Фенотипическое профилирование дофаминергических нейронов среднего мозга человека, полученных из стволовых клеток человека

Summary

Этот протокол описывает культивирование клеток дофаминергических нейронов среднего мозга человека с последующим иммунологическим окрашиванием и генерацией нейрональных фенотипических профилей из полученных микроскопических изображений с высоким содержанием, позволяющих идентифицировать фенотипические вариации, обусловленные генетическими или химическими модуляциями.

Abstract

Болезнь Паркинсона (БП) связана с рядом клеточных биологических процессов, которые вызывают потерю дофаминергических нейронов среднего мозга (мДА). Многие современные клеточные модели БП in vitro недостаточно сложны и не учитывают множественные фенотипы. Фенотипическое профилирование нейронов мДА, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), может устранить эти недостатки путем одновременного измерения ряда фенотипов нейронов в PD-релевантном типе клеток. В данной статье мы опишем протокол получения и анализа фенотипических профилей коммерчески доступных нейронов мДА человека. Нейрон-специфическая флуоресцентная окрашивающая панель используется для визуализации фенотипов, связанных с ядерным α-синуклеином, тирозингидроксилазой (ТГ) и микротрубочками-ассоциированным белком 2 (MAP2). Описанный протокол фенотипического профилирования является масштабируемым, так как в нем используются 384-луночные планшеты, автоматическая работа с жидкостями и высокопроизводительная микроскопия. Полезность протокола проиллюстрирована на примере здоровых донорских нейронов mDA и нейронов mDA, несущих PD-сцепленную мутацию G2019S в гене лейцин-богатой повторной киназы 2 (LRRK2). Обе клеточные линии обрабатывали ингибитором киназы LRRK2 PFE-360 и измеряли фенотипические изменения. Кроме того, мы демонстрируем, как многомерные фенотипические профили могут быть проанализированы с помощью кластеризации или методов классификации с учителем на основе машинного обучения. Описанный протокол будет особенно интересен исследователям, работающим над моделированием заболеваний нейронов или изучающими эффекты химических соединений в нейронах человека.

Introduction

При болезни Паркинсона (БП) нарушаются различные клеточные биологические процессы. Например, митохондриальная дисфункция, окислительный стресс, дефекты деградации белков, нарушение везикулярного транспорта и эндолизосомальной функции, связанные с потерей дофаминергических нейронов среднего мозга (мДА), обычно наблюдаются при БП¹. Таким образом, болезнь Паркинсона, по-видимому, включает в себя несколько механизмов заболевания, которые могут взаимодействовать друг с другом и ухудшать друг друга. Одним из полезных способов исследования этого механистического взаимодействия является создание комплексного фенотипического отпечатка пальца или профиля....

Protocol

1. Подготовка среды и планшетов для посева нейронов (День 1)

1. Чтобы подготовить планшеты к посеву нейронов в День-1, подогрейте ламинин до комнатной температуры (RT) непосредственно перед использованием. Приготовьте раствор ламинина, разбавив исходный раствор ламинина (0,1 мг/мл) 1/10 в холодном PBS+/+ (с Ca 2+ и Mg²⁺).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты перечислены в таблице материалов. Составы растворов и буферов описаны в таблицах 1-4.
2. Затем добавьте 25 мкл раствора ламинина в каждую лунку 384-луночного планшета с полимер-D-лизином (PDL) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Плас....

Results

Фенотипическое профилирование нейронов мДА является эффективным способом количественной оценки различных аспектов клеточной биологии и их изменений во время экспериментальной модуляции. Чтобы проиллюстрировать эту методологию, в этом исследовании использовались криоконсервированные нейроны LRRK2 G2019S и здоровые донорские нейроны mDA. Эти нейроны дифференцированы в течение примерно 37 дней, являются постмитотическими и экспресс-маркерами нейронов (TUBB3 и MAP2) и маркерами дофаминергических нейронов, включая тирозингидр.......

Discussion

Фенотипическое профилирование — это метод измерения большого числа фенотипов в клетках с помощью флуоресцентного окрашивания, микроскопии и анализа изображений³. Фенотипические профили могут быть получены и сравнены между клеточными линиями или другими экспериментальными условиями, чтобы понять сложные изменения в клеточной биологии, которые могут остаться незамеченными при использовании одного считывания. В данной статье мы опишем применение фенотипического профилирования к нейронам мДА человека,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Анти- курица – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Иммунофлуоресцентный
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Иммунофлуоресцентный
анти-мышь - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Иммунофлуоресцентный
анти-кролик - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Иммунофлуоресцентная
антитирозингидроксилаза	Merck	T2928	Иммунофлуоресцентная
анти-&альфа;-синуклеин	Abcam	138501	Иммунофлуоресценция
Автоматизированная платформа для работы с жидкостями Bravo с головкой 384ST	Agilent		Если манипулятор для работы с жидкостями недоступен, рекомендуется использовать электронную многоканальную пипетку.
Конфокальный микроскоп	Yokogawa	CV7000	Для обеспечения стабильного качества изображения рекомендуется использовать автоматизированный конфокальный флуоресцентный микроскоп.
Countess Автоматизированный счетчик клеток	Invitrogen		Подсчет клеток перед посевом. Также можно сделать с помощью ручной счетной камеры.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Буфер для стирки
EL406 Дозатор омывателя	BioTek (Agilent)		Если манипулятор для работы с жидкостями недоступен, рекомендуется использовать электронную многоканальную пипетку.
Раствор формальдегида (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Фиксация перед окрашиванием
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Ядерное окрашивание
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Базовая среда для нейронов
iCell DPN, донор#01279, Фенотип AHN, лот#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Внешне здоровый донор
iCell DPN, донор#11299, фенотип LRRK2 G2019S, фенотип PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Донор несущий мутацию LRRK2 G2019S
Добавка для нервной системы iCell	Fujifilm	M1031	Добавка для базовой среды
iCell Нейронная добавка B	Fujifilm	M1029	Добавка для базовой среды
Jupyter Python Notebook	Собственная разработка	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook для выполнения визуализации фенотипического профиля и классификации по необработанным данным.
Laminin	Biolamina	LN521	Покрытие пластины
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 ингибитор киназы
PhenoLink	Собственная разработка	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Программное обеспечение для анализа изображений
PhenoPlate 384w, покрытое PDL Perkin	Elmer	6057500	Планшет с предварительно нанесенным покрытием для культивирования клеток и визуализации. Эта пластина позволяет визуализировать все скважины с использованием всех объективов микроскопа Yokogawa CV7000.
Планшеты для хранения Abgene 120 &; L	Thermo Scientific	AB-0781	Необходим для дозирования компаундов с использованием системы пипетирования Vprep. Если его нет, рекомендуется использовать электронную многоканальную пипетку.
Triton	Sigma	T9284	Пермеабилизация перед лизисом
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Определение живых клеток
Vprep Pipett System	Agilent		Диспенсирование сред и компаундов. В качестве альтернативы можно использовать электронный многоканальный пипетку.