Скрининг аналогов фентанила с использованием LC-TIMS-TOF MS/MS

Краткое содержание

Предложен метод скрининга аналогов фентанила, основанный на времени их удержания, подвижности и масс-спектрометрической картине фрагментации.

Аннотация

Употребление фентанила и появление аналогов фентанила в последние десятилетия вызывает все большую озабоченность у общества в целом. Фентанил и его аналоги являются основными причинами смертельных и несмертельных передозировок в Соединенных Штатах. Большинство последних случаев передозировки, связанной с фентанилом, связаны с незаконно изготовленным фентанилом и связанной с ним чрезвычайной потенцией. В настоящей работе мы описываем высокопроизводительный аналитический протокол для скрининга аналогов фентанила. Использование комплементарной жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и тандемной масс-спектрометрии позволяет отделять и назначать сотни аналогов фентанила из одного образца за одно сканирование. Описанный подход использует преимущества последних разработок в области сбора, зависящего от данных, и сбора данных, использующего параллельное накопление в ловушке мобильности с последующей последовательной фрагментацией с использованием диссоциации, вызванной столкновением. Аналоги фентанила уверенно назначаются исходя из времени их удержания, подвижности и характера фрагментации РС.

Введение

Фентанил и его аналоги являются основными причинами смертельных и несмертельных передозировок в Соединенных Штатах ^1,2. Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) сообщил, что число смертей, связанных с передозировкой синтетическими опиоидами, с 2013 по 2021 год составило более 258 000. Только в 2021 году более 68 000 смертей от передозировки могут быть связаны с синтетическими опиоидами, что составляет 82% всех смертей, связанных с передозировкой, в стране³. С 2013 года были выявлены сотни аналогов фентанила, с различной эффективностью⁴. С появлением незаконно изготовленных аналогов фентанила сам синтетический опиоид из Списка II остается самым популярным синтетическим опиоидом, доступным в Соединенных Штатах³. По данным Центра исследований и образования в области судебной медицины (CFSRE), самым распространенным аналогом фентанила в 2022 году был фторфентанил, и в настоящее время на рынке летучих наркотиков быстрыми^{темпами} появляются дополнительные синтетические опиоиды, не связанные с фентанилом5.

В связи с огромным объемом фентанила и связанных с ним аналогов, циркулирующих на рынке наркотиков, DEA внедрило программу профилирования сигнатур фентанила под названием «Операция «Дракон смерти», чтобы отслеживать методологию, используемую для синтеза этих соединений, в надежде связать изъятия наркотиков с^{их происхождением}. В 2018 году 94% изъятий наркотиков были идентифицированы как синтезированные методом Янссена, а остальные 6% – по методу^{Зигфрида 6}. Основное различие между этими двумя методами заключается в присутствии аналога фентанила, бензилфентанила, обнаруженного как примесь в методе Янссена, в то время как присутствие деспропионилфентанила (4-ANPP), метаболита/предшественника фентанила, является примесью, обнаруженной при синтезе методом Зигфрида⁷.

Использование газовой и жидкостной хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (ГХ-МС и ЖХ-МС соответственно) для целенаправленного скрининга и количественного определения синтетических опиоидов регулярно внедряется в токсикологических лабораториях. ГХ-МС считается золотым стандартом для обнаружения злоупотребления наркотиками в биологических образцах. Доступ к общедоступным масс-спектральным библиотекам⁸ и приборам, продаваемым как системы plug and play⁹ – вот некоторые причины, по которым ГХ-МС остается неотъемлемой частью лабораторий как для всестороннего скрининга, так и для целенаправленной количественной оценки ^9,10. Тем не менее, современные методы количественного определения ГХ-МС в литературе, как правило, имеют ограниченный спектр аналитов¹¹ и быстро устаревают и не применимы к текущим клиническим случаям. Что еще более важно, пределы обнаружения и количественной оценки несопоставимы с методами ЖХ-МС (< 1 нг/мл)¹², что увеличивает вероятность ложноотрицательных результатов. В одном из таких сравнений между ГХ-МС и ЛХ-МС, в котором рассматривались посмертные образцы, было отмечено, что из 134 положительно выявленных случаев карфентанила, одного из самых мощных синтетических опиоидов на сегодняшний день, 104 из этих случаев дали отрицательный результат на карфентанил с использованием ГХ-МС¹³. В лабораториях по анализу наркотиков ГХ-МС чаще используется и может быть изменен для синтетических опиоидов из-за высокой концентрации анализируемых образцов. Тем не менее, ГХ-МС по-прежнему используется в сочетании с дополнительными методами, такими как инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК-Фурье) и сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) для подтверждения этих^{соединений.} Применение ГХ-МС для анализа биологических образцов в судебной токсикологии требует методов пробоподготовки, включающих экстракцию этих соединений с использованием либо жидкостно-жидкостной экстракции (LLE), либо твердофазной экстракции (SPE)¹⁵. LLE может проводиться с различными растворителями, однако в высокопроизводительной лаборатории LLE может быть нерентабельным или несвоевременным. LLE потребляет большое количество растворителей, а также объем образца, в то время как альтернатива, SPE, может быть автоматизирована и требует минимального объема образца¹⁶. В недавнем исследовании ГХ-МС сообщалось о разделении 20 различных изомерных аналогов фентанила с использованием трех отдельных тепловых^{программ} ГХ. Несмотря на то, что исходное разделение между изомерами было успешным, применимость этого метода к соответствующим судебно-медицинским исследованиям и рабочим процессам ограничена.

ЖХ-МС завоевал популярность в криминалистической экспертизе, особенно из-за ограничений ГХ-МС, когда речь идет о нелетучих и термочувствительных соединениях^18,19. Скрининг ЖХ-МС с использованием тройных квадруполей (QQQ) и приборов для ионных ловушек оказался успешным в обнаружении синтетических опиоидов в низких концентрациях (<1 нг/мл)12,20,21,22,23,24. Как правило, эти методы ЖХ-МС используются в качестве вторичных методов подтверждения в дополнение к результатам иммуноферментного анализа и/или ГХ-МС. В 2017 году Шофф и др. из токсикологической лаборатории отдела судебно-медицинской экспертизы округа Майами-Дейд (MDME) разработали комплексный метод скрининга 44 соединений, связанных с опиоидами, с использованием жидкостной хроматографии сверхвысокого давления (УВЭЖХ)-ионной ловушки-MS^{n 13}. Подобно методам таргетированной MRM, этот метод ионных ловушек использовал запланированный список предшественников (SPL), содержащий время удержания, целевые ионы-предшественники, а также первичные дочерние ионы для спектральной фрагментации MS³, когда это возможно. Что отличает этот метод скрининга от методов, разработанных на тройных квадруполях и линейных квадрупольных ионных ловушках, так это дополнительная детализация, представленная в спектральных данных. Чего этот метод скрининга не может обеспечить, так это количественного анализа, который редко разрабатывается на приборах для ионных ловушек, а также идентификации^{неизвестных13}. Методы LC-QQQ для синтетических опиоидов могут одновременно проводить скрининг и количественную оценку заранее определенного списка мишеней. Использование переходов множественных реакций (MRM) для идентификации и количественной оценки соединений является надежным методом сбора данных и наиболее распространенным методом, используемым в литературе для обнаружения синтетических опиоидов^12,20. Представленные линейные диапазоны для количественной оценки массива синтетических опиоидов варьируются от 0,01 до 100 нг/мл, при этом более мощные синтетические опиоиды, такие как карфентанил, обнаруживаются в диапазоне суб-нг/мл¹ 1,24,25,26,27.

Разделение изомерных синтетических опиоидов рассматривалось в методах ЖХ-МС. Одним из таких методов было выделено 174 изомерных аналогов фентанила в течение 16 минут с помощью бифенильной колонки²⁸. Кроме того, колебания LC-зависимых параметров, таких как эффективность колонки, рН подвижной фазы и изменения давления, создают сдвиги во времени удержания, которые должны учитываться в целевых анализах с постоянным мониторингом и большими окнами сбора (>0,4 мин), что может привести к потенциальному перекрытию этих однажды разрешенных изомеров. Были изучены дополнительные хроматографические методы разделения изомеров, в том числе использование двумерной жидкостной хроматографии (2D-LC)²⁹; И хотя этот метод действительно способен обеспечить ортогональное разделение соединений, недостатки перевешивают преимущества, включая чрезмерное время выполнения, стоимость, сложность в разработке метода и полезность по сравнению с^{альтернативным} разделением.

Масс-спектрометрия высокого разрешения (HRMS) становится все более надежной для идентификации синтетических опиоидов. Несколько компаний, производящих приборы^, вывели на рынок целевые методы, разработанные с целью идентификации широкого спектра синтетических опиоидов в сложных биологических матрицах 19,28,31. Эти методы, в отличие от рассмотренных ранее, могут хранить аналитические данные для ретроактивного анализа. Таким образом, образцы, которые ранее были проанализированы с неопределенными результатами, могут быть позже пересмотрены для обнаружения вновь идентифицированных соединений. Что отличает HRMS от QQQ, так это точная массовая идентификация. В то время как оба метода МС могут точно количественно определять при низких концентрациях, было доказано, что HRMS более эффективен для первоначального скрининга и обнаружения неизвестных соединений 32,33,34. HRMS, в частности, с помощью времяпролетных (TOF) анализаторов МС, находится на переднем крае открытия NPS, позволяя лабораториям судебной экспертизы предоставлять оперативные данные о новых соединениях как правоохранительным органам, так и научному сообществу для масштабирования распространения некоторых из этих^{соединений, одновременно} повышая осведомленность и просвещение. Использование TOF для выявления наркотиков, вызывающих злоупотребление, стало чрезвычайно всеобъемлющим, с методами, содержащими более 600 соединений, разделенных в течение 10-минутной хроматографической программы. В предыдущих исследованиях сообщалось о преимуществах спектроскопии подвижности захваченных ионов (TIMS) в сочетании с TOF для обнаружения и разделения изомерных опиоидов³⁵.

Используя преимущества ортогональности между жидкостной хроматографией, спектрометрией подвижности захваченных ионов и масс-спектрометрией, представленный метод обеспечивает широкую характеристику аналогов фентанила на основе времени удержания, изотопной структуры, подвижности и картины фрагментации.

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Храните набор для скрининга аналогов фентанила при температуре -20 °C после их получения. Суспендируйте каждый образец до конечной концентрации 400 мкг/мл путем добавления 500 мкл чистого метанола класса LC/MS.
2. Перемешивайте с помощью пластинчатого миксера или вортексера при 400 об/мин в течение 1 ч или вихревом на средней скорости в течение 15 мин. После ресуспензии хранить флаконы при температуре -20 °C.
3. Разбавьте каждый стандарт до конечной концентрации 1 нг/мл с использованием чистого метанола класса LC/MS.
4. Сгруппируйте стандарты в группы таким образом, чтобы каждая группа не содержала изомерных стандартов. В дополнительной таблице 1 приведена разбивка по 14 группам стандартов фентанила.

2. Подготовка мобильных фаз ВЭЖХ

1. Готовьте подвижную фазу А (МПА) с использованием формиата аммония 5 мМ/л (NH₄HCO₂) в Н₂О с 0,05% муравьиной кислоты (85%).
   1. Отвесьте 0,078 г NH₄HCO₂, налейте в мерную колбу объемом 250 мл и заполните водой примерно до 2/3^дозы. Перемешайте, чтобы хорошо перемешать.
   2. После полного растворения добавьте 0,125 мл муравьиной кислоты (85%). Заливаем водой до линии наполнения (250 мл) и перемешиваем.
2. Готовьте подвижную фазу B (MPB) с использованием 0,05% муравьиной кислоты в смеси метанола ацетонитрила 1:1.
   1. Налейте 125 мл ацетонитрила в мерную колбу и добавляйте метанол до тех пор, пока он не достигнет линии заполнения.
   2. Перемешайте, чтобы хорошо перемешать. Добавьте в колбу 0,125 мл 0,05% муравьиной кислоты и перемешайте до гомогенизации.

3. Разработка метода ВЭЖХ

1. Откройте программное обеспечение LC на главном экране. В таблице образцов, расположенной в центре окна, создайте новый протокол.
   1. Аннотируйте колонку флакона с указанием местоположения образца. Добавьте примечания к столбцу идентификатора образца с помощью формата YYYYMMDD_NAME (репрезентативный дескриптор). Аннотируйте столбец с объемом с желаемым объемом впрыска (15 μл).
2. Добавьте примечания к столбцу пути к данным, указав местоположение, в котором будут сохранены данные.
3. Ввод метода ВЭЖХ
   1. Выберите « Создать » на панели в таблице образцов, расположенной в центре экрана. В разделе «Метод разделения» выберите стрелку раскрывающегося списка и нажмите «Новый метод » во всплывающем окне.
   2. В новом окне появится надпись «Метод разделения», здесь можно отредактировать время сбора данных или метод системы управления прибором (ICF).
   3. Дважды нажмите кнопку Edit Method для системы ICF, чтобы открыть всплывающее окно для редактирования двоичного градиента, как показано на рисунке 1.
   4. На вкладке двоичного градиента визуальное представление градиента находится слева, а разбивка градиента — справа, задайте временные метки, скорость потока и концентрации MPA и MPB.
   5. Убедитесь, что время остановки установлено на 18 минут, расход — на 0,400 мл/мин, а предел давления — минимум и максимум на 0 фунтов на квадратный дюйм и 6000 фунтов на квадратный дюйм.
   6. Установите концентрации меток времени следующим образом:
      На 0,00 мин установите концентрацию B на 20,0.
      Через 1.50 мин установите концентрацию B на 25.0.
      Через 3.00 мин установите концентрацию B на 27.0.
      В 6.00 мин установите концентрацию B на 27.0.
      Через 6.50 мин установите концентрацию B на 30.0.
      В 7.00 мин установите концентрацию B на 95.0.
      В 16.00 мин установите концентрацию В на 95.0.
      В 16.50 мин установите концентрацию B на 20.0.

4. Инициализация ВЭЖХ

1. В секцию колонны ВЭЖХ вставьте колонну LC (монолитная колонна C18 HPLC 100 мм x 4,6 мм) и ограждения колонны (защитная колонна 5 мм x 4,6 мм). Обратите внимание на минимальное и максимальное давление в колонне.
2. Запустите образец пустого образца (тот же буферный раствор), чтобы проверить наличие утечек и создать базовый уровень. Ищите утечки. Утечки можно было наблюдать по колебаниям давления в колонне. Если есть утечки, определите, откуда они могут исходить, и затяните соединения.
3. Запустите образец заготовки (то же буферное решение) с использованием нужной программы LC для предварительного кондиционирования столбца.

5. Разработка метода timsTOF MS/MS

1. Откройте приложение timsControl. В левой части окна находятся настройки MS и TIMS.
   1. В настройках MS установите начало и конец сканирования на 50 м/з и 1800 м/з соответственно. Выберите положительную моду для полярности ионов и выберите параллельную накопление-последовательную фрагментацию для режима сканирования.
   2. В настройках TIMS установите режим на пользовательский, начало 1/K0 на 0,40 Vs/cm², окончание 1/K0 на 1,85 Vs/cm², время нарастания установлено на 150,0 мс, а усреднение MS установлено на 1.
2. В нижней части выбора вкладок в разделе Источник выполните следующие изменения в двух полях настроек.
   1. В источнике установите смещение торцевой пластины на 500 В, капилляра на 4500 В, небулайзера на 3,0 бар, сухой газ на 10,0 л/мин и температуру сухого на 200 °C.
   2. В настройках шприцевого насоса убедитесь, что шприц имеет значение Hamilton 1 мл, активен включен и скорость потока установлена на 80,0 мкл/ч.
3. На вкладке Настройка выполните следующие изменения на вкладках параметров Общие, Обработка и TIMS.
   1. На вкладке «Общие настройки» настройте следующие разделы: передача, ячейка столкновения, квадруполь, фокус перед TOF и обнаружение.
      1. В настройках передачи установите отклонение 1 дельта на 70,0 В, воронку 1 ВЧ на 341,0 В между пиками, энергию CID на 0,0 эВ, воронку 2 РЧ на 300,0 В между пиками, многополюсную РЧ на 300,0 В между пиками.
      2. В настройках ячейки коллизии убедитесь, что энергия коллизии установлена на 6,0 эВ, а РЧ коллизии — на 1200,0 В между пиками.
      3. При настройках квадруполя убедитесь, что энергия ионов установлена на 6,0 эВ, а малая масса — на 250,00 м/з.
      4. В настройках предварительного напряжения фокусировки установите время передачи на 75,0 мкс, а предимпульсное хранение на 5,0 мкс.
   2. На вкладке настроек обработки настройте следующие разделы: обнаружение пиков масс-спектров и обнаружение пиков мобильности.
      1. В настройках пика масс-спектров снимите флажок «Сумма интенсивностей (площадь)» и установите абсолютный порог равным 667.
   3. На вкладке TIMS настройте следующие разделы: смещения, контроль изменения ионов и дополнительные параметры.
      1. При настройке смещений установите Δt1 на -20,0 В, Δt2 на -100,0 В, Δt3 на 40,0 В, Δt4 на 80,0 В, Δt5 на 0,0 В, Δt6 на 120,0, а ячейку коллизии в 250,0 В.
      2. В настройках управления ионным зарядом установите флажок, чтобы включить и установить целевую интенсивность на 5,00 м.
      3. В расширенных параметрах включите накопление блокировки до диапазона мобильности.
4. На вкладке MS/MS установите режим сканирования в положение параллельное накопление-последовательная фрагментация и настройте следующие разделы: ионы прекурсоров, планирование, активное исключение, настройки энергии столкновений, настройки ширины изоляции и степпинг TIMS.
   1. В разделе Ионы-предшественники установите количество параллельных последовательных нарастаний фрагментации равным 8, минимум заряда равным 1 и максимальный заряд равным 5.
   2. В разделе Параметры планирования включите повторы предшественников. В разделе «Активное исключение» установите флажок, чтобы включить, и установите сброс на 0,40 минуты после этого.
   3. Не регулируйте настройки энергии столкновения и ширину изоляции. Нажмите на пошаговое поле TIMS , чтобы включить.

6. Мобильность и калибровка гирь

1. Выполняйте калибровку как для m/z, так и для мобильных областей. В настройках калибровки m/z выберите один из предварительно загруженных профилей настроечного микса в списке ссылок, который отображается в раскрывающемся меню.
2. Для калибровки загрузите шприц для ТОФ раствором для настройки смеси. В правой части окна используйте настройки под названием «Режим калибровки» для различных типов калибровки, которые должны быть установлены для достижения наивысшего балла.
3. Убедитесь, что оценка максимально близка к 100%. Переключайтесь между линейным, квадратичным и расширенным квадратичным для достижения наилучшего результата.
4. Выполните калибровку для мобильности в соответствии с шагами 6.1-6.3, используемыми для калибровки м/з.
5. После калибровки сохраните метод MS, выбрав вкладку «Метод » на верхней панели. В выпадающем меню выберите «Сохранить как », чтобы создать новый файл метода MS.

7. Создание метода параллельного накопления-последовательной фрагментации независимого сбора данных (dia)

1. После того как набор данных был собран с помощью параллельного накопления-последовательной фрагментации с помощью Data Dependent Acquisition (dda), запустите эксперименты в dia. Откройте программное приложение для ионной мобильности и загрузите метод DDA, сохраненный на шаге 6.5.
2. Оставьте все настройки прежними для настройки MS, измените ее с параллельного накопления-последовательной фрагментации на диапараллельное накопление-последовательная фрагментация.
3. В нижней части панели выберите вкладку MSMS , а затем нажмите на Window Editor , чтобы открыть всплывающее окно dia, показанное на рисунке 2.
4. Загрузите ранее сохраненный набор данных dda (файл .m) с помощью кнопки «Открыть анализ», расположенной в верхней части всплывающего окна.
5. В левом нижнем углу отображается тепловая карта с окнами с многоугольником окон, идущим по диагонали через график. Щелкните и перетащите, чтобы изменить размер полигона так, чтобы он соответствовал данным на тепловой карте (углы можно выбрать двойным щелчком по боковым линиям, появится точка, которую можно перетаскивать и изменять размер).
6. Справа от окон находятся настройки окна. Установите ширину массы (50 - это переход) и установите горизонтальное перекрытие, оба в Da.
7. Задайте количество окон мобильности в зависимости от ширины массы и вертикального перекрытия.
8. Нажмите «Рассчитать окна» в правом нижнем углу всплывающего окна, чтобы увидеть окна, отображаемые с новыми настройками. Когда это будет подходяще, нажмите Apply dia-PASEF Windows to Method. Это закроет всплывающее окно, вернув его на главный экран.

8. Обработка данных TOF ионной подвижности ВЭЖХ

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных. В левом верхнем углу перейдите на вкладку «Файл » и выберите «Открыть » в раскрывающемся списке. В окне «Новые файлы» выберите нужные файлы и нажмите «Открыть».
2. Проверьте калибровку. Щелкните правой кнопкой мыши имя файла под окном анализа и выберите «Свойства». Появится окно с надписью «Файл» name_analysis свойствами. Выберите Состояние калибровки.
3. В раскрывающемся списке выберите Калибровка прибора для масс-спектрометра. Убедитесь, что погрешность не превышает 1 г/мл. Выберите Initial Mobility Calibration (Первоначальная калибровка подвижности ) и убедитесь, что погрешность не превышает 1 г/мл.
4. Подготовьте хроматограмму в программном обеспечении для анализа данных, как описано ниже.
   1. Щелкните правой кнопкой мыши по Хроматограмме под именем файла, выберите Редактировать хроматограмму. В поле введите текст и выберите «Хроматограмма экстрагированных ионов».
   2. В разделе фильтр выберите Все MS и в режиме сканирования выберите Все. Это необходимо для просмотра пиков интересующей молекулы, а не только ее фрагментов.
   3. Ниже найдите два варианта фильтра для выбора молекул: массы или формула, выделенные синим цветом.
   4. Если для извлечения иона используются массы, вставьте теоретическую m/z интересующей молекулы. Для этого случая выберите (масса для репрезентативного результата) m/z.
   5. Если вы используете формулу для извлечения иона, вставьте формулу для молекулы, а также формы ионов, представляющие интерес для хроматограммы. В этом случае выберите протонированный ион, [M+H]⁺.
   6. Установите полярность в положительный режим.
5. Масс-спектр
   1. Щелкните правой кнопкой мыши на базовой линии вершины соединения и перетащите курсор к другому краю вершины. Это создаст массовый спектр фрагментов в течение этого времени хранения.
6. Генерация мобилограммы
   1. Щелкните правой кнопкой мыши левую вкладку под названием «Мобилограмма» и выберите «Редактировать мобилограмму». Появится окно под названием «Редактирование трасс мобилограммы». Выполните шаги 8.4.2-8.4.7 для редактирования хроматограммы.
   2. Во входных параметрах времени хранения добавьте диапазон времени хранения пика интереса.
   3. После выбора параметров нажмите кнопку Добавить , а затем нажмите клавишу ОК в правом верхнем углу окна редактирования трасс мобилограммы.
   4. Через небольшой промежуток времени программное обеспечение обработает нужные выборки и выведет хроматограмму. Повторите шаги 8.6.1-8.6.3 для всех ионов в смеси.
   5. Генерация спектров соединений
      1. В нижней части окна просмотра спектра выберите «Профиль MS » и «Фрагмент MS». Это позволит включить ионы из полного сканирования и PASEF.
      2. В окне просмотра спектра щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Копировать составные спектры». С помощью спектральных данных, которые отображаются справа, найдите дополнительную информацию о соединении, такую как разрешение, разрешающая способность, интенсивность и отношение сигнал/шум (S/N).
   6. Обработка данных
      1. Чтобы обработать данные, вручную интегрируйте хроматограмму и пики подвижности, чтобы получить важную информацию об интересующей молекуле.
      2. Щелкните правой кнопкой мыши Найти и выберите Интегрировать только хроматограмму или мобилограмму. Щелкните левой кнопкой мыши и перетащите, чтобы выделить нужную вершину. На дисплее будет отображаться информация, которая включает в себя время удержания, площадь, S/N и мобильность.

Результаты

Набор для скрининга аналогов фентанила из 250 стандартов аналогов был разделен на 14 групп: 12 групп по 17 аналогов и 2 группы по 16 аналогов, чтобы избежать м/з помех. Кроме того, каждый аналог характеризуется m/z, временем удержания (RT), подвижностью (K) и характером фрагментации MS/MS.

Примеры изомерного разделения показаны на рисунках 3 и 4 для химической формулы C₂₂H₂₈N₂O₂ и C₂₁H₂₈N₂OS соответственно.

Набор для скрининга аналогов фентанила содержит четыре изомера с химической формулой C₂₂H₂₈N₂O₂ (см. рисунок 3). На рисунке 4 показана хроматограмма экстрагированных ионов [M+H]⁺ , мобилограммы, изотопная картина и картина фрагментации MS/MS. Метоксиацетилфентанил и фентанилкарбамат хорошо отделяются в доменах LC и подвижности от пара-метоксиацетилфентанила и B-гидроксилфентанила. Тем не менее, четкое разделение между пара-метоксиацетилфентанилом и В-гидроксилфентанилом достигается за счет их фрагментации.

Набор для скрининга аналогов фентанила содержит три изомера с химической формулой C₂₁H₂₈N₂OS. На рисунке 4 показана хроматограмма экстрагированных ионов [M+H]⁺ , мобилограммы, изотопная картина и картина фрагментации MS/MS. А-метилтиофентанил и (±)-транс-3-метилтиофентанил разделяются в домене LC, но не в домене подвижности. Кроме того, (±)-транс-3-метилтиофентанил и (±)-цис-3-метилтиофентанил разделяются в домене подвижности, а не в домене LC. Это показывает взаимодополняемость ЛК и разделения подвижности, улучшая идентификацию изомерных соединений за счет ортогональности доменов. На рисунке 4D обобщен этот результат, полученный за счет LC и мобильности.

Рисунок 1: Градиентный пандус в программном обеспечении. Метод системного диалога ICF градиентирует временные точки, применяемые при разделении, в зависимости от процента концентрации В. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: настройки окна dia-PASEF. При использовании методов диа-PASEF MS настройки MS/MS являются уникальными. На графике слева показаны многоугольники окон, скорректированные на основе данных, записанных в методе dda-PASEF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Типичная хроматограмма экстрагированных ионов, экстрагированная мобилограмма и усиленная проекция МС для изомерных опиоидов. (A) Структуры метоксиацетилфентанила, параметоксиацетилфентанила, β-гидроксифентанила, фентанилкарбамата и соответствующее (B) типичное время удержания, (C) типичная подвижность, (D) изомерный сигнал, (E) крупные фрагменты и (F) представление фрагментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Типичные экстрагированные ионные хроматограммы и экстрагированные мобилограммы для изомерных опиоидов. (A) Структуры α-метилтиофенанила, (±)-транс-3-метилтиофентанила и (±)-цис-3-метилтиофенанила. Для соответствующих изомеров (В) типичное время ретенции, (В) типичная подвижность, (D) ортогональность между временем ретенции и подвижностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Группы смесей. В этой таблице указано, какие опиоиды есть в каждой из 14 смесей, созданных для этой процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Аналитическое разделение биологических образцов с высоким содержанием изомерных веществ может быть аналитически сложным. В данной работе описанный метод направлен на характеристику 29 наборов изомеров, в общей сложности 185 аналогов из 250 стандартных наборов опиоидов. Во время подготовки тестовой группы важно убедиться в том, что нет двух аналогов с м/з, которые невозможно экспериментально различить. В описанных здесь данных используются стандарты не из матрицы, основанной на человеке, если этот метод будет использоваться в полевом эксперименте; Для обеспечения применимости метода необходимы дополнительные испытания с использованием интересующей матрицы. Матрица может привести к тому, что аналиты ионизируются иначе, чем в эксперименте без матрицы, что делает необходимым определение того, какие преобладающие формы ионов будут наблюдаться. При анализе идентификация основана на изотопных структурах наиболее распространенных форм (например, [M+H]⁺¹ и [M+Na]⁺¹).

Выбор программы LC имеет решающее значение в тех случаях, когда изомеры не разделены в области подвижности. Уменьшение наклона градиента может повысить специфичность метода за счет увеличения разницы между хроматографическими пиками.

При анализе данных важно, чтобы при определении времени удержания и мобильности учитывались нерелевантные сигналы. Преимущества HRMS позволяют использовать узкие m/z окна (типичное массовое разрешение ~ 50 000) с дополнительной фильтрацией подвижности, тем самым снижая химический шум.

Описанный здесь метод предоставляет справочную библиотеку для скрининга аналогов фентанила из неизвестного образца. В качестве квалификаторов при обработке данных и присвоении неизвестных данных используются сообщаемые паттерны фрагментации RT, K, изотопы и MS. По сравнению с традиционным анализом MRM LC-QQQ, хотя аналогичные LOD достижимы 13,19,27, уникальным преимуществом является скрининг альтернативных опиоидов, не включенных в базу данных, созданную с использованием набора FID. Каждый новый опиоид потребует анализа с использованием синтетического стандарта для его окончательной валидации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Формиат аммония для ВЭЖХ	Fluka	17843-50G
Eppendorf  Микроцентрифуга с защелкивающейся крышкой Safe-Lock Tubes	Fisher	05-402-25
ESI-L Смесь для настройки низких концентраций	Agilent	G1969-85000
Набор для аналогового скрининга фентанила (FAS)	Cayman Chemical	9003237, 9003286, 9003380, 9003381	набор из 250 снтических опиоидов, 210 аналогов фентанила, разбитых на один набор и эмерджентные варианты панелей 1-4
Муравьиная кислота Optima LC/MS	Fisher	A117-50
Оникс защитная колонка (5 x 4,6 мм)	Phenomenex	CHO-7649	защитная колонна для колонн C18
Onyx монолитная колонна C18 HPLC (100 x 4,6 мм)	Phenomenex	CHO-7643	обратная фаза C18 LC колонка
Optima марки ацетонитрила	Fisher	A996-4
Метанол класса Optima Fisher		A454-4
Класс Optima вода	Fisher	W7-4
Пипетка	Fisher	05-719-510	набор из 1-10 &; L, 10-100 &; L, и 100-1000 & микро; L Наконечники
пипеток 10&микро; L	Fisher	94060100
Наконечники для пипеток 1000&микро; L	Fisher	94056710
Наконечники для пипеток 200&микро; L	Fisher	94060310
Пластинчатый миксер	IKA	MS 3 D S1	IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE сверхбыстрый жидкостный хроматограф	Shimadzu, Япония		оснащен DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF Pro	Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA		timsTOF прибор с PASEF