Производство и оптимизация LTE, бесклеточной системы экспрессии белка, полученной из Leishmania tarentolae , для производства рекомбинантных белков

Краткое содержание

Leishmania Translational Extract (LTE) представляет собой эукариотическую бесклеточную систему экспрессии белка, полученную из одноклеточного паразита Leishmania tarentolae. Этот оптимизированный протокол делает LTE простым и экономичным в производстве. Он подходит для различных приложений, ориентированных на многопараллельную экспрессию и изучение сложных эукариотических белков и их взаимодействий.

Аннотация

Этот протокол описывает производство и оптимизацию эукариотической системы экспрессии бесклеточных белков (CFPS), полученной из одноклеточного жгутиконосца Leishmania tarentolae, называемого трансляционным экстрактом Leishmania или LTE. Хотя этот организм изначально эволюционировал как паразит гекконов, его можно легко и недорого выращивать в колбах или биореакторах. В отличие от Leishmania major, она непатогенна для человека и не требует специальных лабораторных предосторожностей. Еще одним преимуществом использования Leishmania для CFPS является то, что добавление одного антисмыслового олигонуклеотида к CFPS, нацеленного на консервативную последовательность лидера сплайсинга на 5'-конце всех белок-кодирующих РНК, может подавлять экспрессию эндогенных белков. Мы предоставляем процедуры для разрушения клеток и обработки лизата, которые были упрощены и улучшены по сравнению с предыдущими версиями. Эти процедуры начинаются с простых колбовых культур. Кроме того, мы объясняем, как вводить генетическую информацию с помощью векторов, содержащих видонезависимые сайты инициации трансляции (SITS), и как выполнять прямую оптимизацию партии и контроль качества для обеспечения стабильного качества экспрессии белка.

Введение

В 1960-х годах внеклеточные системы экспрессии белков сыграли ключевую роль в раскрытии генетического^кода. Тем не менее, прокариотические системы экспрессии бесклеточных белков, в основном основанные на E. coli, в настоящее время доминируют как в лабораторных, так и в коммерческих приложениях. В то время как системы на основе E. coli обладают такими преимуществами, как экономическая эффективность, масштабируемость и высокая экспрессия, они сталкиваются с проблемами при производстве многодоменных белков в их активных формах и облегчении сборки белковых^{комплексов2,3}. В настоящее время широко используемые формы синтеза эукариотического бесклеточного белка (CFPS) включают экстракт зародышей пшеницы (WGE), лизат ретикулоцитов кролика (RRL) и лизат клеток насекомых (ICL)^4,5,6. В этой работе представлена альтернативная эукариотическая бесклеточная система, которая является одновременно простой и масштабируемой, основанной на одноклеточном жгутиковом паразите Leishmania tarentolae.

Leishmania tarentolae можно легко культивировать в колбах с использованием экономичных сред, а также масштабировать в биореакторах для достижения более высокой плотности клеток. Присутствие эндогенных мРНК в клеточном лизате, которые в противном случае могли бы конкурировать с введенными сообщениями, может быть нейтрализовано с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на консервативную последовательность лидера сплайсинга мРНК Leishmania⁷. В отличие от своего близкого родственника Leishmania major, который вызывает заболевания человека, L. tarentolae инфицирует мавританского геккона (Tarentolae mauritanica), что делает его пригодным для выращивания в лабораторных условиях PC2 без необходимости специальных мер предосторожности. Ранее он использовался в качестве трансгенного организма для экспрессии белка in vivo⁸.

Для облегчения прайминга матриц в бесклеточных системах были разработаны универсальные последовательности на основе полимерных структур РНК, которые усиливают трансляционную инициацию⁹. Эти видонезависимые трансляционные последовательности (SITS) применимы как к прокариотическим, так и к эукариотическим бесклеточным системам и подходят для введения генетической информации в LTE. Хотя этот протокол не дает подробного объяснения построения векторов для экспрессии внеклеточного белка LTE, для оптимизации и контроля качества требуются подходящие векторы, содержащие флуорофорные слияния желаемых белков, представляющих интерес, ниже по течению от сайта SITS. С этой целью в репозиторий генов Addgene были депонированы соответствующие векторы LTE, такие как вектор pCellFree_G03, который кодирует N-концевое слияние eGFP с желаемым белком, представляющим интерес, с использованием сайтов клонирования Gateway.

LTE доказал свою ценность в широком спектре применений, требующих экспрессии белков, включая анализ самосборки белка^10,16, производство интегральных мембранных белков человека¹⁷, исследования кандидатов в противовирусные препараты¹⁸, разработку биотехнологически полезных ферментов¹⁹, прототипирование белковых биосенсоров^20,21 и изучение биологических препаратов из анкилостомозов²². LTE также сыграл важную роль в картировании сетей белок-белковых взаимодействий в области вирусологии и клеточных структур^21,32. Было проведено исследование LTE, которое показало схожие с другими эукариотическими бесклеоточными системами экспрессии полноразмерных, монодисперсных и неагрегированных белков³³, обеспечивая при этом более экономичное и масштабируемое производство.

Этот протокол предусматривает методы культивирования и разрушения организма хозяина, получения лизата и добавления питательного раствора (ФС) для сопряженной экспрессии транскрипционного/трансляционного белка. Кроме того, он включает в себя протокол оптимизации производственных партий. В первоначальном варианте бесклеточной системы Leishmania наблюдались нежелательные вариации от партии к партии в уровнях экспрессии, доле полноразмерных белков и наличии белковых агрегатов, что приводило к утилизации партий³⁴. Для решения этой проблемы были внесены последующие усовершенствования протокола²⁵. Текущий протокол основан на этих улучшениях, позволяя оптимизировать отдельные партии для максимальной экспрессии и размера белка. Это достигается за счет тщательного контроля нагрузки на разрушитель ячеек (измеряется как оптическая плотность на длине волны 600 нм; наружный диаметр_{600 нм}) и нормализация результирующего выхода лизата с использованием абсорбции при длине волны 280 нм (Abs_{280 нм}). Кроме того, он включает в себя метод частичного добавления в лизат rNTP и магния в процессе производства с последующей оптимизацией компонентов этого исходного раствора во время тестовых экспрессий. Хотя такая оптимизация представлена в протоколе как вариант, авторами она настоятельно рекомендуется.

Протокол

Этот протокол включает в себя подробные рецепты сред и этапы, которые включают культивирование, центрифугирование, измерение флуоресценции GFP с помощью многорежимного планшетного ридера, измерение наружного диаметра культуры_{600 нм} и оценку лизата Abs_{280 нм}. Он также охватывает настройку и визуализацию белковых гелей SDS-PAGE. Материалы, необходимые или предлагаемые для этого протокола, перечислены в таблице «Материалы». Важно отметить, что типичные лабораторные ресурсы, такие как компоненты среды, центрифуги, пробирки, спектрофотометры и установки для гель-электрофореза, скорее всего, могут использоваться взаимозаменяемо, если не указано иное. На рисунке 1 представлена краткая информация о производственном процессе LTE.

Рисунок 1: Обзор производственного протокола LTE. В этом мультфильме представлено краткое изложение протокола производства LTE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Рост культур Leishmania tarentolae

1. Приготовьте не менее 3 л питательной среды TBGG (бактотриптон 12 г/л, экстракт дрожжей 24 г/л, глицерин 8 мл/л, глюкоза 1 г/л, KH₂PO₄ 2,3 г/л, K₂HPO₄ 2,5 г/л, см. Таблицу материалов). Стерилизуйте фильтр с помощью фильтра 0,22 мкм под вакуумом или аналогичной установкой.
2. Храните среду при комнатной температуре (RT), с окончательными добавками (гемин, антибиотики), добавленными непосредственно перед посевом L. tarentolae. Гемин (0,25% v/v в 50% триэтаноламина) добавляется в дозе 0,2% v/v, пенициллин (10 000 ЕД/мл) плюс стрептомицин (10 000 мкг/мл) в смеси 0,5% v/v.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отправной точкой этого протокола является поддерживаемая культура 2 x 10 мл дикого типа L. tarentolae. Поддерживающие культуры выращивают при температуре 27 °C в стандартных колбах для тканевых культур объемом 50 мл с низким встряхиванием (75 об/мин). Такие культуры в 10 мл можно поддерживать неограниченное время с разведениями ~1/20 в стерильных (TBGG + гемин, пенициллин, стрептомицин) каждые 2-3 дня. Рекомендуется использовать стандартный шкаф биобезопасности в лаборатории PC2; тем не менее, бактериальные загрязнения, как правило, предотвращаются добавлением антибиотиков, в то время как грибковые загрязнения обычно перерастают L. tarentolae.
3. В течение двух дней увеличьте поддерживающие культуры L. tarentolae до 200 мл (день 1), а затем до 2 л (день 2) с помощью разведений 1:10 с увеличением объема TBGG + гемин/антибиотики каждый день. Выполните оба разведения в стерилизованных автоклавом стеклянных колбах объемом 5 л (заполненных максимум до 1 л). Второе разведение должно произойти во второй половине дня между 3 и 6 часами вечера, с намерением начать производство лизата на следующий день между 8 и 11 часами утра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется минимальный начальный объем для производства LTE (2 x 1 л культур). Также возможно расширение культуры до 10 л для производства LTE путем включения дополнительной ступени расширения (например, День 1: 100 мл; День 2: 1 л; День 3: 10 л). Хотя в этом протоколе для выращивания L. tarentolae используются колбы с перегородками (см. Таблицу материалов), опционально можно использовать обычные биореакторы, предназначенные для роста бактерий с крыльчатками Раштона, при условии, что скорость перемешивания поддерживается ниже 100 об/мин. Улучшенная аэрация и контроль pH в биореакторах, как правило, удлиняют логарифмический рост культур L. tarentolae, что позволяет использовать более высокий наружный диаметр урожая_{600 нм} 10 на этапе 1.4.
4. Запишите наружный диаметр_{600 нм} культуры в трех экземплярах путем разведения в соотношении 1:10 в TBGG непосредственно в кювете спектрофотометра. Подходящий стартовый диапазон для изготовления лизата – наружный диаметр_{600 нм} = 4,0-8,0.
5. Обеспечьте дополнительное время инкубации, если наружный диаметр_{600 нм} < 4.0. Культура с наружным диаметром_{600 нм} > 8 пригодна для использования и приведет к получению большего объема бесклеточного лизата экспрессии, но с более низким качеством из-за наступления фазы позднего логарифмического роста. Поместите колбы с культурой на лед, ожидая последующих действий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точное измерение конечного наружного диаметра_{культуры 600 нм} имеет решающее значение, поскольку он используется для расчета конечного объема для концентрированных клеток до разрушения. Этот расчет заменяет метод взвешивания гранул, использовавшийся в более ранних версиях производства LTE для калибровки концентрации элементов до нарушения³⁴, с целью упрощения протокола. Убедитесь, что для измерения наружного диаметра_{600 нм} необходимо разбавить TBGG, так как в противном случае осмотический удар изменяет форму ячейки, вызывая погрешность измерения. Пипетка смешивает разведение 1:10 для измерения наружного диаметра_{600 нм} (непосредственно в кювете) за несколько секунд до проведения спектрофотометрического считывания, поскольку клетки L. tarentolae быстро оседают с характерным мутным видом. Если конечный объем сцеживаемой культуры считается приблизительным, также рекомендуется взвешивание колб при сборе урожая (с подходящей пустой тарой из колбы) для получения лучшего расчетного объема (при 1 г = 1 мл). Максимально возможный наружный диаметр_{600 нм} от роста L. tarentolae в перегородках составляет 15-20, хотя это нецелесообразно для производства лизата из-за достижения стационарной фазы.

2. Концентрация культур L. tarentolae

1. Клетки Leishmania должны быть промыты и сконцентрированы примерно в 60 раз до разрушения. Рассчитайте целевой объем для концентрации клеток на основе наружного диаметра_{600 нм} = 300 для конечного концентрата. Уравнение выглядит следующим образом: V = объем урожая (мл) x (наружный диаметр_{урожая 600 нм/}300). Например, при использовании культуры объемом 2 л с урожаем OD₆₀₀ = 5 целевой объем составляет 33 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель наружного диаметра_{600 нм} 300 может быть изменена; Предыдущее производство LTE использовало значения в диапазоне 150-350. Более высокие концентрации клеток, находящихся в процессе разрушения, будут иметь тенденцию приводить к конечным реакциям безклеточной экспрессии с более высоким выходом белка, но с повышенной тенденцией к агрегации уязвимых белков. Наружный диаметр_{600 нм} = 300 представляет собой подходящую цель по умолчанию для производства LTE.
2. Переложите собранные культуры в подходящие центрифужные бутылки и вращайте их при температуре 2500 x g в течение 10 минут при 4 °C. Осторожно сцедите надосадочную жидкость в отходы культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно свести к минимуму потери клеток в отброшенную надосадочную жидкость, так как это влияет на расчет нагрузки на разрушение. В предыдущих производственных протоколах LTE концентрация клеток L. tarentolae для разрушения калибровалась путем откручивания концентрата клеток в тестовой микроцентрифужной пробирке и измерения массы гранул по отношению к общей массе³⁴. Этот упрощенный протокол вместо этого использует теоретический целевой внешний диаметр_{600 нм} для концентрата, основанный на измеренном наружном диаметре_{600 нм,} и предполагает низкую потерю клеток во время концентрации и промывки клеток.
3. Промойте клеточную гранулу в буфере SEB (45 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 250 мМ сахароза, 100 мМ KOAc, 3 мМ Mg(OAc)₂, выдерживая на льду) три раза, каждый раз центрифугируя при 2500 x g в течение 10 мин при 4 °C. Для первой промывки суспендируйте каждый 1 л гранулированной культуры в 100 мл буфера SEB, затем объедините их в одну колбу центрифуги. Для второй промывки также используйте 100 мл SEB на каждый 1 л исходной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для окончательной ресуспензии гранул добавьте буфер SEB до 50% от конечного целевого объема ресуспензии (шаг 2.1). Это позволяет тщательно доливать объединенный концентрат точно до конечного целевого объема на шаге 2.4. Каждая ресуспензия должна быть как можно более щадящей, чтобы избежать преждевременного лизиса L. tarentolae, например, путем осторожного взматывания добавленного SEB вокруг сцеженной гранулы или пипетирования SEB поверх гранулы, прилипшей к стенке центрифужной трубки. Возможно, более удобным будет перенос надосадочной жидкости в центрифужные пробирки меньшего размера для заключительного этапа.
4. Перелейте ресуспендированный концентрат в подходящий мерометрический цилиндр из вымытого стекла, затем долейте объем до целевого объема (шаг 2.1) с помощью дополнительного холодного SEB и аккуратно перемешайте.

3. Лизис концентрата L. tarentolae

1. Поместите концентрат клеток в устройство для кавитации азота (см. Таблицу материалов), предварительно охлажденное до 4 °C, нагнетайте его до 70 бар азота и инкубируйте в течение 45 минут на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что нарушители кавитации азота не являются распространенными лабораторными изделиями, они рекомендуются для производства LTE. Были опробованы альтернативные методы, такие как клеточное замораживание-размораживание и разрушители типа френч-пресса; Однако активность экспрессии белка составила <50% по сравнению с использованием метода кавитации азотом. Устройство для кавитации азота должно быть тщательно очищено перед использованием и между прогонами, как и все повторно используемые сосуды, которые вступают в контакт с клеточным лизатом на этом этапе (например, колба-приемник). Подходящий режим чистки предполагает стирку лабораторными моющими средствами с последующим тщательным промыванием деионизированной водой.
2. Откройте вентиляционное отверстие на устройстве кавитации азота и выдавите полученный лизат в достаточно прочный контейнер, например, в колбу вакуумного ресивера на льду. Наклоните колбу-приемник, чтобы убедиться, что весь полученный лизат оседает и может быть передан пипеткой в свежую центрифужную пробирку или аналогичный сосуд.
   ВНИМАНИЕ: Нарушители кавитации азота основаны на резком переходе концентрата элемента от 70 бар азота к давлению окружающей среды, достигаемом за счет сильного потока сначала жидкости, а затем азота через выпускной клапан устройства. Вентиляция должна осуществляться с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ) в капюшоне химической безопасности. Существует риск поломки сосуда назначения и потери лизата, поэтому мы используем прочный вакуумный приемник вместо обычной колбы. Если выпускной клапан устройства представляет собой трубку, не размещайте трубку непосредственно внутри ресивера, чтобы предотвратить чрезмерное повышение давления в точке вентиляции.

4. Центрифугирование клеточного лизата

1. Переведите лизат в подходящие центрифужные пробирки с номинальной силой перегрузки и центрифугу при давлении 10 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость в свежие, аналогичные центрифужные пробирки.
2. Центрифугируйте лизат при 30 000 х г в течение 15 мин при 4 °С, а затем удалите окончательную надосадочную жидкость в свежую центрифужную пробирку или аналогичную емкость, помещенную на лед. Оцените общий объем.

5. Гелевая фильтрация клеточного лизата

ПРИМЕЧАНИЕ: Гель-фильтрация используется для удаления сахарозы, входящей в состав буфера SEB. В то время как сахароза помогает стабилизировать клеточный механизм во время клеточного разрушения, она снижает выход, если сохраняется в реакциях экспрессии белка.

1. Установите достаточное количество колонок для фильтрации геля с гравитационной подачей PD-10 (см. Таблицу материалов) в формате штатива, который позволяет им капать в лоток для сбора или аналогичный контейнер внизу, гарантируя, что они могут фильтровать весь объем лизата со скоростью 2,5 мл на колонку. Предварительно уравновесьте колонки, предварительно пропустив через них 10 мл буфера EB с температурой 4 °C (45 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 100 мМ KOAc, 3 мМ Mg(OAc)₂).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги с этого момента лучше проводить в холодильной камере при температуре 4 °C. Тем не менее, он также подходит для хранения всех лизатов и реагентов на настольном лотке для льда. Одним из исключений является этап фильтрации гелем, на котором авторы помещают стеллаж с колоннами внутрь холодильника с температурой 4 °C во время повторной буферизации. В первоначальных версиях этого протокола новые колонки для фильтрации геля «блокировались» путем первоначальной буферизации лизата и отбрасывания первого выхода. Хотя это не считается необходимым, колонки должны быть промыты EB-буфером и храниться при температуре 4 °C между партиями лизата. Первый выходной лизат может иметь более низкую активность экспрессии белка, чем последующие выходы, из-за некоторого фонового удержания компонентов лизата на новой колонке.
2. Добавьте по 2,5 мл лизата в каждую колонку и подождите, пока он перейдет в колонку. Добавьте еще 0,5 мл EB, чтобы отсадить лизат в колонке, отбрасывая элюат.
3. Разбавьте фильтрованный гелем лизат, добавив дополнительно 2,5 мл EB в каждую колонку, собирая выход, помещая под колонки свежий, чистый лоток или другую емкость.

6. Добавка клеточного лизата

1. С помощью нанокапельного спектрофотометра (см. Таблицу материалов) измерьте Abs_{280 нм} лизата, отфильтрованного гелем. Если он превышает 60, разбавьте его до Abs_{280 нм} = 60 с помощью дополнительного буфера EB при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как контроль ввода плотности клеток в разрушение с помощью наружного диаметра_{600 нм} приблизительно определяет выходную силу лизата, нормализация Abs_{на длине волны 280 нм} после разрушения и обработки лизата еще больше улучшает стабильность лизата в партии. Lysate Abs_{280 нм} можно регулировать вверх и вниз, что приводит к выходу экспрессии белка и агрегации (см. раздел «Обсуждение»). Если недополненный лизат указывает на Abs_{280 нм} < 60, возможно, потребуется включить больше биомассы Leishmania на этапе разрушения, т.е. увеличить нагрузку разрушителя клеток до наружного диаметра_{600 нм} > 300 на этапе 2.1.
2. Добавьте 5x Питательный раствор (5x FS, Таблица 1) в лизат в соотношении 2:5 и тщательно перемешайте. Разложите его по подходящим емкостям (например, микропробиркам объемом 1,5 мл) и заморозьте в жидком азоте. Если вы следуете необязательным шагам 7.1-7.3 для оптимизации выражения LTE, приведенному ниже, используйте уменьшенную rNTP.Mg 5x FS из таблицы 1 вместо стандартной 5x FS. Включите 5 аликвот по 100 мкл для замораживания для использования в экспериментах по оптимизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание с использованием стандартного 5x FS в соотношении 2:5 создает готовый к экспрессии дополненный LTE, используемый при экспрессии 7 μL/10 μL (следовательно, 5x FS становится 1x FS в конечной реакции). Тем не менее, авторы рекомендуют следовать дальнейшим необязательным шагам, в которых в 5x FS предусмотрено 0,6-кратное стандартное количество rNTP и магния. За этим следует этап оптимизации, на котором добавляется эквимолярная смесь этих двух реакций (называемая rNTP.Mg) для доведения тестовых реакций до оптимизированного значения. Частичная 5x FS также содержит олигонуклеотид, который подавляет экспрессию эндогенной мРНК (см. раздел «Введение»). Последовательность олигонуклеотида — CAATAAAGTACAGAAACTGATTATATAGCGTT.

7. Контроль качества и оптимизация конечного дополненного LTE

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимально необходимые шаги для определения подходящего «доливочного» добавления rNTP.Mg к восстановленному rNTP и лизату с добавлением магния включают экспрессию eGFP или аналогичного флуорофора (например, sfGFP) без партнера по синтезу. Увеличивающиеся концентрации rNTP.Mg добавляются в реакции, чтобы определить точку, в которой уровень экспрессии (измеряемый как eGFP RFU с помощью многорежимного считывателя) оптимизируется. Преждевременное прекращение eGFP, которое не является флуоресцентным, становится очевидным при снижении РКГ eGFP при слишком высоких концентрациях rNTP.Mg. Тем не менее, короткие продукты сбоев LTE чаще происходят в более крупных экспрессированных белках (>50 кДа). Следовательно, можно выполнить эту оптимизацию с использованием более крупного шаблона, чем eGFP, особенно если он доступен в подходящем векторе экспрессии, обеспечивающем слияние флуорофоров, которое желательно получить с помощью LTE для конкретного применения или исследования (см. раздел «Репрезентативные результаты»).

1. Разморозьте 100 мкл аликвоты и запустите шесть реакций экспрессии по 10 мкл, каждая из которых состоит из 7 мкл частично дополненного лизата из стадии 6.2, 1 мкл раствора для долива в соответствии с таблицей 2 и 2 мкл сверхчистой воды, содержащей достаточное количество контрольного шаблона ДНК для достижения конечной концентрации 50 нг/мкл в реакции.
2. Инкубируйте реакции в течение 2 ч при 25 °C и контролируйте увеличение флуоресценции GFP с помощью многорежимного считывателя планшетов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящими конфигурационными значениями для GFP являются возбуждение на длине волны 485 нм (полоса пропускания 5 нм), излучение на длине волны 516 нм (полоса пропускания 5 нм) с интервалом считывания 1 минута в течение 2 часов.
3. Ранжируйте итоговые значения выражения, чтобы определить концентрацию rNTP.Mg, соответствующую наивысшему РФС eGFP. Если кинетические данные доступны, превышение rNTP.Mg также будет свидетельствовать о двухфазном увеличении РФП eGFP в течение 2-часового периода экспрессии (см. раздел «Репрезентативные результаты»).
4. После того, как будет определена оптимизированная концентрация rNTP.Mg долива, добавьте ее ко всем дальнейшим экспрессиям белка, используя партию LTE, которая была частично добавлена на предыдущих этапах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если аликвотирование на шаге 6.2 выполняется осторожно с фиксированными объемами, то доливка может быть ретроспективно добавлена к каждой аликвоте без размораживания, например, с помощью аликвот, помещенных на сухой лед. Теперь эти аликвоты полностью дополнены, так как правильная rNTP.Mg долива будет смешиваться через каждую из них, когда они будут разморожены и смешаны для использования.

Результаты

Целью экспрессии внеклеточных белков является получение полноразмерных белков в свернутой, активной форме, подходящей для широкого спектра применений. LTE (экстракт Leishmania tarentolae) ранее сравнивали с другими прокариотическими и эукариотическими системами бесклеточной экспрессии, демонстрируя высокую способность избегать усечения и агрегации при оптимальной работе, особенно по сравнению с бесклеточной^{экспрессией} на основе E. coli. Однако ранее это сопровождалось значительными колебаниями качества выпускаемой продукции от партии к партии. Текущий метод включает в себя дальнейшие усовершенствования для обеспечения стабильного качества продукции, в первую очередь за счет частичного добавления необходимого питательного раствора перед первоначальным замораживанием LTE в аликвотах. За этим следует оптимизация входного rNTP.Mg транскрипции в доливочном растворе, который может быть добавлен в каждую последующую реакцию или использован для завершения замороженных аликвот напрямую. Следует отметить, что реакции оптимизации также представляют собой типичное практическое использование LTE для экспрессии белков, при этом реакции проводятся при 25 °C в течение 2 ч.

Данные оптимизации концентрации rNTP.Mg в бесклеточных реакциях позволяют получить репрезентативный набор данных. Уровни экспрессии обычно увеличиваются по мере увеличения входного транскрипционного сигнала (rNTP.Mg), что указывает на успешную экспрессию. Тем не менее, достигается порог, при котором система имеет тенденцию к непродуктивной экспрессии усеченных продуктов, особенно в случае более крупных белков (>50 кДа). Эта неоптимальная экспрессия приводит к потере флуоресцентного сигнала с увеличением rNTP.Mg, что особенно заметно при слиянии С-концевых флуорофоров, где трансляция полипептида не достигает самого флуорофора. Для N-концевых слияний, в то время как уменьшение общего RFU (относительных единиц флуоресценции) не обязательно происходит при избытке rNTP.Mg, неправильная экспрессия заметно проявляется на гелях SDS-PAGE в виде множественных флуоресцентных продуктов уменьшающихся размеров. Этот подход использует способность GFP (зеленого флуоресцентного белка) поддерживать флуоресценцию даже при визуализации на обычном геле SDS-PAGE, при условии, что образцы не нагреваются после смешивания. Вместо этого они смешиваются с буфером для загрузки геля и загружаются непосредственно на гель. В то время как гелевые материалы и оборудование SDS-PAGE, как правило, взаимозаменяемы, гелевый имидж-сканер должен быть способен визуализировать флуоресценцию GFP. Типичная конфигурация для визуализации GFP обеспечивает возбуждение на длине волны 485 нм (полоса пропускания 5 нм), излучение на длине волны 516 нм (полоса пропускания 5 нм) и интервал чтения 1 минута в течение 2 часов.

Оптимизация системы с использованием только выражения eGFP возможна. На рисунках 2A,B (врезка) показаны типичные экспрессионные выходы реакций оптимизации для двух партий LTE, при этом eGFP RFU увеличивается с увеличением концентраций rNTP.Mg, достигая оптимального уровня +0,6x rNTP.Mg (рисунок 2A) и +0,3x rNTP.Mg (рисунок 2B) для максимального RFU. Решение с уменьшенным rNTP.Mg rNTP включает в себя 0,6-кратный , в результате чего общее количество rNTP.Mg в 1,2 и 0,9 раза превышает значение по умолчанию для этих пакетов LTE. На рисунке 2C показана кинетика увеличения RFU во время реакции для партии LTE, показанная на рисунке 2B, демонстрирующая двухфазную реакцию с двумя дискретными фазами на протяжении всей реакции.

Рисунок 2: Оптимизация добавления rNTP.Mg дополнения в LTE со сниженным rNTP в 5x FS. (A) Уровни экспрессии eGFP после 140 мин экспрессии из контрольной плазмиды при различных уровнях rNTP.Mg пополнения в реакции бесклеточной экспрессии (n = 3, построено среднее значение ± SD). (B) Оптимизация другой производственной партии LTE, показывающей сниженную экспрессию выше определенного порога rNTP.Mg. (C) Кинетика накопления eGFP в тех же реакциях, что и (B), с увеличением rNTP.Mg долива. Эти данные также представляют собой типичную кинетику накопления белка в экспрессии партии LTE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Тем не менее, следует отметить, что eGFP, будучи небольшим белком (27 кДа), который легко сворачивается, вероятно, будет экспрессироваться, сворачиваться и созревать независимо от используемой системы бесклеточной экспрессии. Сбой системы более вероятен при экспрессии более крупных белков, представляющих интерес, при этом усеченные продукты становятся более заметными при размерах входных белков более 70 кДа³³. Таким образом, оптимизация системы с белком(ами), предназначенным для фактического использования, является более эффективной, при этом eGFP все еще присутствует для количественного определения, но в виде N-концевого слияния с интересующим белком.

На рисунке 3 представлена типичная оптимизация уровня rNTP.Mg пополнения при использовании более крупного белкового шаблона, склонного к доставке усеченных продуктов (eGFP-Sox18). Используя полунативный гелевый формат SDS-PAGE (т.е. без нагрева образцов), можно визуализировать прогрессирующее нарушение экспрессии. Оптимальное добавление rNTP.Mg при +0,1x (в сочетании с 0,6x rNTP.Mg в растворе частичного кормления, всего 0,7x) явно снижает фракцию полноразмерной белковой полосы в составе общих продуктов экспрессии флуоресценции, что означает отказ системы с избыточным добавлением rNTP.Mg.

Как указано в протоколе, можно пропустить этап оптимизации rNTP.Mg и напрямую добавить полное количество rNTP.Mg в «стандартный» раствор для кормления во время добавки сразу после фильтрации геля на шаге 6.2. Таким образом, протокол по сути возвращается к исходным опубликованным методам создания LTE³⁴. Тем не менее, авторы считают, что адаптация системы для оптимальной производительности, как показано на рисунке 3 (от полосы D к полосе E), перевешивает дополнительную сложность протокола и повышает ценность LTE как инструмента экспрессии белков.

Рисунок 3: Влияние увеличения rNTP.Mg пополнения на экспрессию eGFP-Sox18 при частично дополненном LTE. Полунативный гель SDS-PAGE, изображающий влияние увеличения rNTP.Mg пополнения на экспрессию eGFP-Sox18. Полоса A: +0,1x (rNTP.Mg) пополнение, Lane B: +0,2x (rNTP.Mg), Lane C: +0,3x (rNTP.Mg), Lane D: +0,4x (rNTP.Mg). N-концевое слияние eGFP визуализируется с помощью флуоресцентного сканирования геля. Основная полоса на полосе А представляет собой полноразмерный eGFP-Sox18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Компонент	Концентрация запасов	5x Кормовое решение	μЛ запас/мл 5x Кормовое решение
		По умолчанию (сниженный rNTP)	По умолчанию (сниженный rNTP)
Спермидин	100 мМ	1,25 мМ	12
ДТТ	500 мМ	10 мМ	20
Креатинфосфат	1000 мМ	200 мМ	200
HEPES-KOH pH7,6	2500 мМ	100 мМ	40
PEG3000	0,5 В/В	0,05 В/В	100
Коктейль ингибиторов протеазы	в 120 раз	В 5 раз	43
Аминокислоты	3,6 мМ (шт.)	0,68 мМ (шт.)	190
СПС	100 мМ	8,5 (5,1) мМ	85 (51)
ГТП	100 мМ	3,2 (1,9) мМ	32 (19)
УТП	100 мМ	2,5 (1,5) мМ	25 (15)
ОСАГО	100 мМ	2,5 (1,5) мМ	25 (15)
Mg(OAc)2	1 МИН.	16,7 (10) мМ	16,7 (10)
Антисращивающий поводок oligo	1 мМ	0,05 мМ	50
Т7 РНК-полимераза	5 мг/мл	0,5 мг/мл	100
Креатинфосфокиназа	5 единиц/мкл	0,2 единицы/мкл	42
Сверхчистая вода			19 (93)

Таблица 1: Состав 5x Feed Solution (5x FS) для LTE. Требуется 1 мл 5x ФС на каждые 2,5 мл недополненного лизата после фильтрации гелем. При добавлении стандартного 5x FS создается готовый к экспрессии LTE для использования в экспрессионных реакциях в соотношении 7 μл/10 μл. Рецепт с уменьшенным rNTP.Mg (количества выделены курсивом) рекомендуется для оптимизации экспрессии LTE и содержит в 0,6 раза больше стандартных уровней rNTP и магния. Они могут быть скорректированы до переменных уровней (от 0,6 до 1,1 раза) в последующем эксперименте по оптимизации с помощью дополнений, указанных в таблице 2.

Пополнение rNTP	АТФ (100 мМ)	ГТФ (100 мМ)	UTP (100 мМ)	CTP (100 мМ)	MgOAc (1 М)	Сверхчистая вода
(1 мкл/10 мкл rxn)	μл/200 μл	μл/200 μл	μл/200 μл	μл/200 μл	μл/200 μл
+0x	0	0	0	0	0	200
+0,1к	3.4	1.3	1	1	0.7	193
+0,2к	6.8	2.5	2	2	1.3	185
+0,3к	10.2	3.8	3	3	2	178
+0,4к	13.6	5.1	4	4	2.7	171
+0,5к	17	6.4	5	5	3.3	163

Таблица 2: Состав (rNTP.Mg) доливочных решений для оптимизации LTE. Эти растворы используются для оптимизации LTE путем добавления 1 мкл доливочного раствора на 10 мкл реакции экспрессии белка. После того, как в эксперименте по оптимизации определен уровень долива, его можно последовательно добавлять во все последующие реакции экспрессии белка с использованием тех же аликвот партии LTE. В качестве альтернативы его можно добавлять непосредственно в сами аликвоты в количестве 1 мкл на 7 мкл (без размораживания). После размораживания и смешивания эти лизаты используются в концентрации 8 мкл LTE на 10 мкл экспрессии белка, поддерживая уровень rNTP.Mg долива, установленный в ходе оптимизации.

Обсуждение

Протоколы создания LTE были опубликованы за последнее десятилетие⁷ и претерпели периодические^{обновления25,34}. Тем не менее, новички в этом методе часто сталкиваются с крутой кривой обучения, что приводит к задержкам в достижении высококачественной и высокопроизводительной экспрессии белка. Аналогичные проблемы были зарегистрированы другими исследовательскими группами, работающими с LTE³⁵, особенно в отношении значительных различий от партии к партии. Формат протокола, основанный на видео, потенциально может предоставить дополнительные, менее очевидные знания о настройке, которые принесут пользу потенциальным пользователям³⁴. В протокол были внесены изменения, направленные на повышение вероятности успеха, упрощение процедуры, сокращение времени и минимизацию ошибок, связанных со сложностью.

При разрушении ячеек решающее значение имеет точный контроль загрузки ячеек в дестабилизатор азотных кавитационных ячеек³⁴. Достижение этой цели может быть сложной задачей из-за высокой плотности клеток после концентрации клеток и промывки. В первоначальных протоколах использовались различные методы, такие как откручивание небольшого объема конечной концентрированной культуры и количественное определение фракционной клеточной гранулы. Однако в данном протоколе принят более простой подход. Измеряется объем урожая культуры и наружный диаметр_{600 нм} , и эти измерения используются для расчета целевого объема концентрата клеток в миллилитрах с целью достижения желаемого конечного наружного диаметра_{600 нм} в 300 нм. Этот расчет предполагает, что во время промывки не происходит значительных потерь клеток. Если есть подозрение на потерю клеток, используется альтернативный метод, включающий тройное серийное разведение концентрированных клеток в масштабе 1/10 после промывки, что в конечном итоге приводит к разведению в масштабе 1/1000. Это позволяет измерить фактический внешний диаметр концентрата_{600 нм}, гарантируя, что он достигнет целевого наружного диаметра_{600 нм} = 300 перед загрузкой в деструктор.

Даже при тщательном контроле загрузки клеточных разрушителей может наблюдаться значительная вариабельность содержания белка лизата после разрушения, на что указывает Abs_{280 нм} фильтрованного гелем недополненного лизата³⁴. Таким образом, перед введением добавок лизата измеряют Abs_{280 нм} , и лизат разбавляют для достижения Abs_{280 нм} = 60. Поскольку реакции экспрессии белка в конечном итоге включают 0,5 v/v лизата, это приводит к стандартизированному лизату реакции с Abs_{280 нм} = 30. Производительность лизата, сконфигурированная с более низкой, чем Abs_{280 нм} = 30, имеет тенденцию к длительным реакциям с низкой экспрессией, в то время как значения выше Abs_{280 нм} = 30, как правило, дают более высокую экспрессию, но повышенную тенденцию к агрегации выходных белков.

Оптимизация производительности лизата включает в себя корректировку транскрипционных входов в питательный раствор, который дополняет лизат, в частности рNTP и магний, на дополнительных этапах реакции 7.0-7.3. Важно отметить, что rNTP и магний играют сложную и многогранную роль в связанной системе транскрипции-трансляции, такой как LTE²⁵. Тем не менее, было показано, что LTE имеет приблизительную оптимальную экспрессию магния при rNTP (мМ) + 1,5. Поскольку лизат сам по себе вносит 1,5 мМ Mg в конечную реакционную смесь, это обеспечивает простой способ варьировать и оптимизировать поступление rNTP без сооптимизации Mg путем изменения эквимолярных rNTP.Mg.

Эффективность лизата демонстрирует значительные изменения при увеличении rNTP.Mg, при этом экспрессия белка обычно увеличивается до порога, при котором оптимизация изменяется на противоположную, что приводит к сбоям в экспрессии в виде коротких продуктов вместо полноразмерных белков²⁵. Поэтому окончательная оптимизация системы для определения этого порога является выгодной. В оригинальном протоколе LTE использовался фиксированный рецепт решения для кормления, с некоторой оптимизацией^Mg34. Позже этот подход был модифицирован с помощью более обширной оптимизации rNTP. Однако этот метод требовал мгновенного замораживания лизата в недополненной форме, чтобы обеспечить оптимизацию аликвоты, которая имела тенденцию снижать возможные уровни экспрессии лизата. Это снижение было связано с потерей криопротекторных свойств питательного раствора при мгновенной заморозке недополненного лизата сразу после стадии фильтрации гелем. Текущий протокол обеспечивает баланс путем добавления раствора для кормления, содержащего сниженное rNTP.Mg перед замораживанием, которое может быть доведено до оптимизированного уровня в точке сцеживания.

Ожидается, что эти усовершенствования протокола повысят полезность системы LTE для начинающих пользователей за счет смягчения основных источников вариаций и улучшения стабильности на выходе экспрессии белка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PD-10 SuperDex 25 колонок	Цитива	17085101	Гелевые фильтрующие колонки
Азот Кавитационный клеточный разрушитель	Parr Industries	4635 или 4639	Клеточный разрушитель
бычьего происхождения Хемин	Сигма-Олдрич	H5533	Культуральная добавка
Пенициллин/стрептомицин 10000 ед/мл	Thermo-Fisher	15140122	Смесь
антибиотиковOptiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwell планшет для 10 мкл экспрессии
олигонуклеотида	IDT синтеза		Олиго с последовательностью CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Креатинфосфокиназа	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Фермент
Tecan Spark	Tecan		или аналогичный Многорежимный сканер пластин
Chemidoc MP Imager Biorad			или аналогичный гель SDS-PAGE Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE гели
Биофотометр	Eppendorf		или аналогичная Кюветная Спецофотометр
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop спектрофотометр
Avanti JXN-26 Центрифуга	Beckman Coulter		или аналогичная центрифуга, с роторами/пробирками с номиналом 10K и 50K g
5424R микроцентрифуга	Eppendorf		или аналогичная микроцентрифуга, с микроцентрифугой
объемом 1,5 млКолба-инкубатор Inova S44i	Eppendorf		или аналогичная колба-инкубатор шейкер подходит для 5 л Колбы
для стеклянных колб для культуры 5 л Стеклянные			колбы для выращивания культуры
Бактотриптон	BD	211705	Питательная среда
Дрожжевой экстракт	Merck	VM930053	Питательная среда
Глицерин			Любой аналитический сорт
Глюкоза			любого аналитического класса
KH2PO4			Любой аналитический класс
K2HPO4			Любой аналитический класс
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Или выход из любого диспенсера для воды типа MilliQ.