Методическая статья

Гипергликемический зажим и гипогликемический зажим у мышей в сознании

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65581

⸱

26 января 2024 г.

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

В этой статье

Краткое содержание

Гипергликемический зажим используется для измерения высвобождения инсулина при поддержании более высокой концентрации глюкозы в крови. Гипогликемический зажим предназначен для измерения выработки глюкозы, индуцированной контррегуляторными реакциями. В обоих методах используется одна и та же хирургическая процедура. Здесь мы представляем метод зажимов для оценки системного метаболизма глюкозы.

Аннотация

Сахарный диабет (СД) обусловлен недостаточным выделением инсулина из β-клеток поджелудочной железы (СД 1 типа) и чувствительностью к инсулину в мышцах, печени и жировых тканях (СД 2 типа). Инъекции инсулина лечат пациентов с СД, но в качестве побочного эффекта приводят к гипогликемии. Кортизол и катехоламины высвобождаются, чтобы активировать выработку глюкозы из печени для восстановления гипогликемии, называемой контррегуляторной реакцией (CRR). В исследованиях СД на моделях грызунов для измерения высвобождения инсулина и CRR используют глюкозотолерантные тесты и инъекции 2-дезоксиглюкозы соответственно. Тем не менее, концентрация глюкозы в крови постоянно изменяется во время экспериментов, что вызывает трудности в оценке чистого высвобождения инсулина и CRR. В этой статье описывается метод, при котором уровень глюкозы в крови поддерживается на уровне 250 мг/дл или 50 мг/дл у мышей, находящихся в сознании, для сравнения высвобождения гормонов инсулина и CRR соответственно.

Полиэтиленовые трубки имплантируются в сонную артерию и яремную вену мышей, и мышам дают возможность восстановиться после операции. Трубка для яремной вены соединена со шприцем Hamilton с помощью шприцевого насоса для обеспечения инфузии инсулина или глюкозы с постоянной и переменной скоростью. Трубка сонной артерии предназначена для забора крови. При гипергликемическом зажиме в вену вводится 30% глюкозы, а уровень глюкозы в крови измеряется из артериальной крови каждые 5 минут или 10 минут. Скорость инфузии 30% глюкозы увеличивают до тех пор, пока уровень глюкозы в крови не станет 250 мг/дл. Кровь собирается для измерения концентрации инсулина. При гипогликемическом зажиме инсулин в дозе 10 мЕд/кг/мин вводят вместе с 30% глюкозой, скорость инфузии которой варьируется для поддержания уровня глюкозы в крови 50 мг/дл. Кровь собирается для измерения контррегуляторных гормонов, когда инфузия глюкозы и глюкоза в крови достигают стабильного состояния. Как гипергликемические, так и гипогликемические зажимы имеют одинаковую хирургическую процедуру и экспериментальные установки. Таким образом, данный метод полезен для исследователей системного метаболизма глюкозы.

Введение

Глюкоза является важным источником энергии для клеток, и недостаток глюкозы может привести к различным симптомам и осложнениям. В случае низкого уровня глюкозы (гипогликемия, как правило, менее 70 мг/дл уровня глюкозы в крови натощак, но не должна определяться по одному значению1) наиболее распространенными симптомами являются слабость, спутанность сознания, потливость и головная боль. Он также может нарушить церебральную функцию и увеличить риск сердечно-сосудистых событий и смертности2. И наоборот, гипергликемия — это заболевание, при котором концентрация глюкозы в плазме превышает нормальный уровень (обычно > 126 мг/дл при уровне глюкозыв крови натощак 3). Это может произойти у людей с диабетом, у которых наблюдается дефицит в выработке или использовании инсулина. Гипергликемия может привести к диабетическому кетоацидозу, который возникает, когда организм не может использовать глюкозу для получения энергии, а вместо этого расщепляет жирные кислоты в качестве топлива. Гипергликемическое гиперосмолярное состояние также увеличивает смертность4. Длительная гипергликемия может вызвать повреждение кровеносных сосудов, нервов и органов, что приводит к развитию ряда хронических осложнений, таких как сердечно-сосудистые заболевания, ретинопатии и заболевания почек. Таким образом, концентрация глюкозы в крови должна поддерживаться в узком диапазоне от 100 мг/дл до 120 мг/дл.

Уровень глюкозы в крови регулируется балансом между входом и выходом глюкозы в однокамерной модели (рис. 1А). Поступление глюкозы включает абсорбированную глюкозу из пищи и выработку глюкозы печенью, почками и тонким кишечником. Выброс глюкозы включает в себя поглощение глюкозы в тканях и выведение глюкозы из почек. Как количество входящей, так и выходящей глюкозы регулируется эндокринными гормонами. Например, глюкагон, кортикостерон и катехоламины, известные как контррегуляторные гормоны, высвобождаютсяпри снижении уровня глюкозы в крови. Они стимулируют расщепление гликогена и синтез глюкозы, главным образом из печени; Эти процессы известны как гликогенолиз и глюконеогенез соответственно. Гипергликемия увеличивает высвобождение инсулина из β-клеток поджелудочной железы и стимулирует поглощение глюкозы в мышцах, жировых тканях и сердце 6,7,8,9. Физические упражнения увеличивают инсулиннезависимое поглощение глюкозы10. Симпатическая нервная система увеличивает поглощение глюкозы в мышцах и бурой жировой ткани 6,11. Для измерения способности регулировать метаболизм глюкозы в периферических тканях исследователи обычно используют тест на толерантность к глюкозе (GTT) и тест на толерантность к инсулину (ITT) (рис. 1B, C). При ГТТ необходимо учитывать два фактора: высвобождение инсулина и чувствительность к инсулину (рис. 1Б). Тем не менее, кривая концентрации глюкозы во время 120-минутного теста различна у каждой мыши, что может влиять на разное количество высвобождения гормонов. При ИТТ уровень глюкозы в крови регулируется как чувствительностью к инсулину, так и высвобождением контррегуляторных гормонов. Таким образом, трудно определить точное значение метаболизма глюкозы, высвобождения инсулина и чувствительности к инсулину при ГТТ и ИТТ в ситуациях, когда уровень глюкозы в крови не постоянен.

Для преодоления этих проблем желательно поддерживать уровень глюкозы в крови на постоянном уровне (или «зажим»). При гипергликемическом зажиме глюкоза вводится в кровоток, чтобы поднять уровень глюкозы в крови до определенного уровня, а затем поддерживается на этом уровне в течение определенного периода времени. Количество вводимой глюкозы корректируется на основе измерений уровня глюкозы в крови каждые 5-10 минут для поддержания устойчивого состояния. Эта методика особенно полезна для понимания параметров секреции инсулина при зажатом уровне глюкозы. Гипогликемический зажим – это метод поддержания низкого уровня глюкозы в крови путем введения инсулина. Глюкоза вводится с переменной скоростью для поддержания определенного уровня глюкозы в крови. Если мышь не может оправиться от гипогликемии, следует ввести больше глюкозы.

Несмотря на то, что выполнение гипергликемических и гипогликемических зажимов имеет много преимуществ, хирургические и экспериментальные процедуры считаются технически сложными. Таким образом, немногие исследовательские группы смогли сделать это. Мы стремились описать эти методы для исследователей с финансовыми и трудовыми ограничениями, чтобы начать эти эксперименты с меньшим бюджетом.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете Кумамото.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения боли ибупрофен давали в питьевой воде (0,11 мг/мл) в течение 48 ч, а бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг в/в) давали за 30 мин до операции. Стерильные условия включают перчатки, маски и автоклавные инструменты, стерилизованные окисью этилена между животными. Операция проводилась на грелке, установленной при температуре 37 °C, и накрыта новым лабораторным ковриком для каждого животного. Перед операцией операционную область очищали раствором бетадина и спиртом. Все хирургические инструменты стерилизовались в автоклаве (не более чем на две операции). Перед тем, как сделать разрез, мышей проверяли, чтобы убедиться, что они полностью обезболены. Глубину анестезии для каждой мыши оценивали до и во время операции с помощью щипки пальца ноги. Акклиматизационный период каждый раз составлял не более 5 минут. Следуйте инструкциям IACUC в соответствующем учреждении.

1. Подготовка трубок для яремной вены и сонной артерии

  1. Стерилизовать все трубки, полипропиленовые принадлежности (например, наконечники для пипеток) и швы с помощью автоклава или окиси этилена. Для яремной вены соедините 8 см трубки1 (см. Материалы) и 3 см трубки2 с помощью клея (Рисунок 2А). Положите сверху 2 мм трубки1, потому что трубка 2 (полиэтилен) слишком твердая и может повредить кровеносные сосуды (трубка 1.1).
  2. Удлинительная трубка для яремной вены (Tubing1.2) для инфузии глюкозы и инсулина
    1. Подготовьте две 30-сантиметровые трубки и одну 10-сантиметровую трубку с трубкой2 (Рисунок 2А). Отрежьте острый конец наконечника дозатора объемом 20 мкл (или любого устройства с узким концом с наружным диаметром < 0,5 мм для соединения с трубкой 1.1) и поместите в него три трубки2 (30 см, 30 см и 10 см). Запечатайте клеем.
    2. Поместите 5 см трубки1 на другой конец трубки2.
  3. Для сонной артерии (трубка1.3): растяните трубку2, чтобы сделать ее тоньше. Соедините 8 см трубки1 и 3 см растянутой трубки2 с помощью клея (Рисунок 2A). Сделайте отметку на расстоянии 9 мм от кончика.
  4. Игла с неострым концом, которая соединяет трубку со шприцем: Сделайте царапину возле острого конца иглы (23 G) металлическим напильником, аккуратно согните ее несколько раз вперед и назад плоскогубцами и сломайте. Сделайте такой же надрез посередине иглы, чтобы получился кусок металлического соединителя (рисунок 2А).
  5. Удлинительная трубка для забора крови из артерии (комплект трубок 1.4): Соедините 10 см трубки1 с металлическим соединителем и неострой иглой, изготовленной на шаге 1.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все трубки и шовные нити стерилизуются автоклавом или окисью этилена

2. Хирургическое вмешательство

  1. Обезболивайте мышь изофлураном (1,5-2,0%) или кетамином/ксилазином (кетамин 10 мг/мл, ксилазин 1 мг/мл в 0,9% стерильном физиологическом растворе, 0,1 мл/10 г массы тела (МТ) через внутрибрюшинную инъекцию). Держите мышь на теплой коврике (37 °C), чтобы снизить физическую нагрузку. Дождитесь глубокой анестезии 5-10 минут. Подтвердите глубину анестезии педальным рефлексом, дыханием и частотой сердечных сокращений, а реакцию на раздражители — защемлением пальца ноги. Во время операции следует использовать хирургическую ленту, чтобы закрепить носовой колпачок на операционном столе для непрерывного вдыхания анестезии. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
  2. Наполните гепаринизированный физиологический раствор (100 Ед/мл) в трубки 1.1 и 1.3 и соедините их шприцем объемом 1 мл с неострой иглой (рис. 2Б). Закройте конец трубки3 (см. Таблицу материалов), расплавив ее паяльником, который будет использоваться в качестве колпачков для трубок1.1 и трубок1.3.
  3. Побрить и протереть первую (межлопаточную сзади) и вторую (шея спереди) область разреза тремя циклами 10% бетадина с последующей предоперационной подготовкой стерильным 70% спиртом. Сделайте небольшой вертикальный разрез по средней линии на 5 мм от грудины, тупым рассеките ткани и обнажите артерию. Отделите блуждающий нерв от артерии. Это снижает негативное влияние удаления блуждающего нерва на метаболизм глюкозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап от вентрального разреза до этапа, где катетер вводится в вену и фиксируется шелковыми швами, выполняется под микроскопом.
  4. Наложите два шелковых шва под артерию. Остановите кровоток, плотно завязав один шов со стороны черепа (Рисунок 2C-1), а другой — со стороны каудальной стороны (Рисунок 2C-2), этого достаточно, чтобы остановить кровоток, но достаточно, чтобы снова открыть его позже. Наложите еще один шов под артерию (Рисунок 2C-3).
  5. Перережьте пружинными ножницами артерию рядом с рисунком 2C-1 и вставьте трубку 1.3 в артерию. Сделайте неплотную завязку как на артерии, так и на трубке (Рисунок 2C-3, не завяжите сильно. Трубка будет введена глубже в артерию). Разверните узел с каудальной стороны (Рисунок 2C-2), чтобы вставить трубку до тех пор, пока отметка 9 мм не достигнет узла посередине (Рисунок 2C-3). Надежно завяжите все лигатуры и промойте гепаринизированным стерильным физиологическим раствором.
  6. Обнажите правую яремную вену из того же разреза, что и правую сонную артерию для яремного катетера. Изолируйте конец черепа и перевязайте его шелковым швом (рисунок 2D-1, таблица материалов). Наложите еще один кусочек шва на каудальный конец обнаженной вены (Рисунок 2D-2). Отрежьте вену возле отметки 2D-1 пружинными ножницами.
  7. Введите катетер (не слишком глубоко, чтобы предотвратить проникновение в сосуды), завяжите его и визуально убедитесь, что он берет кровь. Промойте гепаринизированным стерильным физиологическим раствором (0,2 мл) и визуально убедитесь, что в катетере не осталось крови.
  8. Поместите мышь на новую стерильную хирургическую простыню, чтобы предотвратить инфекцию из первой раны. Переверните мышь, протрите тремя циклами бетадина с последующей предоперационной подготовкой стерильным спиртом, и сделайте небольшой разрез между лопатками.
  9. Проведите иглодержатель под кожей от разреза на тыльной стороне до вентральной стороны. Зажмите катетеры иглодержателем, пропустите их под кожу и верните обратно. Очистите место разреза и закройте вентральные разрезы синтетическим швом (диаметр 0,15-0,2 мм). Зажмите венозный катетер микрозазубринами в месте разреза между лопатками.
  10. Разрежьте катетер на 1 см выше зажима, промойте его гепаринизированным физиологическим раствором и закройте колпачком (шаг 2.4). Проделайте ту же процедуру с артериальным катетером. Тыльной разрез закрыть синтетическим швом (диаметр 0,15-0,2 мм).
  11. Поместите мышь в теплую чистую клетку (Рисунок 2E). Выполняйте послеоперационный уход ежедневно.

3. Восстановление

  1. Поместите мышь в одиночный дом, потому что другая мышь может укусить катетер в групповом корпусе.
    1. Чтобы уменьшить стресс из-за социальной изоляции, содержате мышей в окружающей среде (например, в убежищах). Выполняйте послеоперационный уход ежедневно. Для облегчения боли, дистресса и дискомфорта обеспечьте послеоперационный уход, включая обезболивание (ибупрофен в питьевой воде (0,11 мг/мл).
    2. Наблюдайте за мышами на предмет признаков инфекции, таких как нагноение, вялость или боль в месте разреза. Большинство здоровых мышей начинают ходить и есть примерно через 2 часа после операции. Сгорбленная осанка, взъерошенная шерсть и снижение потребления пищи могут указывать на боль. Если эти признаки наблюдаются, немедленно усыпите мышей, обезглавив их под глубоким наркозом или удушьем углекислым газом.
  2. Кровь попадет в катетер в артерию и сформирует сгусток. Для поддержания катетерных катетеров удаляйте тромб ежедневно, выполняя шаги 3-6.
  3. Наполните шприц объемом 1 мл и иглу 23 г (с неострым концом) гепаринизированным физиологическим раствором (100 ед/мл). Используя индукционную камеру, слегка обезболивайте мышь изофлураном (1,0%-1,5%). Затем извлеките мышь из камеры и выполните удаление тромба под анестезией изофлураном с помощью носового колпачка.
  4. Зажмите трубку для артерии на задней части мыши с помощью microserrefine, снимите колпачок и извлеките кровь и сгустки. Промойте катетер гепаринизированным физиологическим раствором с помощью другого шприца объемом 1 мл с иглой 23 G (неострый конец) и снова закройте его. Очистите венозную линию, как артериальную, в случае сильного свертывания крови.
  5. Проделывайте ту же процедуру очистки катетера один раз в день в течение 3-5 дней.
  6. Проверьте массу тела мыши. Если масса тела снижается более чем на 10% со дня операции, примените поддерживающую терапию и попытайтесь улучшить нормальный показатель упитанности, а затем используйте мышь для другого эксперимента.
    Примечание: Потеря веса животных составила менее 10% в экспериментах в этом исследовании. Потеря веса сильно повлияет на системный метаболизм глюкозы. Таким образом, рекомендуется дождаться восстановления массы тела или снять с эксперимента зажим.

4. Настройте насосную систему (для гипогликемического зажима)

  1. Приготовьте 1 ЕД/мл инсулина в 0,1% физиологическом растворе BSA, 30% глюкозы в физиологическом растворе и гепаринизированном физиологическом растворе.
  2. Измерьте массу тела мыши. Рассчитайте объем для 1 ЕД/мл инсулина, чтобы вызвать инфузию инсулина (10 мЕд/кг/мин). Влить 1,7 мкл/мин раствора инсулина мышам в эксперименте с зажимами. Для инфузии 300 мкл инсулина необходимый объем для 1 ЕД/мл инсулина (мкл) составляет 2,647 (мкл/г) х масса тела (г). Объема в 300 мкл инфузата инсулина достаточно, чтобы закончить эксперимент с зажимами на 1 мыши. В таблице 1 приведен пример введения инсулина.
  3. Наполните инсулин инфузией и 30% глюкозы в каждый шприц Гамильтона, соедините их трубкой 1,2 и установите шприц на шприцевой насос (рисунок 3А). Залейте каждый раствор в трубку 1.2. Наполните физиологическим раствором шприц и набор трубок 1,4 (Рисунок 2А).
  4. Обезболивайте мышь изофлураном (1,0%-1,5%) и подсоедините трубку 1,2 к венозному катетеру и комплект трубок 1,4 к артериальному катетеру (рис. 3A). Используйте целлофановую ленту, чтобы скрепить трубки.
  5. Поместите мышь в пустой стакан объемом 500 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для гипергликемического зажима используйте физиологический раствор вместо инсулина 1 Ед/мл.

5. Гипогликемический зажим

  1. Измеряйте уровень глюкозы в крови каждые 5-10 минут, как показано на рисунке 3B, и собирайте образцы крови для измерения гормонов через -15 мин, 10 мин, 20 мин, 40 мин, 60 мин, 80 мин, 100 мин и 120 мин. Выполните шаг 5.2, чтобы измерить уровень глюкозы в крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости измерять уровень глюкозы в крови во все моменты времени, но рекомендуется измерять его не реже чем каждые 10 минут. Измеряйте уровень глюкозы в крови каждые 5 минут, когда ее уровень и скорость инфузии глюкозы не являются постоянными.
  2. Зажмите верхний конец комплекта трубок1.4 и подсоедините новый шприц, извлеките 50 мкл крови и поместите его в пробирку объемом 1,5 мл для промывания. Измерьте уровень глюкозы в крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это кровь, разбавленная физиологическим раствором в пробирке из-за промывания катетера после предыдущего забора. Объема в 50 мкл достаточно, чтобы заменить разбавленную кровь чистой.
  3. Храните разбавленную кровь (эритроциты). Скопившуюся кровь (~500 мкл) промыть физиологическим раствором (см. шаги 5.11-5.12) и вернуть в организм для предотвращения гипоксии.
  4. Катетер соединяется с артерией с высоким кровяным давлением, поэтому, когда зажим ослабляется, кровь вытекает наружу и используется для измерения глюкозы с помощью удобного глюкометра. Влейте 50 мкл физиологического раствора, чтобы сохранить достаточное количество жидкости в крови.
  5. Для забора крови возьмите дополнительно 50 мкл крови и поместите ее в пробирку объемом 1,5 мл на лед. Влить 100 мкл (50 мкл замещения + 50 мкл забора) физиологического раствора.
  6. Через 0 минут после измерения уровня глюкозы в крови запустите инсулиновую шприцевую помпу. Сначала влить 30 мЕд/кг/мин в болюс в течение 2 мин (5,1 мкл/мин), затем 10 мЕд/кг/мин (1,7 мкл/мин) инфузии в течение оставшейся продолжительности.
  7. Измеряйте уровень глюкозы в крови и изменяйте скорость инфузии глюкозы каждые 5-10 мин в течение 120 мин.
  8. Создайте устойчивое состояние, при котором скорость инфузии глюкозы не изменяется, а уровень глюкозы в крови составляет 50 мг/дл.
  9. После забора образца крови при t = 120 мин ввести средство для эвтаназии в яремную вену и собрать ткани для анализа РНК или белка.
  10. Центрифугируйте кровь в дозе 1000 х г в течение 5 мин и измеряйте концентрацию гормонов, таких как инсулин или с-пептид, с помощью набора ИФА в соответствии с протоколом производителя.
  11. Для промывания крови центрифугируют кровь при 1000 х г в течение 3 мин. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 500 мкл гепаринизированного физиологического раствора и выполните пипетирование.
  12. Повторите промывание еще раз и поместите промытые эритроциты в шприц объемом 1 мл для артерии. Повторная инфузия клеток крови происходит автоматически при введении 50 или 100 мкл физиологического раствора на этапах 5.2 и 5.3. Внимательно следите за гематокритом, чтобы не допустить гипоксии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения уровня глюкозы в крови использовался коммерческий удобный глюкометр.

6. Гипергликемический зажим

  1. Следуйте инструкциям по гипогликемическому зажиму, но без инфузии инсулина и с доведением уровня глюкозы в крови до 250-300 мг/дл. Измеряйте уровень глюкозы в крови каждые 5-10 минут, как показано на рисунке 3B, и собирайте образцы крови для измерения гормонов через -15 мин, 10 мин, 20 мин, 40 мин, 60 мин, 80 мин, 100 мин и 120 мин.
  2. Подсоедините новый шприц к набору трубок1.4, извлеките 50 мкл крови и поместите его в пробирку объемом 1,5 мл для промывания.
  3. Для забора крови возьмите дополнительно 50 мкл крови и поместите ее в пробирку объемом 1,5 мл на лед. Влить 100 мкл (50 мкл замещения + 50 мкл забора) физиологического раствора.
  4. Через 0 минут измерения уровня глюкозы в крови запустите шприцевую помпу для глюкозы. Сначала влить 30 г/кг/мин в болюс в течение 2 мин (5,1 мкл/мин), затем 10 г/кг/мин (1,7 мкл/мин) в течение оставшейся части времени.
  5. Измеряйте уровень глюкозы в крови и изменяйте скорость инфузии глюкозы каждые 5-10 мин в течение 120 мин. Создать устойчивое состояние, при котором скорость инфузии глюкозы не изменяется, а уровень глюкозы в крови составляет 250-300 мг/дл, зажатое гипергликемическое состояние.

Результаты

Исследование с гипогликемическими зажимами проводили на самцах мышей C57BL/6N (в возрасте 8 недель, более 25 г массы тела) в течение 3 ч голодания в начале эксперимента (рис. 4A, B). Исходный уровень глюкозы в крови составлял 136 мг/дл (t = -15 мин). Если он меньше 90 мг/дл, это может быть связано либо с тем, что операция прошла не очень хорошо, либо артериальный катетер был введен слишком глубоко, либо сгустки крови попали в кровоток. Состояние мышей после операции влияет на энергетический обмен в организме мыши. Физиологический метаболизм глюкозы не может быть измерен при плохих условиях здоровья. C57BL более склонен к свертыванию крови после операции; Мыши с более высокой массой тела, такие как мыши FVB или ICR, с меньшей вероятностью потеряют вес из-за промывания сгустка после операции. Таким образом, новичкам лучше использовать мышей FVB для отработки зажимных процедур. Мыши C57BL нуждаются в более интенсивном уходе. Введение катетера диаметром 9 мм в артерию не доставило нам никаких проблем со сбором крови, даже у мышей FVB и ICR. Прием инсулина начинался при t = 0 мин, и уровень глюкозы в крови снижался (рис. 4А). GIR не был стабильным между t = 0 мин и t = 70 мин. Впоследствии, через 80 мин, он перешел в устойчивое состояние.

Исследование гипергликемических зажимов также проводилось на самцах мышей C57BL/6N (в возрасте 8 недель, более 25 г массы тела) в течение 3 ч голодания в начале эксперимента (рис. 4C, D). После измерения уровня глюкозы в крови и забора образцов крови при t = -15 и t = -5 мин глюкозу вводили с t = 0 мин. Уровень глюкозы в крови составил 250 мг/дл при t = 40 мин. Установившееся состояние продолжалось от t = 30 мин до конца.

figure-results-1
Рисунок 1: Регуляция уровня глюкозы в крови. (А) Концептуальная схема, иллюстрирующая регуляцию уровня глюкозы в крови в организме. (В,В) Регуляция метаболизма глюкозы в (В) глюкозотолерантном тесте (ГТТ) и (С) тесте на толерантность к инсулину (ИТТ). Уровень глюкозы в крови регулируется несколькими факторами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Подготовка трубок и этапы операции. (A) Изображения трубок для сонной артерии и яремной вены. Номера трубок совпадают с номерами шагов протокола. (Б) Метод подготовки трубок к операции. (С, Г) Пронумерованные позиции, в которых шелковые нити перевязываются для введения катетера в (C) артерию и (D) вену. Положение шелковых нитей в краниальной (С-(1)) и каудальной стороне артерии (С-(2)), а также еще одной в середине (С-(3)) (процедура 2-4). Положение шелковых нитей в краниальной (D-(1)) и каудальной стороне вены (D-(2)), а также еще одной в середине (D-(3)) (процедура 2-6). (E) Схема артериальных и венозных канюль, выходящих из спины Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Настройка зажима. (A) Схема, показывающая настройку трубок, насосов, шприцев и мыши. (B) Лист для записи уровня глюкозы в крови и скорости инфузии глюкозы. 50 мкл крови собирают при t = -15 мин, 10 мин, 20 мин, 40 мин, 60 мин, 80 мин, 100 мин и 120 мин. Скорость инфузии инсулина составляла 5,1 мкл/мин при t = 0 до 2 мин и изменялась до 1,7 при t = 2 мин. Уровень глюкозы в крови измеряли каждые 10 мин. Уровень глюкозы в крови измеряли каждые 5 мин, когда ее уровень был нестабильным. Скорость инфузии глюкозы изменялась каждый раз при измерении уровня глюкозы в крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты гипогликемического зажима и гипергликемического зажима. (А) Уровень глюкозы в крови и (Б) Скорость инфузии глюкозы при гипогликемическом зажиме. (C) Уровень глюкозы в крови и (D) скорость инфузии глюкозы гипергликемическим зажимом. Данные представляют собой среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

РешениеВычислениеДля мыши 20 г
1 ЕД/мл инсулина(2,647 x масса тела) мкл52,9 мкл
0,1% БСА физиологический раствор300 мкл - объем инсулина (мкл)247,1 мкл

Таблица 1: Пример расчета для приготовления инфузии инсулина.

Обсуждение

Метод, описанный здесь, прост, и его можно использовать с помощью наконечников пипеток, шприцев и других предметов, которые можно найти в обычных лабораториях. Несмотря на то, что исследователям может потребоваться приобрести дополнительные трубки и насосы, дорогостоящее оборудование не требуется. Таким образом, этот протокол катетеризации и зажима легче начать по сравнению с предыдущими отчетами 12,13,14.

Метод зажима был разработан примерно в 1970 году и использовался на мышах и людях15. Это полезный метод для точного измерения метаболизма глюкозы, который считается золотым стандартом. Тем не менее, это не распространенный метод, используемый многими исследователями. Гиперинсулинемически-эвгликемический зажим был описан у мышей13 и крыс14, но метод катетеризации здесь отличается, и читатели могут выбрать более простой для своих экспериментов. Одной из целей данной статьи является снижение барьера для начала эксперимента. Поэтому мы предоставили подробную информацию о материалах катетеров ручной работы, хирургических процедурах и пример экспериментального временного хода. Они информативны для исследователя, который впервые пытается выполнить зажим.

Секреция инсулина при ожирении и сахарном диабете зависит от стадии. Многие сообщения свидетельствуют о том, что секреция инсулина увеличивается при ожирении для снижения уровня глюкозы в крови в инсулинорезистентном состоянии16, но функция β-клеток будет нарушена при СД 2 типа17,18. На самом деле, количество и площадь островков поджелудочной железы и секреция инсулина были увеличены у мышей с ожирением, таких как мыши, которых кормили пищей с высоким содержанием жиров19, или мышей с дефицитом лептина20. В этих мышиных моделях, которые имеют очевидный фенотип, различия могут быть определены путем исследования уровня инсулина в крови через 15-30 минут после введения глюкозы в ГТТ. Однако в некоторых случаях определить различия в секреции инсулина непросто. Например, если у трансгенных мышей уровень глюкозы в крови составляет 500 мг/дл, а у мышей WT — 300 мг/дл, и у обеих мышей одинаковый уровень инсулина в крови, можем ли мы сказать, что секреция инсулина снижается при Tg? В этом случае мы не можем сравнивать способность секреции инсулина, если уровень глюкозы в крови не одинаков при использовании метода, представленного здесь. Это одна из причин, почему не существует устоявшейся теории о том, когда функция β-клеток начинает ухудшаться при переходе от ожирения к диабету. Мы также можем измерить секрецию инсулина с помощью первичной культуры поджелудочной железы21 или ex vivo22. Однако это разрушит влияние центральной нервной системы на высвобождение инсулина, потому что иннервация блуждающего нерва будет удалена. Постабсорбционная секреция инсулина хорошо известна, но мозг и вегетативная нервная система также регулируют высвобождение инсулина. Эксперимент по анализу последних должен проводиться в безнаркозном, неограниченном, безболезненном заборе крови. По этой же причине блуждающий нерв должен быть отделен от сонной артерии на этапе 2.3.

Сообщалось, что сахарный диабет вызывает гипергликемию из-за резистентности к инсулину и повышенной секреции глюкагона-24 и других контррегуляторных гормонов25. Кроме того, повторяющиеся эпизоды гипогликемии у людей с диабетом из-за сбоев в дозировке инсулина или по другим причинам могут привести к состоянию, называемому рецидивирующей гипогликемией, при котором пациенты склонны к гипогликемии26. Было высказано предположение, что скорость снижения гликемии при гипогликемическом зажиме влияет на периферическую или центральную диагностику гипогликемии27. Медленно начинающаяся гипогликемия может быть уместна для изучения роли датчиков глюкозы в портально-брыжеечных венах, в то время как очень быстрое снижение уровня глюкозы в крови может быть подходящим для исследования датчиков глюкозы головного мозга27. Инсулин 1 ЕД/мл используется для мышей с низким содержанием C57BL. Но у мышей с ожирением потребуется более высокая концентрация инсулина, потому что у них есть резистентность к инсулину, и 1 ЕД/мл недостаточно для снижения уровня глюкозы в крови.

В однокамерной модели пула глюкозы в крови (рис. 1А) количество абсорбированной глюкозы может влиять на скорость поступления глюкозы14. Таким образом, на скорость выработки глюкозы, одну из основных задач измерения гиперинсулинемически-эвгликемического зажима, может влиять продолжительность голодания. Тем не менее, длительное голодание может увеличить выброс контррегуляторных гормонов. Следовательно, исследователи установили время голодания в соответствии с целью анализа. Другой метод зажима включает забор крови из хвоста, который прост, поскольку необходимо ввести только внутривенную канюлю14. Тем не менее, кровь собирается в удерживающей клетке, что вызывает умеренное количество сдерживающего стресса и повышение уровня катехоламинов и других гормонов стресса в плазме14. Кроме того, предпочтительнее измерять концентрацию гормонов в кровотоке в центре тела, а не в крови конечностей. Таким образом, забор крови из артерий у свободно движущихся мышей лучше всего подходит для физиологического измерения метаболизма глюкозы. Мыши не двигаются, и когда они акклиматизируются к экспериментальной среде, поворот не нужен. Тем не менее, рекомендуется использовать вертлюг, чтобы предотвратить запутывание инфузионных и пробоотборных линий. Трубки 1.2 и комплект трубок 1.4 (рис. 3А) не подходят для использования вертлюгов. Система должна быть усовершенствована, если исследователь обязан использовать вертлюг. Реинфузия клеток крови не влияет на установившееся устойчивое состояние глюкозы и инсулина в крови. Данный метод также может быть применен для метаболомических исследований с использованием изотопов. Например, если 13С-глюкоза непрерывно вводится в вену, можно измерить скорость системного метаболического оборота и внутриклеточные промежуточные метаболиты28. Таким образом, это полезный метод для анализа метаболизма глюкозы.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Ведущей инициативой для отличных молодых исследователей (MEXT); грант в поддержку научных исследований (B) (номер гранта JP21H02352); Японское агентство по медицинским исследованиям и разработкам (AMED-RPIME, номер гранта JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); Мемориальный фонд Уэхара; Фонд исследований метаболических нарушений Астелласа; Мемориальный фонд Судзукен, Фонд наук о жизни Акиямы и Фонд исследований в области нейробиологии Нарисигэ. Мы также благодарим Нура Фарехана Асгара, доктора философии, за редактирование черновика этой рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клейклей Henkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
ELISA kit (C-пептид)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Мышиный C-пептид ELISA Kit
ELISA kit (инсулин)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS Мышиный инсулин ИФА набор (U-тип)
Удобный глюкометрNipro Co.11-777Free Style Freedom Lite
Инсулин (100 ЕД/мл)Eli Lilly & Co.428021014Хумулин Р (100 ед./мл)
МышьЯпония SLC Inc.C57BL/6NCrSlcC57BL
Шовный материалNatsume seisakushoC-23S-560 No.2Стерилизованный
шприцевой насосPump Systems Inc.NE-1000
Синтетический шовный материалVÖ MELHR-17
Трубка1AS ONE Корпорация9-869-01LABORAN(R) Силиконовая трубка2
Fisher Scientific427400BD Intramedic PE
Трубка3IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.размер5Размер полиэтиленовой трубки5

Ссылки

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330(2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141(2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188(2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432(2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109(2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068(2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183(2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728(2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709(2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699(2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

Гипергликемический зажим и гипогликемический зажим у мышей в сознании
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.