Интегрированное формирование костной ткани с помощью эндохондральной оссификации in vivo с использованием мезенхимальных стволовых клеток

Summary

Костная терапия с помощью эндохондральной оссификации путем имплантации искусственной хрящевой ткани, полученной из мезенхимальных стволовых клеток, может обойти недостатки традиционных методов лечения. Гидрогели гиалуроновой кислоты эффективны для масштабирования равномерно дифференцированных хрящевых трансплантатов, а также для создания интегрированной кости с васкуляризацией между сросшимися трансплантатами in vivo.

Abstract

Традиционная терапия костной регенерации с использованием мезенхимальных стволовых клеток (МСК) трудно применима к костным дефектам, превышающим критический размер, поскольку она не имеет механизма индуцирования ангиогенеза. Имплантация искусственной хрящевой ткани, изготовленной из МСК, индуцирует ангиогенез и формирование костной ткани in vivo посредством эндохондральной оссификации (ЭКО). Таким образом, этот ЭКО-опосредованный подход может стать многообещающей терапией регенерации костной ткани в будущем. Важным аспектом клинического применения этого ЭКО-опосредованного подхода является создание протокола подготовки достаточного количества хряща для имплантации для восстановления костного дефекта. Особенно непрактично создавать единичную массу трансплантированного хряща такого размера, который соответствует форме фактического костного дефекта. Таким образом, хрящ, подлежащий пересадке, должен обладать свойством формировать кость интегрально при имплантации нескольких частей. Гидрогели могут быть привлекательным инструментом для масштабирования тканеинженерных трансплантатов для эндохондральной оссификации в соответствии с клиническими требованиями. Несмотря на то, что многие гидрогели природного происхождения поддерживают образование хряща МСК in vitro и ECO in vivo, оптимальный материал каркаса для удовлетворения потребностей клинического применения еще предстоит определить. Гиалуроновая кислота (ГК) является важнейшим компонентом хрящевого внеклеточного матрикса и представляет собой биоразлагаемый и биосовместимый полисахарид. Здесь мы показываем, что гидрогели ГК обладают превосходными свойствами поддерживать дифференцировку хрящевой ткани на основе МСК in vitro и способствовать образованию эндохондральной кости in vivo.

Introduction

Аутологичная кость по-прежнему является золотым стандартом для восстановления костных дефектов, вызванных травмами, врожденными дефектами и хирургической резекцией. Однако аутогенная костная пластика имеет существенные ограничения, включая боль донора, риск инфекции и ограниченный объем костной ткани, который может быть выделен у пациентов 1,2,3,4. В качестве заменителей костной ткани были разработаны многочисленные биоматериалы, сочетающие природные или синтетические полимеры с минерализованными материалами, такими как фосфат кальция или

Protocol

В этом протоколе используются 4-недельные самцы голых мышей. Поместите четырех мышей в клетку при 12-часовом цикле света и темноты при температуре 22−24 °C и относительной влажности 50−70%. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Токийского медицинского и стоматологического университета (идентификатор одобрения: A2019-204C, A2020-116A и A2021-121A).

1. Приготовление буферов и реагентов

1. Приготовьте питательную среду для мезенхимальных стволовых клеток (питательную среду МСК), добавив набор питательны....

Results

МСК-инкапсулированные гидрогели ГК культивировали в хондрогенной среде с добавлением TGFβ3 – индуктора хондрогенеза⁴¹ (стадия 4.1). Мы сравнили свойства ГК со свойствами коллагена, который, как было показано, эффективен при создании искусственных хрящевых трансплантатов на основе МСК для эндохондральной оссификации, как описано ранее³⁸. Недифференцированные МСК не были включены в это исследование в качестве негативного контроля, поскольку было продемонстрировано, что недифф.......

Discussion

Использование соответствующих материалов каркаса, способствующих переходу от гипертрофированного хряща к кости, является перспективным подходом к масштабированию инженерных гипертрофических хрящевых трансплантатов на основе МСК и лечению костных дефектов клинически значимого размера. Здесь мы показываем, что гиалуроновая кислота является отличным материалом для каркаса, поддерживающего дифференцировку гипертрофированной хрящевой ткани на основе МСК in vitro и способствующего образованию эндохондральной кости

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 вт/об% трипсина-1ммоль/л раствор EDTA.4Na	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
аскорбат-2-фосфат	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
основной фактор роста фибробластов	Reprocell	RCHEOT002
бычья сыворотка альбумин	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7,5 с %
Автоматический счетчик клеток Countess со слайдами камеры подсчета клеток и красителем Trypan Blue 0,4%	Invitrogen	C10283
дексаметазон	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium Merck		D6429
Модифицированная смесь питательных веществ Dulbecco's Eagle's Medium/питательных веществ F-12 Ham	Merck	D6421
Фетальная бычья сыворотка	Hyclone	SH30396.03
Гентамицина сульфат	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 мг/мл
генератор Haccpper TechnoMax		CH-400-5QB	50 ppm вода с хлорноватистой кислотой
Мезенхимальные стволовые клетки человека	Lonza	PT-2501
Набор каркаса для культивирования стволовых клеток HyStem Cell Culture Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G добавка	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	× 100
L-Alanyl-L-глутамин	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200 ммоль/л (× 100)
L-пролин	Nacalai Tesque	29001-42
L-тироксин	Merck	T1775
MSCGM Среда для роста мезенхимальных стволовых клеток BulletKit	Lonza	PT-3001
парафин	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100мл	Medicago	09-2051-100
TGF-β 3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Мазь	SAVAVET/SAVA Healthcare
&бета;-глицерофосфат	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332