Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Широкомасштабное культивирование нематод для изучения их коллективного поведения

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65569

⸱

25 августа 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life, Hiroshima University, 2Faculty of Design, Kyushu University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь сообщается о системе изучения коллективного поведения нематод путем их культивирования в больших количествах с использованием пищевой агаровой среды для собак. Эта система позволяет исследователям размножать большое количество червей Дауэра и может быть применена к Caenorhabditis elegans и другим родственным видам.

Аннотация

Животные демонстрируют динамичное коллективное поведение, которое наблюдается в стаях птиц, косяках рыб и толпах людей. Коллективное поведение животных было исследовано как в области биологии, так и в области физики. В лаборатории исследователи использовали различных модельных животных, таких как плодовая муха и рыбка данио, в течение примерно столетия, но изучение крупномасштабного сложного коллективного поведения, организованного этими генетически управляемыми модельными животными, оставалось серьезной проблемой. В данной работе представлен протокол создания экспериментальной системы коллективного поведения у Caenorhabditis elegans. Размножающиеся черви взбираются на крышку пластины Петри и демонстрируют коллективное роение. Система также контролирует взаимодействие и поведение червей, изменяя влажность и световую стимуляцию. Эта система позволяет нам исследовать механизмы, лежащие в основе коллективного поведения, изменяя условия окружающей среды, и изучать влияние локомоции на индивидуальном уровне на коллективное поведение с использованием мутантов. Таким образом, система полезна для будущих исследований как в физике, так и в биологии.

Введение

Как неученые, так и ученые очарованы коллективным поведением животных, например, стаями птиц и косяками рыб. Коллективное поведение было проанализировано в широком спектре областей, включая физику, биологию, математику и робототехнику. В частности, физика активной материи является растущей областью исследований, которая фокусируется на системах, состоящих из самодвижущихся элементов, то есть диссипативных систем, таких как стаи птиц, косяки рыб, биопленки подвижных бактерий, цитоскелеты, состоящие из активных молекул, группы самодвижущихся коллоидов. Теория физики активной материи утверждает, что каким бы сложным ни было поведение индивидуумов, коллективные движения огромного числа живых существ управляются небольшим числом простых правил. Например, модель Вичсека, кандидат на унифицированное описание коллективного движения самодвижущихся частиц, предсказывает, что для формирования дальней упорядоченной фазы с эксцентрическими флуктуациями в 2D, как в стадахживотных1, требуется ближнедальнее взаимодействие выравнивания движущихся объектов. Быстрыми темпами развиваются нисходящие экспериментальные подходы к физике активной материи. Предыдущие эксперименты подтвердили образование дальнодействующей упорядоченной фазы у Escherichiacoli 2. В других недавних работах использовались клетки 3,4, бактерии5, подвижные коллоиды6 или движущиеся белки 7,8. Простые минимальные модели, такие как модель Вичсека, успешно описывают эти реальные явления. В отличие от этих одноклеточных экспериментальных систем, коллективное поведение животных обычно наблюдается в дикой природе, так как никто не может надеяться провести контролируемые эксперименты с 10 000 реальных птиц или рыб.

Биологи разделяют тот же интерес, что и физики: как люди взаимодействуют друг с другом и функционально ведут себя как группа. Одной из традиционных областей исследований для анализа индивидуального поведения является нейронаука, в которой механизмы, лежащие в основе поведения, изучаются на нейронном и молекулярном уровнях. К настоящему времени было разработано множество нейробиологических подходов, основанных на принципе «снизу вверх». Нисходящий подход в физике и восходящий подход в биологии могут быть реализованы с помощью модельных животных, таких как плодовая мушка, червь Caenorhabditis elegans и мышь9. Тем не менее,в лаборатории было получено мало данных о крупномасштабном коллективном поведении этих модельных животных; До сих пор сложно в лабораторных условиях получить генетически поддающихся модельных животных в больших масштабах. Поэтому в современных исследованиях коллективного поведения в биологии и физике ученым, которые обычно проводят исследования в лаборатории, было трудно изучать коллективное поведение животных.

В этом исследовании мы разработали метод крупномасштабного культивирования нематод для изучения их коллективного поведения. Эта система позволяет изменять условия окружающей среды и изучать влияние локомоции на индивидуальном уровне на коллективное поведение с использованием мутантов10. В физике активной материи параметрами математической модели можно управлять как в экспериментах, так и в симуляциях, что позволяет верифицировать эту модель для выявления унифицированных описаний. Генетика используется для понимания механизма нейронных цепей, лежащих в основе коллективного поведения11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Заготовка глистов

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте штаммы N2 Bristol12 и ZX899 дикого типа (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 для наблюдения за коллективным поведением и оптогенетических экспериментов соответственно. Сохраняйте штамм ZX899 в темноте.

  1. Поместить четырех хорошо упитанных взрослых червей на 60-миллиметровую пластину, содержащую 14 мл питательной среды нематоды (НГМ) с агаром и засеянную E. coli OP5012.
  2. Выращивайте червей F1 до голодной смерти в планшете NGM при температуре 23 °C в течение 7 дней. Урожайность червей F1 на данный момент составляет примерно 100 червей на пластину. Стадии червей состоят из смешанной популяции личинок L1.

2. Приготовление агара для собак (ДФА) средних тарелок

  1. Автоклавируйте стеклянную бутылку, содержащую 2 г порошкообразного корма для собак и 5 мл 1% агаровой среды, и охладите ее до комнатной температуры (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте можно использовать другие корма для собак от разных производителей.

3. Посев червей на пластины среды ДФА

  1. Перенесите небольшое количество (примерно 0,5 г) среды DFA в центр планшета NGM, засеянного E. coli OP50 (Рисунок 1B). Для оптогенетических экспериментов перед инокуляцией червей наливают 40 мкл 50 мкМ полностью транс-ретиналь, кофактора канального родопсина 2, на ДФА.
  2. Соберите истощенных червей с четырех пластин NGM, используя автоклавную воду.
  3. Поместите небольшой фрагмент собачьего корма (примерно 0,5 г) на среду DFA на расстоянии примерно 2 мм от крышки тарелки.
  4. Осветите пластину NGM ультрафиолетовым светом в течение 15 минут внутри чистого стола, чтобы предотвратить загрязнение.
  5. Высейте собранных червей (примерно 400 червей) в среду DFA на планшетах NGM. Не закрывайте планшет парапленкой, чтобы избежать повышения влажности внутри чашки Петри и образования капель воды, которые задерживают червей на крышке.
  6. Размножайте червей при температуре 23 °C и дайте им подняться до крышки тарелки примерно 10-14 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку количество червей на крышках почти не увеличивалось через 10-14 дней, предполагалось, что у червей, вероятно, закончилась пища.

4. Наблюдение за коллективным поведением

  1. В день эксперимента поместите новую планшет NGM, не содержащую кишечную палочку и агаровую среду для собачьего корма, на алюминиевую пластину на предметном столике микроскопа с макрозумом (рис. 2А). Держите нижнюю часть этой новой пластины NGM при температуре 23 °C с помощью регулятора температуры Пельтье не менее 5 минут (Рисунок 2B). Затем замените крышку этой новой пластины NGM крышкой пластины, на которую забрались черви. Используйте объектив (x2, NA = 0,5) в качестве объектива с малым увеличением (Рисунок 2A).
  2. Увеличьте температуру нижней части чашки Петри с 23 °C до 26 °C, чтобы изменить влажность внутри этой чашки (Рисунок 2).
  3. Получение изображений внутренней поверхности крышки пластины с помощью камеры на 20 кадрах с−1 (дополнительное видео S1).
  4. Сохраните полученные изображения в формате Tagged Image File.

5. Оптогенетический эксперимент

  1. Используйте ртутную лампу мощностью 100 Вт для подачи синего света, отфильтрованного с помощью набора фильтров. Точно контролируйте время освещения с помощью электромагнитной системы затворов (рис. 2B).
  2. Поддерживайте ZX899 на DFA в этих условиях в течение 5 минут до загорания синего света.
  3. Осветите червей ZX899, прикрепленных к крышке планшета Петри на предметном столике микроскопа, поддерживаемом при температуре 23 °C.
  4. Получение изображений внутренней поверхности крышки пластины с помощью камеры в режиме 20 кадров с−1 (дополнительное видео S2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь для коллективных наблюдений за поведением использовались черви Дауэра дикого типа. Червей культивировали при температуре 23 °C в течение примерно 10-14 дней и взбирались на внутреннюю поверхность крышки средней пластины DFA. В экспериментальный день только крышку переносили на новую пластину NGM без кишечной палочки и среды DFA. Дно этой чашки Петри первоначально поддерживалось при температуре 23 °C с помощью системы Пельтье, а затем его температура была увеличена до 26 °C. Под микроскопом был снят фильм....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании мы показываем протокол подготовки системы для крупномасштабного коллективного поведения C. elegans в лабораторных условиях. Метод, основанный на DFA, был первоначально разработан для Caenorhabditis japonica14 и Neoaplectana carpocapsae Weiser15, которые не являются модельными животными. Однако этот метод не применялся для исследования коллективного поведения. C. elegans является генетически поддающимся работе модельн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.

Благодарности

Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis за предоставленные штаммы, использованные в этом исследовании. Данная публикация была поддержана JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (номер гранта JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid по проекту инновационных областей «Наука о мягком роботе» (грант No JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (грант No JP23H03845), PRIME от Японского агентства медицинских исследований и разработок (номер гранта JP22gm6110022h9904), JST-Mirai Program (грант No JPMJMI22G3), и программа JST-FOREST (грант No JPMJFR214R).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Escherichia coli и C. elegans штаммы<
em>E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50Пища для C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]authorZX899lite-1(ce314) мутант, несущий гены, экспрессирующие ChR2 и RFP под контролем mec-4 и unc-122 promoter, соответственно
N2 BristrolCaenorhabditis Genetics CenterWild-type C. elegans штамм
Для культивирования червей
Агар очищенный, порошокNakarai tesque01162-15Для приготовления пластин NGM
All-trans retinalSigma-AldrichR2500Для оптогенетики
Bacto peptonBecton Dickinson211677Для приготовления пластин NGM
Хлорид кальцияWako036-00485Для приготовления тарелок NGM
ХолестеринWako034-03002Для приготовления тарелок NGM
ди-фотассия гидрогенфосфатNakarai tesque28727-95Для приготовления тарелок NGM
Корм для собакNihon Корм для домашних животныхVITA-ONEДля приготовления корма для собак агар средний
LB бульон, LennoxNakarai tesque20066-95Для культивирования E. coli OP50
Сульфат магния безводныйTGIM1890Для приготовления тарелок NGM
чашки Петри (60 мм)Nunc150270Для приготовления тарелок
NGM Дигидрогенфосфат калияNakarai tesque28720-65Для приготовления тарелок NGM
Хлорид натрияNakarai tesque31320-05Для подготовка пластин NGM
Observation
ComputerCT solutionCS6229Windows10 Pro с процессором Intel Xeon Gold 6238R и 768 ГБ оперативной памяти
CMOS камераHamamatsu photonics ORCA-Lightning C14120-20PДля сбора данных
CMOS камераOlympusDP74Для сбора данных
Микроскоп с набором SZX-MGFPOlympusMVX10Для сбора данных
x2 ОбъективOlympusMV PLAPO 2XCРабочий отрезок 20 мм и числовая апертура 0,5
<сильный>Управление затвором
ЗатворOptoSigmaBSH2-RIXДля управления временным рисунком  световой подсветкой
Контроллер затвораOptoSigmaSSH-C2B-AДля управления временной картиной  световой подсветки
<сильный>Контроль температуры
Пельтье блок терморегулятораVICSWLVPU-30Для контроля влажности внутри пластины Петри
UNI-THEMO CONTROLLERAmpereUTC-100Для контроля влажности внутри пластины Петри
Программное обеспечение для сбора данных
HCImageHamamatsu photonicsДля сбора данных

Ссылки

  1. Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
  2. Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
  3. Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
  4. Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
  5. Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
  6. Bricard, A., Caussin, J. -B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
  7. Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
  8. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  9. Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
  10. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  11. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  12. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  13. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  14. Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
  15. Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
  16. de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
  17. Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L. Starvation-induced collective behavior in C. elegans. Scientific Reports. 5, 10647(2015).
  18. Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181(2019).
  19. Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947(2021).
  20. Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
  21. Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
  22. Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
  23. Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
  24. Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
  25. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Caenorhabditis elegans
Широкомасштабное культивирование нематод для изучения их коллективного поведения
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.