Методическая статья

Отслеживание липидов de novo с помощью мечения стабильными изотопами LC-TIMS-TOF MS/MS

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65590

⸱

23 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Deparment of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Institute of Parasitology, Biology Centre CAS, 4Department of Biological Sciences, Florida International University, 5Department of Parasitology, University of South Bohemia, 6Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен метод скрининга липидных структур с помощью мечения стабильными изотопами с использованием времени их удержания, подвижности и фрагментации.

Аннотация

Липиды очень разнообразны, и небольшие изменения в структуре и составе липидов могут оказывать глубокое влияние на важнейшие биологические функции. Мечение стабильными изотопами (SIL) дает ряд преимуществ для изучения распределения, мобилизации и метаболизма липидов, а также синтеза липидов de novo . Для успешной реализации методики SIL необходимо устранить интерференции от эндогенных молекул. В настоящей работе мы описываем высокопроизводительный аналитический протокол для скрининга липидов SIL из биологических образцов; Будут показаны примеры идентификации липидов de novo во время развития яичников комаров. Использование комплементарной жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и масс-спектрометрии позволяет отделить и распределить липиды из одного образца за одно сканирование (<1 ч). Описанный подход использует преимущества последних разработок в области сбора, зависящего от данных, и сбора, независимого от данных, с использованием параллельного накопления в ловушке мобильности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, вызванной столкновением. Измерение SIL на уровне цепи жирных кислот выявляет изменения в динамике липидов во время развития яичников комаров. Структуры липидов de novo надежно присваиваются на основе времени их удержания, подвижности и характера фрагментации.

Введение

При анализе липидных данных мечение стабильными изотопами (SIL) является эффективным методом оценки метаболических путей в живых организмах. В этом методе атомы внутри анализируемого вещества заменяются стабильными изотопами, содержащими 13C или 2H. Эти изотопы в дальнейшем включаются в предшественники, которые позже встраиваются в жирные кислоты, обозначая области, в которых они находятся. С помощью этих изотопов можно идентифицировать распределение и метаболизм липидов, так как они будут контрастировать на немаркированном фоне1. Обычные масс-спектрометрические платформы не способны различать сигнал, поступающий от эндогенных молекул2. Успех SIL требует использования аналитических инструментов со сверхвысоким разрешением. Жидкостная хроматография в сочетании со спектрометрией подвижности захваченных ионов с высоким разрешением, параллельным накоплением, последовательной фрагментацией-времяпролетной тандемной масс-спектрометрией (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) позволяет разделять меченые и немеченые виды2. Преимущество анализа LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS заключается в том, что сигнал МС может быть отфильтрован по времени удержания (RT) и подвижности, что снижает потенциальную интерференцию эндогенных молекул, а также количественное определение и разделение всех желаемых веществ. В TIMS ион сначала удерживается неподвижно против газомобильной фазы, а затем высвобождается в соответствии с его подвижностью. Это обеспечивает получение мобилограмм с высоким разрешением при работе при более низком напряжении по сравнению с более ранними приборами IMS3. Мобилограммы представляют собой графики зависимости массы заряда от времени дрейфа, которые можно использовать для различения соединений на основе времени их дрейфа и величины перекрытия4.

Использование дополнительной техники PASEF значительно увеличивает скорость секвенирования без ущерба для чувствительности5. Теория PASEF предполагает накопление ионов с последующим их последовательным высвобождением в порядке их подвижности. Это делается путем накопления ионов в параллельном выравнивании по их подвижности. Накопление таким образом предотвращает потерю ионов. Кроме того, выбор ионов-предшественников происходит одновременно с накоплением и высвобождением ионов. С помощью этого метода PASEF выбирает несколько прекурсоров последовательно во время каждого сканирования TIMS, а не отдельные предшественники за сканирование, типичное для прибора TIMS, в котором не используется PASEF. Когда ионы-предшественники одновременно накапливаются и высвобождаются с пиками в 2 мс в течение сканирования TIMS с частотой примерно 100 мс на кадр, сигнал усиливается более чем на один порядок, тем самым увеличивая отношение сигнал/шум3. Дополнение PASEF к TIMS повышает эффективность MS/MS. Поскольку TIMS-PASEF связан с MS/MS, возможна более эффективная фрагментация. В отличие от обычного детектирования МС/МС, сигнал прекурсора сжимается из TIMS-PASEF, и ионы фрагментов детектируются одновременно с временем элюирования TIMS и положением подвижности ионов предшественника3.

При получении данных с масс-спектрометра существуют опции в желаемом режиме сканирования. Данные, зависимые от сбора данных (DDA) выбирают ионы-предшественники из сканирования MS1 на основе их распространенности, прежде чем фрагментировать их и выполнить сканирование MS2. Этот режим сканирования фрагментирует как можно больше предшественников. Подход DDA является целенаправленным, и результаты будут зависеть от выбора ионов3. Тем не менее, DDA-PASEF часто имеет проблемы с воспроизводимостью между репликациями. В то время как DDA является отличным инструментом для целенаправленного анализа, сложные смеси имеют большие трудности при сборе данных6. Это связано с тем, что одновременно можно контролировать только небольшое количество ионов3. Независимый сбор данных (DIA) — это метод, при котором предварительно выбранные окна m/z фрагментируются независимо от их интенсивности, и все они сканируются в диапазоне7. В этом режиме сканирования целые ионные облака передаются из IMS на масс-спектрометр3. В исследованиях протеомики это приводит к количественному определению большего количества белков за более короткий промежуток времени по сравнению с DDA. Кроме того, DIA пропускает меньше значений m/z по сравнению с DDA. Таким образом, эта альтернатива продемонстрировала значительное улучшение воспроизводимости данных в соотношении сигнал/шум и лучшую количественную оценку по сравнению с DDA. В данной работе наша цель состоит в том, чтобы реализовать DIA в методе, описанном Tose et al.2. Мы улучшили воспроизводимость и интенсивность сигналов, получив дополнительную и более убедительную информацию о мобилизации, распределении и метаболизме липидов SIL в биологических образцах, используя преимущества сбора DDA и DIA.

Протокол

1. Подготовка образцов

  1. Вскрытие насекомых
    1. Препарируйте яичники комаров Aedes aegypti в возрасте 7 дней в буферизованном фосфатом солевом растворе с помощью микроигл.
    2. Соберите восемь яичников из фосфатно-солевого буферного раствора с помощью микроигл и храните в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл при температуре -80 °C.
    3. Собирают яичники в биологические реплицы.
  2. Экстракция липидов
    1. Добавьте 10 мкл внутреннего стандарта (ISTD) в восемь собранных яичников в концентрации 1 ppm. ISTD представляет собой меченую липидную смесь с семью дейтериями 1-пентадеканоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина-D7 (15:15:0-18:1 (D7) PC), лизофосфатидилхолин-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-пентадеканоил-2-октадеценоил-глицеро-3-фосфоэтаноламин-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-пентадеканоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоинозитол-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-пентадеканоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-дипентадеканоил-3-октадеценоил-sn-глицерин (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-пентадеканоил-2-октадеценоил)-sn-глицерин-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-октадеценоил-sn-глицерин-D7 (18:1 MAG (D7)), холестерилолеат-D7 (18:1 (D7) хольный эфир).
    2. Подождите, пока высохнет при комнатной температуре. Добавьте 100 μL бутанола/метанола и 3 μL бутилированного гидрокситолуола. Гомогенизируйте вручную в течение 10 с с помощью полипропиленовых пестиков объемом 1,5 мл.
    3. Промойте пестик 200 μл бутанола/метанола и соедините с гомогенизированным раствором.
    4. Пробирку микроцентрифуги облучать ультразвуком при комнатной температуре и средней мощности в течение 30 минут.
    5. Центрифужные пробирки при давлении 1600 x g в течение 10 мин при 20 °C. Переложите надосадочную жидкость в флакон автосамплера с 300 мкл вставок из силанизированного стекла.

2. Настройка прибора

  1. Подготовка к мобильной фазе
    1. Приготовьте подвижную фазу с композицией 30:40:30 (подвижная фаза А) и 10:5:85 (подвижная фаза В) с использованием ацетонитрила, воды и изопропанола в соответствующей пропорции. В обеих подвижных фазах добавьте 10 ммоль/л формиата аммония в воду и 0,1% муравьиной кислоты для создания буферного состояния.
    2. Развесьте 3,15 г формиата аммония в 10 мл воды. Добавьте 500 мкл этого раствора в 12,5 мл воды. Последовательно поместить в мерную колбу объемом 250 мл и заполнить изопропанолом примерно до 2/3 колбы. Перемешайте, перемешивая.
    3. Добавьте 250 мкл муравьиной кислоты (85%), заполните 25 мл ацетонитрила и изопропанола до 250 мл и перемешайте.
  2. В системе МС в левой части экрана в настройках МС определите диапазон масс, выбрав 50 в качестве минимальной и 1850 в качестве максимальной настройки сканирования.
    1. Выберите Полярность в качестве режима положительных ионов. Выберите режим сканирования DIA-PASEF. Для этого выберите Настройка и откройте метод анализа из предыдущего метода DDA со следующими параметрами LC.
      1. Для градиентного разделения:
        Ввод образца: 0% B, время выдержки 1 мин.
        Увеличьте до 55% B, держите до 6,4 мин.
        Увеличьте до 65% В, держите до 24 мин.
        Увеличьте до 88% В, держите до 40,8 мин.
        Увеличьте до 95% B, удерживайте до 48,1 мин.
        Уменьшите до 35% В, держите до 56 мин.
        Уменьшите до 0% В, держите до 60 мин.
      2. Для условий ВЭЖХ:
        Объем впрыска: 5 μл
        Расход растворителя: 0,25 мл/мин
        Общее время выполнения: 60 мин, из которых 5 мин отведено на предварительную подготовку колонны.
      3. Подготовьте жидкостный хроматограф, вставив колонку в жидкостный хроматограф. Запустите холостую очистку колонки и проверьте ее на герметичность. Это видно по тому, что прибор не держит давление или поток.
  3. Чтобы создать новый метод, выполните описанные ниже действия (Рисунок 1 и Рисунок 2).
    1. Откройте программу и нажмите « Подключить все инструменты». Если подключение прошло успешно, система LC подаст звуковой сигнал один раз, и на экране управления HyStar будет указан в поле «Состояние» без каких-либо сообщений об ошибках.
    2. Перейдите на вкладку «Приобретение ». В навигаторе примеров таблиц найдите раскрывающееся меню тегов и выберите предыдущий метод.
    3. Удвойте последний образец таблицы. Нажмите на кнопку Сохранить как... и сохраните новый список образцов в формате: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX), где (XXXX) - это краткое описание анализа.
    4. Щелкните правой кнопкой мыши по методу разделения и выберите «Редактировать метод». Нажмите на Редактировать метод модуля.
    5. Нажмите « Скачать». В случае успеха появится всплывающее окно «Загрузка успешна». Закрытие экрана без сохранения методом.
    6. В настройках MS перейдите в настройки TIMS, выберите начало 1/k0 на 0.70 и окончание 1/k0 на 1.85. Установите время нарастания на 150 мс. При этом рабочий цикл и скорость нарастания автоматически регулируются.
    7. В нижнем окне выберите вкладку «Источник ». Выберите тип источника ESI и установите смещение торцевой пластины на 800 В, а капилляра на 4500 В. Проверьте коробку небулайзера и установите давление на 4,0 бар. Установите сухой газ на 4,0 л/мин, а температуру сухого на 250 °C.
    8. Справа от вкладки источника выберите вкладку Настройка. Перейдите на вкладку « Общие » и под заголовком переноса укажите следующие параметры:
      Прогиб 1 дельта: 70 В
      Воронка 1 РФ: 250 vpp
      Энергия isCID: 0 эВ
      Воронка 2 RF: 250 vpp
      Мультипольный РЧ: 500 vpp.
      1. Под заголовком ячейки столкновения убедитесь следующие параметры:
        Энергия столкновения: 6,0 эВ
        Коллизия RF: 1200 vpp.
      2. Под заголовком квадруполь обеспечивают следующие параметры:
        Энергия ионов: 6 эВ
        Малая масса: 250 м/з.
      3. Под фокусом вкладка pre-TOF убедитесь в следующих параметрах:
        Время переноса: 45 μс
        Хранение до импульсов: 5,0 μс.
    9. Перейдите на вкладку Подраздел обработки . При обнаружении пиков масс-спектров обеспечиваются следующие параметры:
      Абсолютный порог: 667
      Абсолютный порог (за 100 мс AccuTime): 445.
      1. При обнаружении пиков подвижности обеспечиваются следующие параметры:
        Абсолютный порог: 30.00.
    10. Перейдите на вложенную вкладку TIMS . На вкладке «Смещения» убедитесь в следующих параметрах:
      Δt1: -20 В
      Δt2: -150 В
      Δt3: 70 В
      Δt4: 150 В
      Δt5: 0 В
      Δt6: 150 В
      Коллизионная ячейка: 300 В.
    11. Справа от вкладки мелодии щелкните вкладку MS/MS . На вкладке «Ионы-прекурсоры» убедитесь в следующих параметрах:
      Количество пандусов PASEF: 8
      Минимальная зарядка: 1
      Заряд максимальный:1.
      1. На вкладке планирования нажмите Дополнительно и убедитесь в следующих параметрах:
        Интенсивность: 0,1500, 5000, 10000
        Повторение: 1, 10, 5, 1
        Порог интенсивности: 1500.
      2. На вкладке «Активное исключение» убедитесь в следующих параметрах:
        Галочка активного исключения
        Высвобождение через: 0,4 мин.
      3. В разделе Настройки энергии столкновений необходимо обеспечить следующие параметры:
        K0 (В-с/см3): 0,70, 1,60
        Энергия столкновения (эВ): 20.00, 35.00.
      4. В настройках ширины изоляции убедитесь следующие параметры:
        Масса (м/з): 622, 1222
        Ширина (м/з): 1.00 2.50.
    12. Настройка DIA -PASEF: Выберите DIA-PASEF в режиме сканирования настроек MS слева. На вкладке MS/MS выберите «Редактор окон». Здесь убедитесь в следующих параметрах (рисунок 3):
      Настройки окна: Массовая ширина: 50 Да; Перекрытие массы: 0,0 Да; Расчет от полигона: масса шагов; Количество окон мобильности: 1.

3. Калибровка

  1. Калибровка прибора (Рисунок 4)
    1. На подвкладке «Калибровка » нажмите на m/z, выберите «Настройка микса » в выпадающем списке и нажмите «Калибровка» в правом нижнем углу.
    2. Продолжайте нажимать кнопку Калибровка, пока не будет достигнут показатель 100 %.
    3. Теперь выберите вкладку «Мобильность » и выполняйте те же действия, что и выше, пока не будет достигнут 100% показатель калибровки.
  2. Калибровочная кривая
    1. Спайкнуть внутреннюю липидную стандартную смесь с 10 мкл дейтерированной внутренней стандартной смеси.
      Используйте семь точек калибровки от 0,1 до 500 нг/мл стандартной смеси с 10 мкл дейтерированной внутренней стандартной смеси.
    2. Вручную аннотируйте цепи жирных кислот на основе шаблонов PASEF MS/MS, уже описанных впункте 2.
  3. Эффективность маркировки SIL
    1. Рассчитайте отношение площади изотопов, содержащих SIL, к площади изотопов, не содержащих SIL.
    2. Вычислите теоретическую траекторию, определив вероятность нахождения помеченного атома в любом месте.
    3. Рассчитайте обогащение SIL, сопоставив экспериментальные профили изотопов с теоретической картиной, смоделированной в программном обеспечении для анализа данных.
  4. Начало пробега
    1. Активируйте колонную духовку, нажав кнопку «Термометр ». Активируйте насосы, нажав кнопку Valve .
    2. Установите метод MS на метод, сохраненный ранее. Убедитесь, что объем инъекции составляет 5 мкл, а линия 1 будет нацелена на флакон 20:1.
    3. Убедитесь, что флакон 20:1 содержит 50% IPA/ACN. Сохраните список образцов.
    4. Запустите последовательность и убедитесь, что инъекция выполнена успешно (что подтверждается сообщением, отображаемым на системе о том, что инъекция выполнена).
    5. Скопируйте строку 1 и вставьте ниже, чтобы создать новую строку. Заполняйте линию 2 образцами в зависимости от текущего эксперимента. Убедитесь, что используется правильное положение в автосамплере.
    6. Если подвижная фаза свежая, сначала проведите испытание пиковой формы, вводя стандарты липидной смеси от производителя. Сравните с предыдущими результатами. 2 Стандарты представляют собой липидную смесь 1-пентадеканоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (15:0-18:1 ПК), лизофосфатидилхолина (18:1 Lyso PC), 1-пентадеканоил-2-октадеценоил-глицеро-3-фосфоэтаноламин (15:0-18:1 ПЭ), 1-олеоил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (18:1 Lyso PE), 1-пентадеканоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоинозитол (15:0-18:1 PI), 1-пентадеканоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин (15:0-18:1 PS), 1,2- дипентадеканоил-3-октадеценоил-sn-глицерин (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-пентадеканоил-2-октадеценоил)-sn-глицерин (15:0-18:1 DAG), 2-октадеценоил-sn-глицерин (18:1 MAG), холестерилолеат (18:1 холовый эфир).
    7. Убедитесь, что для новых линий используется правильный метод разделения, а не метод предварительной подготовки, используемый в строке 1. Убедитесь, что метод MS верен (метод текущего дня).
    8. Убедитесь, что загружен правильный метод обработки и что включен параметр «Запустить автоматизированный процесс ».
    9. Сохраните список образцов, чтобы убедиться, что образцы будут проанализированы после завершения текущего прогона.

4. Анализ данных

  1. Программное обеспечение для анализа открытых данных (рисунок 5). В левом верхнем углу нажмите кнопку «Файл » и выберите «Открыть...».
  2. Выберите нужные файлы. Щелкните правой кнопкой мыши имя файла и выберите «Свойства».
    1. Выберите Calibration Status (Статус калибровки ) (Рисунок 6). В выпадающем списке выберите «Начальная калибровка » для масс-спектрометра. Убедитесь, что все ошибки имеют значение менее 1 ppm.
    2. Затем выберите Initial Mobility Calibration (Начальная калибровка мобильности ) и убедитесь, что погрешность составляет менее 1 ppm.
    3. Щелкните правой кнопкой мыши на Хроматограмме и выберите Редактировать хроматограмму (Рисунок 6C). В поле «Тип» нажмите на раскрывающийся список и выберите «Хроматограмма экстрагированных ионов » (рисунок 6D). В разделе фильтр выберите Все MS и в режиме сканирования выберите Все. Это необходимо для просмотра пиков интересующей молекулы, а не только ее фрагментов.
      1. Ниже приведены два варианта фильтра для выбора молекул: «Массы» или «Формула». Если выбрано значение Masses , то можно выбрать теоретическое m/z интересующих молекул. Для этого случая выберите 829.7985 м/з. Если выбран параметр Формула , то можно выбрать формулу для молекулы, а также ионные формы, представляющие интерес для хроматограммы. В этом случае выберите аммоний [M+NH4]. Это связано с аммониевым буфером в подвижной фазе, который будет способствовать ионизации в этой ионной форме (рис. 7).
      2. Для ширины выберите ±1. Для полярности убедитесь, что она поддерживает положительный режим. В разделе Мобильность выберите 1.455-1.465. Это делается для того, чтобы отфильтровать любые молекулы, которые не попадают в эти значения, и изолировать интересующую молекулу.
  3. Выбрав параметры, нажмите «Добавить» > «OK » в правом верхнем углу. Через короткий промежуток времени программное обеспечение обработает выделения и выведет хроматограмму.
  4. Щелкните правой кнопкой мыши на базовой линии в начале интересующего пика и перетащите, удерживая его до конца пика. Эта ручная интеграция обеспечит массовый спектр фрагментов в реальном времени в течение этого времени хранения.
  5. Мобилограмма
    1. Щелкните правой кнопкой мыши в левой части экрана на Mobilogram и выберите Edit Mobilogram (Рисунок 8). Появится окно с именем «Редактировать трассы мобилограммы». Выполните те же действия, что и с C.e.i.1 по C.e.i.5 (рисунок 9).
    2. В поле Время удержания введите время хранения пика интереса. В этом случае 37.45-37.55 мин.
    3. Выбрав параметры, нажмите «Добавить» > «OK » в правом верхнем углу. Через короткий промежуток времени программное обеспечение обработает выделения и выведет хроматограмму.
  6. Для извлеченных ионов повторяйте шаги 4.2.3.1-4.3.2.2 до тех пор, пока не будет сформирован список ионов.
  7. В нижней части окна MS выберите Profile MS и Fragment MS. Это позволит получить спектральный вид ионов из полного сканирования и PASEF.
    1. В окне просмотра спектра щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Копировать составные спектры». С помощью спектральных данных, которые отображаются справа, можно найти дополнительную информацию о своем соединении, такую как разрешение, разрешающая способность, интенсивность и отношение сигнал/шум (S/N; Рисунок 10).
  8. Обработка
    1. Чтобы обработать данные, вручную интегрируйте хроматограмму и пики подвижности, чтобы получить ценную информацию об интересующей молекуле (рис. 10).
    2. Щелкните правой кнопкой мыши Найти и выберите Интегрировать только хроматограмму или мобилограмму (Рисунок 11). Щелкните левой кнопкой мыши и выделите нужную вершину. Эта информация включает в себя время хранения, площадь, S/N и мобильность.

Результаты

Мечение стабильных изотопов облегчает визуализацию триглицеридов в исследованиях динамики липидов самок яичников комаров. В области 2D-подвижности триглицерид 48:1 отображается в области с определенным временем удержания по отношению к подвижности 1/K0. Интенсивность триглицеридов можно визуализировать по более темной синей линии. Другие пятна представляют собой дополнительные триглицериды, обнаруженные в яичнике. Время удержания и подвижность варьируются из-за различий в массах и структурах, поэтому проявляются в разных областях графика. Эти различия являются ключевыми при различении триглицеридов в образце (рис. 12A, B). Усиленная проекция масс-спектра области показывает триглицерид-ион 48:1, соединенный с ионом аммония со скоростью 822 м/з. Другие триглицериды, такие как 50:2 и 52:3, также визуализируются, но в более высоких m/z областях из-за различий в структуре, размере и фрагментации (рис. 12C, D). В этом примере нас интересовал анализ меченых дейтерием изотопов. Область для TG 48:1 была дополнительно амплифицирована для визуализации изотопно меченных ионов. По мере увеличения количества дейтерия на ионе интенсивность пика уменьшается. Это происходит из-за того, что наблюдается более низкое количество ионов, меченных дейтерием. Соотношение m/z немного увеличивается с каждым добавлением дейтерия из-за увеличения массы. Эти интенсивности в дальнейшем будут определять количество каждого изотопа, присутствующего в образце.

При оценке интенсивностей фрагментов в масс-спектре необходимо сравнивать немеченые изотопы с изотопами с мечеными 2Н (рис. 12Е). Синим цветом обозначена необозначенная интенсивность с пунктирными черными линиями в качестве теоретической интенсивности. Красным цветом обозначены результаты, помеченные изотопами. Они демонстрируют большую интенсивность, чем необозначенная и теоретическая интенсивности. Обогащение видов изотопным мечением дает большую интенсивность, чем немеченые теоретические виды. Более высокие интенсивности позволяют визуализировать триглицериды из-за расхождений по районам. Фрагментация также играет ключевую роль в идентификации липидов, так как PASEF обеспечивает повышенную фрагментацию по сравнению с полным сканированием MS/MS. Это связано с тем, что жирные кислоты в липидных цепях могут фрагментироваться в различных формах, поэтому линии в спектрах показывают интенсивность фрагментов, основанную на процессе фрагментации триглицеридов (рис. 12F). Это дает структурную информацию о жирных кислотах и помогает установить, какой изомер вещества присутствует. При анализе данных метода DIA количество фрагментов будет увеличиваться, что приведет к лучшему сканированию MS/MS и лучшей идентификации по сравнению с типичным методом DDA.

figure-results-1
Рисунок 1: Типичный домашний экран программного обеспечения. На главном экране можно создать метод и запустить прибор. (A) Экран программного обеспечения, содержащий настройки управления TIMS и MS/MS. В нижней части экрана находится вкладка «Источник» для редактирования элементов управления на приборе. (B) Экран программного обеспечения с открытой вкладкой настройки. (В) Здесь можно подготовить инструмент к общей настройке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Экран программного обеспечения с открытой вкладкой tune. Здесь можно отредактировать параметры настройки обработки. (A) Экран программного обеспечения с открытой вкладкой настройки. Здесь можно редактировать параметры настройки для части инструмента TIMS. (B) Экран программного обеспечения с выбранной вкладкой MS/MS в нижней части экрана. (C) Здесь можно редактировать параметры для тандемного масс-спектрометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Экран для выбора ширины окна DIA-PASEF. Здесь можно редактировать цвета для обилия, а также редактировать размер окон для сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Калибровка масс-спектрометра по отношению массы к заряду (м/з). Для калибровки выбирается референс-лист. (A) В правом нижнем углу нажимается кнопка «Калибровать » до тех пор, пока не появится приемлемое значение. Калибровка спектрометра ионной подвижности по подвижности. Для калибровки выбирается референс-лист. (B) В правом нижнем углу нажимается кнопка «Калибровать » до тех пор, пока не появится приемлемое значение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Типичный домашний экран для программного обеспечения для анализа данных. Чтобы открыть файл, нажмите верхнюю левую кнопку «Файл », чтобы появилось выпадающее окно с опциями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Программное обеспечение для анализа данных. Экран программного обеспечения, подтверждающий успешную калибровку, с помощью (A) выбора результатов калибровки и (B) выбора категории калибровки. (C) Выбор хроматограммы для анализа и (D) Выбор экстрагированной ионной хроматограммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Всплывающий экран. Всплывающее окно для выбора и извлечения ионной хроматограммы с помощью (А) масс-фильтра и (В) фильтра формулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Программное обеспечение для анализа данных. На экране программного обеспечения, где слева выбрана мобилограмма для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Всплывающий экран для мобилограммы. Всплывающее окно для выбора мобилограммы экстрагированных ионов с помощью (А) массового фильтра и (В) фильтра формулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10
Рисунок 10: Экран анализа данных. (A) Экран программного обеспечения; Выделенный слева можно сформировать список извлеченных ионов. (B) Экран для анализа данных, на котором на дне получается сложный спектр из извлеченных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-11
Рисунок 11: Экран анализа данных. Программный экран, демонстрирующий результаты ручного интегрирования сложных спектров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-12
Рисунок 12: Результат LC-TIMS MS. (A) LC-TIMS MS через 4 дня после кормления2-меченой H-меченной сахарозой и яичники насекомых можно увидеть в области 2D-мобильности. (B) Типичные проекции MS для сигнала, соответствующего TG 48:1, TG 50:2 и TG 52:3 из маркированного образца. (C) Усиленная область MS 822 - 827 m/z, обозначающая обозначенный профиль TGs. (D) Обратите особое внимание на пики МС, выделенные красным цветом, в которых усилен профиль изотопа. (Э-Ж) Меченый профиль изотопа 2H выделен красным цветом; Ниже немаркированные профили изотопов выделены синим цветом. Теоретические профили изотопов обозначены пунктирными линиями (13C черным цветом; 2H зеленым цветом). Потенциальная структура триглицерида 48:3 также показана в правом верхнем углу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

При оценке использования этого протокола важно убедиться, что параметры DIA-PASEF и MS/MS применимы к рассматриваемым триглицеридам. В частности, окна мобильности и ширина окон должны соответствовать схеме триглицеридов. Это можно определить с помощью предыдущего прогона с помощью метода DDA. При отслеживании триглицеридов во внутреннем стандарте окна для создания DIA должны охватывать все предварительно идентифицированные молекулы, представляющие интерес. Все окна должны быть одинакового размера, а диапазоны должны находиться в пределах m/z и 1/k0 от желаемых соединений (рис. 7). При неправильном определении размеров окон ионы, которые должны быть фрагментированы, будут пропущены, и спектры выхода будут иметь меньшую воспроизводимость. По сути, без надлежащей оптимизации диапазона окон в липидомике, результаты DIA не улучшат данные DDA. Окна должны представлять собой ступенчатую форму для процесса сбора данных. Если это не так, то параметры в настроенном окне DIA-PASEF должны быть изменены таким образом, чтобы они отражали полный липидный профиль. Без этого шага критические жирные кислоты будут исключены из полученных данных.

Инструментальные ограничения включают в себя в основном те, которые связаны с методами ЖХ-МС. Это включает в себя ограничения мультиплексирования по максимальной ширине. Следовательно, должна быть проведена оптимизация пикового элюирования для получения соответствующей количественной оценки, способствующей селективности во время сбора данных. Как правило, это происходит с выбранными прекурсорами, такими как DDA. Однако при использовании DIA прекурсоры не выбираются, что может привести к ограничению инструментальной селективности8. Несмотря на то, что методы DIA обеспечивают повышенную фрагментацию, все же существуют ограничения. Наиболее заметным ограничением является снижение селективности прекурсоров. Окна для метода DIA в 5-10 раз шире, чем при типичном методе DDA. Следовательно, обеспечивая большую фрагментацию, он может сократить рабочий цикл и серийное приобретение. Это можно наблюдать в масс-спектрометрах, в которых используется ступенчатый квадруполь. Поскольку нет выбора предшественников и того, какие ионы должны быть фрагментированы, окна статической изоляции последовательно перебираются, чтобы покрыть m/z окно. Поскольку окно намного больше, чем при типичном методе DDA, необходимо использовать более широкие диапазоны, чтобы попытаться получить чувствительность9. Таким образом, проблема серийного сбора данных снижает чувствительность. Второе ограничение связано с генерацией библиотек. Это занимает много времени и требует большого количества образцов для формулирования. Несмотря на то, что можно использовать внешние библиотеки, шаблоны фрагментации могут различаться в зависимости от условий эксперимента и приборов10.

При анализе липидных данных с помощью мечения стабильными изотопами необходимо свести к минимуму интерференцию от других молекул, обнаруженных в организме. Это делается с помощью инструментов анализа с высоким разрешением, таких как LC-TIMS-TOF-MS/MS2. В настоящее время использование этих инструментов с высоким разрешением для отделения меченых изотопов от фонового шума все еще является очень новым по сравнению с традиционными методами. Традиционные инструментальные соображения реализуют разделение с помощью газовой хроматографии с последующей химической или электронной ионизацией. Это позволяет либо получить химическое образование с помощью пентафторбензилбромида, либо фрагментацию в результате ионизации электронов. Именно в последнее время ЖХ-МС используется в изотопных исследованиях. Использование масс-спектрометров с высоким разрешением обеспечивает высокую точность по массе и возможность проводить многоиндикаторные исследования с использованием нескольких изотопных меток, а не одного изотопа. Без высокого разрешения прибора невозможно было бы различать различные степени маркировки, такие как 13С2 и 13С. Это позволяет получить больше информации за один прогон по сравнению с традиционными приборами с более низким разрешением10.

В то время как DIA имеет лучшую воспроизводимость, чем DDA, другие новые методы сбора данных могут сравниться. Гибридные стратегии DIA-DDA, такие как p-SMART, способны объединить сильные стороны каждого метода для обеспечения высокого качества обнаружения и количественной оценки, сохраняя при этом высокий уровень целенаправленного качественного анализа. В этом методе использование одного согласованного иона продукта может увеличить чувствительность и селективность DIA, поскольку это сужает окна DIA по сравнению с широким нецелевым подходом8. При липидомике структура триглицерида может изменяться в зависимости от изомерной структуры. PASEF позволяет визуализировать различные модели фрагментации, улучшая идентификацию видов2. При использовании DIA-PASEF повышенная фрагментация дает информацию о изомерах как о большом количестве фрагментов, аналогично другим, которые обычно не могут быть разрешены из-за ограничений метода DDA. Эта информация дает данные о том, какие жирные кислоты присутствуют в яичниках комаров. Этот метод может быть применен к другим исследованиям липидов de novo на различных организмах.

Раскрытие информации

Мэтью Уиллеттс и Мелвин А. Парк являются сотрудниками компании Bruker Daltonics Inc, производителя коммерческого инструмента timsTOF. Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность доктору Сезару Рамиресу за его вклад в разработку метода. Это исследование финансировалось грантами NIAID R21AI167849 FGN, проект 22-21244S от Чешского научного фонда, Чешская Республика до Миннесоты.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Accucore C30 columThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Compass Анализ данныхBruker Daltonics Inc2363525870версии 5.2
d-глюкоза-13C6Sigma-Aldrich 
пробирки eppendorfFisher Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
стеклянные флаконыThermo Fisher Scientific11-417-236
тяжелая вода (2H2O)Sigma-Aldrich 1.13366
полипропиленовые пестикиFisher ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE сверхбыстрый жидкостный хроматографShimadzuL20234651907
вставки из силанизированного стеклаThermo Fisher Scientific03-251-826
Sucrose-13C12Sigma-Aldrich 
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
Стандарт калибровки смеси для настройкиAgilent Technologies36
389374605417

Ссылки

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
  3. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  4. Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
  5. Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  6. Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
  7. Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  8. Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
  9. Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
  10. Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).

Перепечатки и разрешения

Теги

de novo
Отслеживание липидов de novo с помощью мечения стабильными изотопами LC-TIMS-TOF MS/MS
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.