокампа крысы, чтобы улучшить оптическое сечение в более плотно упакованных митохондриях.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для параллельного сравнения могут быть получены как конфокальные изображения, так и изображения STED (Рисунок 3A, B, Рисунок 4A) или только STED.
2. Дополнительная информация о временных рядах/z-сериях
   1. Выберите временной ряд.
      1. Выберите раскрывающееся меню Время. Определите количество итераций (здесь используется 5) и интервал времени (здесь используется 25 или 30 с), желаемый для таймлапса (рис. 3C, D, рис. 4B).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если интервал короче, чем время сбора, итерации будут продолжаться без какой-либо задержки. При выполнении таймлапса настоятельно рекомендуется использовать идеальный блок фокусировки или аналогичное отслеживание фокусировки, чтобы избежать потенциального дрейфа.
   2. Установите диапазон громкости.
      1. Установите диапазон z-объема по желанию, включив опцию Volume и отрегулировав два конца диапазона. Размеры шага, используемые в этом протоколе для 2D-визуализации, составляли 150-200 нм. Рекомендуемый размер шага по отношению к выборке по Найквисту, необходимый для деконволюции сырого STED, может быть рассчитан с помощью онлайн-инструментов⁹⁰.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность лазера истощения STED и количество отображаемых плоскостей могут увеличить фотообесцвечивание красителя и воздействие света на клетку до вредных уровней. Проверьте наличие признаков фототоксичности и фотоповреждений после приобретения.

5. Инструменты обработки и анализа ультраструктуры митохондрий

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка изображений (т.е. деконволюция) не является обязательной, но обычно используется при создании и анализе изображений STED для публикации. Деконволюция для улучшения контраста и уменьшения шума настоятельно рекомендуется для оптимальной сегментации отдельных крист, как описано ниже (рис. 2).

1. Деконволюция изображения STED
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, используемое для деконволюции в этом протоколе, приведено в таблице материалов.
   1. Задайте микроскопические параметры изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что метаданные микроскопа правильно введены в поле «Параметры микроскопа» изображения. К ним относятся показатель преломления монтажной среды; иммерсионная среда; размер пикселя; длины волн возбуждения, излучения и истощения; и любую другую соответствующую информацию. Шаблоны с этими параметрами можно сохранить для повторного использования.
   2. Деконволютивные необработанные изображения STED с помощью программного алгоритма.
      1. Доступ к автоматизированным алгоритмам деконволюции в программном обеспечении для деконволюции позволяет выполнять деконволюционную обработку изображений без участия оператора. Нажмите кнопку «Экспресс» и установите тип деконволюции на «Быстрая», «Стандартная», «Агрессивная» или «Консервативная» для различных степеней мощности деконволюции. Показаны репрезентативные изображения, использующие экспресс-деконволюцию с агрессивными настройками (рис. 3, рис. 4 и рис. 5).
      2. Сохраните изображения из программы деконволюции в формате ICS2.
   3. Для ручной деконволюции выполните следующие действия.
      1. Вкратце, при выполнении ручной деконволюции сохраняйте шаблоны мастера деконволюции для единообразия и имейте возможность загрузить шаблон при запуске мастера. Используйте информацию о функции распределения измеренных точек (PSF), если она сгенерирована с настройками и параметрами сбора.
      2. При необходимости обрежьте необработанное изображение STED, прежде чем программное обеспечение деконволюции автоматически стабилизирует изображение. Дополнения к программным пакетам деконволюции позволяют компенсировать возможные артефакты изображения, такие как тепловой дрейф и хроматические аберрации.
      3. Затем сгенерируйте логарифмическую гистограмму для ручного или автоматического выполнения вычитания фона. Выберите классический алгоритм деконволюции оценки максимального правдоподобия (CMLE).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для деконволюции ключевыми значениями для настройки являются порог отношения сигнал/шум, количество итераций и порог качества. Эти значения можно настроить, а деконволюцию можно предварительно просмотреть для определения оптимальных настроек.
2. Сегментация и анализ частиц
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует FIJI (Is Just ImageJ), программное обеспечение с открытым исходным кодом (см. Содержание материалов) для сегментации и анализа. Для этих целей доступно другое аналогичное программное обеспечение, включая CellProfiler, Icy, Ilastik и QuPath.
   1. Подготовьте изображения для сегментации.
      1. Откройте необработанные изображения STED .obf или файлы .ics2 из программного обеспечения деконволюции, перейдя в меню File → Open или щелкнув и перетащив файлы на панель инструментов ImageJ. Отсюда любая обработка, облегчающая сегментацию изображений, может быть выполнена до сегментации.
      2. Чтобы сохранить согласованность изменений, записывайте функции с помощью Плагины → Макросы → Запись, а также копируйте и вставляйте ключевые команды в новый макрос из Плагины → Новый → Макрос. Перед запуском макроса убедитесь, что выбрано изображение для обработки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно приемлемые изменения для количественного определения размера и формы включают обрезку, проецирование z-стека и вычитание фона с отключенным сглаживанием. Изменения должны выполняться согласованно между изображениями в наборе данных и сообщаться.
   2. Настройка обучаемых параметров сегментации Weka
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опубликована дополнительная информация с пошаговыми инструкциями по использованию полуавтоматического инструмента сегментации и последующего анализа митохондрий^.
      1. Откройте деконволютированные изображения STED в подключаемом модуле Trainable Weka Segmentation (TWS)⁹² , расположенном в разделе Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation. В настройках сегментации выберите функции Размытие по Гауссу, Мембранные проекции и Фильтр Собеля . Толщина мембраны по умолчанию равна 1, а размер участка мембраны по умолчанию равен 19.
      2. Обозначьте класс 1 или 2 как "Cristae", а другой как "Background" (рисунок 2). Модели также можно сохранить с помощью кнопки Сохранить классификатор . Выберите Загрузить классификатор , чтобы повторно использовать эти настройки для других изображений.
   3. Выполнение трассировки классов TWS.
      1. Используйте инструмент «Линия» или другие фигуры, чтобы выделить некоторые кристы или фон. По крайней мере, некоторые фоновые выделения должны включать пробелы между кристами. Нарисуйте линию над структурой, чтобы присвоить ее любому классу, затем нажмите кнопку «Добавить в » справа для cristae или background. Дважды щелкните трассировку, чтобы удалить структуру из этой метки.
   4. Обучение классификации TWS.
      1. Нажмите кнопку Обучить классификатор слева, чтобы создать карту на основе информации, предоставленной плагину. Наложение сегментированных классов можно включать и выключать с помощью кнопки Toggle Overlay , а непрозрачность наложения можно настроить в Настройках. Классификатор можно переобучить с помощью дополнительных меток. Когда все будет удовлетворено, нажмите кнопку «Получить вероятность ».
   5. Измерьте частицы.
      1. Используя карту вероятностей cristae, установите пороговое значение изображения, чтобы создать маску, а затем перейдите в Анализ → Анализ частиц. Как правило, можно использовать тип порога по умолчанию и настроить диапазон, чтобы обеспечить учет всех крист. Измерения, полученные при анализе частиц, можно настроить с помощью параметров Анализ → Установить измерения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры параметров размера и формы, таких как площадь, периметр, округлость и соотношение сторон крист, измеряются и отображаются на основе выбранных измерений (Рисунок 2, Рисунок 5A, Дополнительная таблица 1).
      2. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Выберите необработанное изображение STED с теми же размерами, что и деконволютированное изображение, и примените ROI из менеджера, а затем выберите Измерить в диспетчере ROI, чтобы получить значения интенсивности.
   6. Получение линейных графиков.
      1. Линейные графики были построены на основе деконволюционных изображений STED. Нарисуйте многоточечную линию, отрегулируйте толщину линии до нескольких пикселей в ширину, чтобы усреднить шум, и станцуйте линию, чтобы она соответствовала митохондриям (рис. 2, рис. 5B). Полученный линейный график используется для измерения расстояний от пика до пика, чтобы сообщить о периодичности и распределении крист в определенном диапазоне.
         Примечание: В связи с этим, плотность крист может быть представлена как количество независимых крист в пределах данной области, определяемое путем измерения внешней части митохондрий. Митохондриальную площадь можно определить, применив фильтр к деконволюционному или необработанному изображению STED для создания маски. Убедитесь, что маска точно соответствует контуру митохондрий, прежде чем измерять площадь.

Этот протокол описывает условия роста культивируемых и первичных клеток с акцентом на визуализацию ЗППП живых клеток и последующий анализ митохондриальных крист. Проекции, сделанные с помощью ImageJ митохондрий из недифференцированных клеток SH-SY5Y (рис. 3A) и RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y (рис. 3B), могут быть собраны в виде z-стеков с традиционными конфокальными и STED, а затем необработанные изображения STED могут быть деконволютированы. Также может быть выполнена таймлапс-визуализация, которая впоследствии деконволюционируется (рис. 3C, D). Используя несколько отличающиеся параметры визуализации для первичных нейронов гиппокампа крысы (Таблица 1), конфокальные и необработанные изображения ЗППП могут быть получены в виде z-стеков, а необработанные изображения ЗППП могут быть деконволютированы (Рисунок 4А). Также возможна таймлапс-визуализация митохондрий первичных нейронов (рис. 4B). В целом, интервальные изображения должны быть способны отображать митохондриальные динамические события.

Когда необработанные и деконволютированные проекции z-стека STED из выборок, используемых для сегментации, кажутся согласованными, выполняются количественные измерения. Плагин TWS использует деконволютированное изображение STED для сегментации для создания вероятностной маски, которая затем используется для создания бинарной маски крист для получения параметров размера и формы (рисунок 5A). Области из этой маски сохраняются в диспетчере ROI и при необходимости могут быть применены к необработанному изображению STED для измерения различий в относительной интенсивности. Деконволютированные проекции STED также могут быть использованы для определения периодичности и плотности кристаллов в заданной области (рис. 5B).

Рисунок 1: Морфология митохондрий. Митохондрии имеют двухмембранную систему, которая определяет различные подкомпартменты (А). Кристы представляют собой складки внутренней мембраны с определенными особенностями (B). Сокращения: ОММ, наружная митохондриальная мембрана; ICS, внутрикристаллическое пространство; IMS, межмембранное пространство; CM, кристальная мембрана; IBM, внутренняя граничная мембрана; МПМ, внутренняя митохондриальная мембрана; CT, кристальный наконечник; CJ, cristae junction. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схема рабочего процесса. Клетки SH-SY5Y или первичные нейроны гиппокампа крысы выращивают на покровном стекле, покрытом PDL. Клетки SH-SY5Y выращиваются параллельно, чтобы оставаться недифференцированными или подвергаться дифференцировке РА в течение шести дней. Первичные нейроны гиппокампа крыс выращивали на покрытом PDL покровном стекле после того, как они были изолированы от срезов гиппокампа в течение семи дней. После того, как клетки были готовы к визуализации, их окрашивали PKMO и визуализировали STED. Затем необработанные изображения STED деконволюционируются, а деконволюционные изображения обрабатываются в FIJI для получения измерений размера и формы, таких как кристальная плотность, площадь, периметр, округлость и соотношение сторон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Визуализация митохондрий в клетках SH-SY5Y. Показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные STED (в центре) и деконволюционные проекции изображений STED (справа) митохондрий из недифференцированных (A) и RA-дифференцированных (B) клеток SH-SY5Y с окрашиванием PKMO. Показан таймлапс с интервалами 30 с и 5 итерациями RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y (C) с расширенными (D) выделенными областями (белыми прямоугольниками) с использованием масштабированных изображений этих областей без интерполяции. Масштабные линейки: A,B, 250 нм; C,D, 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Визуализация митохондрий в первичных нейронах гиппокампа крысы. На рисунке показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные STED (в центре) и деконволюционные STED-проекции Гюйгенса (справа) на митохондрии первичных нейронов гиппокампа крыс (A). Показан таймлапс с интервалом 25 с и 5 итерациями митохондрий в этих нейронах (B). Масштабные линейки: А, 250 нм; B , 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Обработка деконволютированных STED-изображений в ImageJ. Показано репрезентативное использование плагина Trainable Weka Segmentation для измерения размера и формы кристы (A). Слева направо показаны следующие изображения: деконволюрированное изображение STED, карта вероятностей, основанная на сегментации из плагина TWS, маска из порогового значения в FIJI с использованием карты вероятностей в качестве входных данных, маска с очерченными ROI и ROI, наложенные на исходное деконволютированное изображение STED. Результирующие измерения площади, периметра, окружности и соотношения сторон, соответствующие этим объектам, можно найти в Дополнительной таблице 1. На рисунке показан линейный график с использованием деконволютированного изображения STED для измерения расстояний от пика до пика в качестве считывания плотности кристы (B). Масштабные линейки: 0,5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сводные параметры сбора STED. Отображаются настройки, используемые для 2D-визуализации STED для каждого типа клеток: недифференцированного SH-SY5Y, RA-дифференцированного SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы. Для всех таймлапсов было выполнено 5 итераций с различными интервалами в зависимости от размера ROI.

Дополнительный рисунок 1: Визуализация клеток SH-SY5Y с добавлением амилоид-β (Aβ). На рисунке показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные (в центре) и деконволюционные изображения STED (справа) RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y с окрашиванием PKMO (вверху) и Aβ-HiLyte647 (внизу) (A). Показаны объединенные проекции z-стека необработанного PKMO STED (зеленый) с необработанным Aβ STED (пурпурный) (B) или деконволюционного PKMO STED (зеленый) с деконволюционным Aβ STED (пурпурный) (C). Масштабные линейки: 0,5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Размеры и форма сегментированных крист. Показаны размеры и формы площади (мкм2), периметра (мкм), округлости и соотношения сторон, соответствующие объектам, изображенным на рисунке 5А из сегментированных митохондрий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Сводные параметры сбора данных с образцами β амилоида. Отображаются настройки, используемые для 2D-визуализации PKMO и Aβ-HiLyte647 в недифференцированных и RA-дифференцированных клетках SH-SY5Y. Конфокальный Aβ-HiLyte647 может быть использован отдельно, так как не существует специфической структуры, которую нужно разрешить; Здесь показаны STED-изображения Aβ-HiLyte647 для частиц меньшего размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Протокол лечения амилоидной β. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторам нечего раскрывать.