Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модифицированный матричный гель-пробка in vivo для исследований ангиогенеза

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65567

⸱

30 июня 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Представленный здесь метод позволяет оценить влияние реагентов на ангиогенез или проницаемость сосудов in vivo без окрашивания. Метод использует инъекцию декстрана-FITC через хвостовую вену для визуализации неососудов или сосудистой утечки.

Аннотация

Было разработано несколько моделей для исследования ангиогенеза in vivo. Однако большинство из этих моделей сложны и дороги, требуют специализированного оборудования или сложны в выполнении для последующего количественного анализа. Здесь мы представляем модифицированный матричный гель-пробка для оценки ангиогенеза in vivo. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии или отсутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей-реципиентов. Через 7 дней через хвостовую вену вводят фосфатный солевой раствор, содержащий декстран-ФИТК, и циркулируют в сосудах в течение 30 мин. Матричные гелевые пробки собираются и помещаются в тканевый гель для встраивания, затем нарезаются срезы по 12 мкм для обнаружения флуоресценции без окрашивания. В этом анализе декстран-FITC с высокой молекулярной массой (~150 000 Да) может быть использован для обозначения функциональных сосудов для определения их длины, в то время как декстран-ФИТК с низкой молекулярной массой (~4 400 Да) может быть использован для обозначения проницаемости неососудов. В заключение можно сказать, что данный протокол может обеспечить надежный и удобный метод количественного изучения ангиогенеза in vivo.

Введение

Ангиогенез, процесс образования новых сосудов из ранее существовавших сосудов, играет важнейшую роль во многих физиологических и патологических процессах, таких как эмбриональное развитие, заживление ран, атеросклероз, развитие опухолей и т.д.1,2,3,4,5. Этот динамический процесс включает в себя несколько этапов, включая деградацию матрикса, пролиферацию сосудистых клеток, миграцию и самоорганизацию для формирования трубчатых структур и стабилизацию новых сосудов6. Было продемонстрировано, что стимулирование ангиогенеза имеет решающее значение при лечении инфаркта миокарда, инсульта и других видов ишемическихзаболеваний7, в то время как ингибирование ангиогенеза считается перспективной стратегией в лечениирака8 и ревматоидных заболеваний9. Ангиогенез считается организующим принципом для открытия лекарств10. Таким образом, создание надежного и удобного метода оценки степени ангиогенеза имеет решающее значение для механических исследований или разработки лекарств при ангиогенез-зависимых заболеваниях.

Для оценки ангиогенеза было разработано несколько моделей in vitro и in vivo 11. Среди них двумерные (2-D) модели, такие как матричная гелевая трубка12, не могут формировать функциональные трубчатые структуры. Животные модели, такие как модель ишемии задних конечностей 13,14, могут воспроизводить процесс ангиогенеза, но сложны и требуют лазерной системы визуализации кровотока. 3D-модели морфогенеза сосудов, такие как матричный гель-пробка, предоставляют простую платформу, которая может имитировать процесс ангиогенеза in vivo15, но для обнаружения ангиогенеза требуется иммуногистохимия или иммунофлуоресцентное окрашивание 16,17,18, которые являются вариабельными и плохо визуализируются.

Здесь мы опишем протокол модифицированного анализа матричной гелевой пробки, при котором сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем и подкожно вводили в заднюю часть мышей для формирования пробки. В пробке сосудистые клетки должны разрушать матрикс, пролиферировать, мигрировать и самоорганизовываться, чтобы, наконец, сформировать функциональные сосуды с током крови во внутренней среде. После этого флуоресцентно меченый декстран вводится через хвостовую вену, чтобы протекать через пробку, и метка визуализируется, чтобы указать на неососуды. Содержание ангиогенеза можно количественно оценить по длине сосудов. Этот метод может формировать функциональные сосуды, которые не могут быть получены в 2-D моделях ангиогенеза12, и не требует сложного процесса окрашивания, как в обычном матричном гелевом пробке11. Он также не требует дорогостоящих специальных инструментов, таких как лазерная система визуализации кровотока при ишемии задних конечностей модели 13,14,19. Этот метод является универсальным, недорогим, поддающимся количественной оценке и простым в исполнении, и может быть использован для определения про- или антиангиогенной способности лекарств или может быть использован в механических исследованиях, участвующих в ангиогенезе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Всепроцедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского университета Вэньчжоу (XMSQ2021-0057, 19 июля 2021 г.). Все реактивы и расходные материалы перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление питательной среды

  1. 10-кратная питательная среда M199: Растворите порошок M199 до 10-кратной концентрации с 90 мл деионизированной воды и добавьте 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), затем пропустите через фильтр 0,22 мкм. Хранить средство при температуре 4 °C до 2 месяцев.
  2. Полная эндотелиальная питательная среда: добавьте 50 мл FBS, 5 мл пенициллина/стрептомицина и 5 мл добавки для роста эндотелиальных клеток к 460 мл эндотелиальной клеточной среды (ECM). Хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.

2. Подготовка сосудистых клеток

  1. Культивирование 1 x 105 сосудистых клеток (первичные культивируемые эндотелиальные клетки-предшественники14, эндотелиальные клетки или линии эндотелиальных клеток) с 8 мл полной эндотелиальной питательной среды в 100 мм тканевой культуральной чашке при 37 °C и слиянии 5% COот 2 до 70%.
  2. Удалите питательную среду и промойте чашку 2 раза 1 фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить неприкрепленные клетки и мусор. Удалить PBS и добавить 3 мл 0,25% трипсина, содержащего 2,21 мМ ЭДТА, и инкубировать при 37 °C в течение 1 мин.
  3. Нейтрализуйте трипсин 7 мл полной эндотелиальной питательной среды и осторожно смойте клетки с чашки для культивирования. Подтвердите отслоение клеток под световым микроскопом (40-кратное увеличение).
  4. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при концентрации 400 x g в течение 10 мин. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки с помощью 5 мл полной эндотелиальной питательной среды.
  5. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и переместите суспензию, содержащую 2 x 10,6 клеток, в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Каждая заглушка содержит ячейки 1,5 х 106 , дополнительные 25% ячеек используются на случай отходов. Каждая группа включает в себя не менее 3 заглушек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После испытаний было обнаружено, что клетки 1,5 x 10,6 в 300 мкл матричного геля приводят к правильному развитию ангиогенеза, и поэтому были выбраны для эксперимента.
  6. Центрифужную клеточную суспензию при 400 х г в течение 5 мин до гранулированных клеток, а затем удаляют надосадочную жидкость.

3. Приготовление матричного геля

  1. Предварительно охладите стерильные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие клеточные гранулы, на водяной бане с температурой 4 °C. Предварительно охладите инсулиновые шприцы 30 г по 1 мл в холодильнике с температурой 4 °C.
  2. Полностью разморозьте матричный гель на водяной бане с температурой 4 °C. Не смешивайте и не перемешивайте. Предварительно охладите 10x M199 и исследуйте реагент/препарат на водяной бане с температурой 4 °C.
  3. Смешайте предварительно охлажденный матричный гель с 10х М199, содержащим 10% ФБС, и реагентом, подлежащим испытанию, в объемном соотношении 8,8:1:0,2, чтобы получить матричный гель и смесь М199, содержащую 1% ФБС и реагент.
  4. Ресуспендируйте клетки с 400 мкл матричной гелевой смеси, аккуратно перемешайте, чтобы избежать образования пузырьков. Держите трубку на льду до тех пор, пока мыши не будут подготовлены к инъекции. Постоянно держите матричную гелевую смесь на льду, чтобы избежать коагуляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для формирования гелевой пробки использовали 300 мкл матричной гелевой смеси, содержащей ячейки 1,5 x 106 . Приготовьте 25% дополнительного геля в соответствии с 25% дополнительными клетками на шаге 2.

4. Подготовка мыши

  1. Обезболить 6-8-недельного самца Nu/Nu мышей (18-25 г) в камере наркозного аппарата животного изофлураном (3% изофлурана в 100% кислороде при скорости потока 1 л/мин). После успешного обезболивания, подтвержденного отсутствием выпрямляющего рефлекса и щипкового рефлекса, мышь выводят из камеры, выводят мышь из камеры и надевают на мышь наркозную маску и изменяют концентрацию изофлурана до 1,5% в 100% кислороде при расходе 1 л/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте животному тепловую поддержку с помощью грелки на протяжении всей процедуры.
  2. Наносите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. Заклейте конечности мышей на операционной доске в положении лежа.

5. Впрыск матричной гелевой смеси

  1. Загрузить 300 мкл матричной гелевой смеси в инсулиновый шприц объемом 1 мл иглой 30G. Избегайте образования пузырьков. Быстро загрузите матричный гель (в течение 2 минут), чтобы избежать застывания в течение этого времени. Немедленно поместите инсулиновый шприц, наполненный матричным гелем, на лед.
  2. Очистите кожу на спине мышей с помощью 75% спиртовых салфеток. Подкожно вводят 300 мкл матричной гелевой смеси в одну сторону спины мышей.
  3. Аккуратно извлеките иглу из места инъекции, чтобы не допустить утечки матричной гелевой смеси. Проверьте, нет ли небольшой горбинки в месте инъекции (рисунок 1).
  4. Поместите мышь на грелку на 2 минуты, чтобы матричная гелевая смесь коагулировала и образовала пробку.
  5. Повторите шаги 5.2. до 5.4. , чтобы создать заглушку на другой стороне задней панели мыши. Отметьте края горбов с помощью маркера.
  6. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не придет в сознание настолько, чтобы поддерживать положение грудины. Поместите мышь в отдельную клетку до полного выздоровления. Поместите мышей в лабораторию для экспериментальных животных SPF-класса при температуре 22 ± 2 °C с 12-часовым циклом света и темноты в течение 7 дней.

6. Инъекция декстрана-ФИТК через хвостовую вену

  1. Через 7 дней введения матричного геля повторно суспендировать 0,5 мг декстрана-FITC с 500 мкл двойной дистиллированной воды (ddH2O), а затем сильно вихрнуть для получения раствора декстрана-FITC в конечной концентрации 1 мкг/мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте декстран-FITC с молекулярной массой ~150 кДа для анализа ангиогенеза и используйте декстран-FITC с молекулярной массой ~4 кДа для анализа проницаемости сосудов.
  2. Загрузите 50 мкл раствора декстрана-ФИТК в шприцы 29G.
  3. Зафиксируйте мышь на инструменте для инъекции в хвостовую вену. Очистите хвост ватным тампоном с содержанием 75% спирта и аккуратно введите 50 мкл декстрана-FITC через хвостовую вену.
  4. Прижмите место укола ватным тампоном на 1 минуту, чтобы остановить кровотечение, а затем поместите мышей обратно в клетку на 30 минут.
  5. Повторите шаги 6.3. и 6.4. до тех пор, пока все мыши не получат инъекцию декстрана-FITC.

7. Коллекция матричных гелевых пробок

  1. Внутрибрюшинно вводят 1% пентобарбитал натрия в PBS (200 мг/кг массы тела) и усыпляют мышей с помощью процедуры, одобренной IACUC.
  2. Разрежьте кожу по отмеченной границе пробки хирургическими ножницами и удалите кожу над матричной гелевой пробкой.
  3. Соберите пробку и промойте в небольшом стакане с 1x PBS, чтобы смыть лишнюю кровь (Рисунок 2A). По цвету пробки можно примерно очертить степень обилия крови и содержание неососудов (рис. 3А).

8. Подготовка закладной и секции матрицы

  1. Накройте кнопку кассеты для встраивания ткани примерно 0,5 мл геля для заделки ткани, затем немедленно поместите заглушку матричного геля на гель для встраивания ткани в желаемой ориентации, как показано на рисунке 2B. Затем вставьте заглушку с дополнительным гелем для заделки ткани.
  2. Поместите кассеты в морозильную камеру при температуре -80 °C на 12 часов для застывания.
  3. Для подготовки толстых срезов выньте затвердевший блок пробок и отрежьте срезы толщиной 12 мкм с помощью замораживающего микротома в соответствии с инструкцией, и установите на предметные стекла микроскопа.
  4. Отрежьте 5-10 секций от каждого блока вилки.

9. Количественная оценка ангиогенеза (рисунок 3)

  1. Получение флуоресцентных изображений из 5 независимых полей разреза с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа на длине волны 488 нм при 10-кратном увеличении.
  2. Откройте файл изображения с помощью программы Image J (https://imagej.en.softonic.com/) и нажмите кнопку Angiogenesis Analyze . Затем нажмите кнопку «Анализ фазового контраста HUVEC » и переключитесь на таблицу результатов статистики для сбора информации. Измерьте все 5 полученных флуоресцентных изображений для каждого участка.
  3. Проанализируйте общую длину неососудов из разных групп, чтобы статистически оценить разницу в ангиогенезе между этими группами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общая длина мастер-сегментов указывает на общую длину нео-сосудов. Реагент, увеличивающий длину неососудов, называется проангиогенным, в то время как реагент, уменьшающий длину неососудов, является антиангиогенным.

10. Количественная оценка проницаемости сосудов (рис. 4)

  1. Получение флуоресцентных изображений из 5 независимых полей разреза с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа на длине волны 488 нм при 20-кратном увеличении.
  2. Откройте файл изображения с помощью программы Image J. Нажмите кнопку Freehand Selection (Произвольное выделение ) и обведите область утечки, затем щелкните меню Analyze (Анализ) и выберите опцию Measure (Измерить ), чтобы получить информацию о области утечки. Используйте соотношение площади утечки и площади изображения для обозначения проницаемости сосудов.
  3. Проанализируйте соотношение площади утечки и площади изображения из разных групп, чтобы статистически оценить разницу в проницаемости сосудов между этими группами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 представлена блок-схема, показывающая, как приготовить смесь матричного геля, сосудистых клеток, питательной среды и реагента. Затем смесь подкожно вводили в спину мышей Nu/Nu и нагревали с помощью грелки, чтобы ускорить ее коагуляцию и, наконец, образовать гелевую пробку.

На рисунке 2А показана блок-схема для обозначения сосудов с флуоресцентным меченым декстраном. Флуоресцентный меченый декстран вводили через хвостовую ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представлен надежный и удобный метод количественной оценки ангиогенеза in vivo без окрашивания. В этом протоколе сосудистые клетки смешивали с матриксным гелем в присутствии проангиогенных или антиангиогенных реагентов, а затем подкожно вводили в спину мышей Nu/Nu с образованием гелевой пробки (рис. 1). Через 7 дней после образования гелевой пробки декстран-ФИТК вводили внутривенно и циркулировали в течение 30 мин. Гелевая пробка была собрана и помещена в ткань геля для встраивания,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY22H020005) и Национальным фондом естественных наук Китая (81873466).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Адгезионный микроскоп Предметные стеклаCITOTEST188105
Система анестезииRWDR640-S1
Счетчик клетокInvitrogenAMQAX1000
Чашка для клеточных культурCorning430167
криосликаторThermo FisherCryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDaWEIHUA BIO
Dextrans-FITC-4kDaWEIHUA BIOWH007N0705
Встраиваемые кассетыCITOTEST80203-0007
Эндотелиальная клеточная средаScienCell35809
Эндотелиальные добавки для ростаScienCell1025
Фетальная бычья сывороткаGibco10100147C
Фибробласт Фактор роста 1AtaGenix9043P-082318-A01FGF1
Флуоресцентный микроскопNikonECLIPSE Ni
ГрелкаБоруида30-50-30
Инсулиновый шприцBD300841
изофлураномRWDR510-22-10
Лаборатория  БалансSartoriusBSA124S-CW
MatrigelCorning356234Матричный гель
Medium 199 порошокGibco31100-035
МикротрубкиAxygenMCT-150-C
Оптимальная температура резки (OCT) Составнойсостав SUKURA4583Гель для наращивания тканей
Пальмитатная кислотаKunChuangKC001
Пенициллин-стрептомицин жидкийSolarbioP1400
Фосфатный буфер Физиологический растворSolarbioP1022
Хирургические инструментыRWDRWD
Инструмент для инъекций хвостовых венKEW BASISKW-XXY
Раствор трипсина-ЭДТАSolarbioT1320
Сверхнизкая температура Морозильная камераeppendorfU410
Фактор роста эндотелия сосудовCHAMOTCM058-5HPVEGF
WH007N07

Ссылки

  1. Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
  2. Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  3. De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
  4. Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
  5. Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
  6. Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
  7. Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
  8. Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
  9. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  10. Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  12. Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
  13. Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449(2022).
  14. Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821(2022).
  15. Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
  16. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  17. Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
  18. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  19. Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
  20. Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
  21. Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
  22. Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivoFITC
Модифицированный матричный гель-пробка in vivo для исследований ангиогенеза
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.