Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеристика болевых изменений у крыс с повреждением нервов в течение 24 часов после однократного вмешательства Туйна

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65593

⸱

26 января 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Beijing Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол с использованием симулятора манипуляции tuina для проведения терапии туиной «Три манипуляции и три акупунктурные точки» у крыс с незначительными хроническими констрикционными травмами и оцениваем эффективные обезболивающие временные точки туины в течение 24 часов путем тестирования изменений боли с помощью поведенческого анализа и изменений экспрессии воспалительных факторов с помощью иммуноферментного анализа.

Аннотация

В клинических и фундаментальных исследованиях было доказано, что туина, как метод наружного лечения в традиционной китайской медицине, оказывает обезболивающее действие на периферическую нейропатическую боль (пНБ). Тем не менее, оптимальный момент времени для обезболивающего эффекта туйны может варьироваться в зависимости от различных ощущений от травмы, что влияет на изучение механизма инициации анальгезии туйны.

В исследовании использовались крысы на модели незначительной хронической констрикционной травмы (незначительная ЧМТ) для моделирования pNP и использовался интеллектуальный симулятор манипуляции туиной для моделирования трех методов (нажатие на точки, выщипывание и разминание) и трех акупунктурных точек (Yinmen BL37, Chengshan BL57 и Yanglingquan GB34) для проведения туйна-терапии. В исследовании оценивали изменения боли в течение 24 ч и оптимальную временную точку для эффективности анальгезии туина у крыс с незначительными моделями ЧМТ путем тестирования порога чувствительности к холоду (CST), порога механической абстиненции (MWT) и латентности термической абстиненции (TWL). Кроме того, в исследовании оценивались изменения экспрессии IL-10 и TNF-α с помощью иммуноферментного анализа. Результаты показывают, что туина обладает как немедленным, так и длительным обезболивающим эффектом. Для трех различных пороговых значений чувствительности к травмам CST, MWT, TWL и двух цитокинов IL-10 и TNF-α анальгетическая эффективность туины в течение 24 ч после вмешательства значительно различается в разные моменты времени.

Введение

Периферическая нейропатическая боль (пНБ) относится к боли, вызванной поражением или заболеванием периферической соматосенсорной нервной системы, проявляющейся в виде ряда симптомов и признаков, с гипералгезией в качестве одного из основных симптомов 1,2. Гипералгезия — это усиленное переживание боли, вызванное вредным раздражителем, включая укол булавкой, холод и тепло3. Были проведены крупные эпидемиологические исследования, которые показали, что пНЧ является наиболее распространенным заболеванием, с частотой распространенности 6,9%-10% при нейропатической боли4. НЧ может быть вызван множественными заболеваниями, включая повреждение нерва, постгерпетическую невралгию, болезненную диабетическую полинейропатию, рассеянный склероз, инсульт, рак и т.д.5. В настоящее время основным методом лечения пНЛ является медикаментозное лечение, но эффект не идеальный; Причем побочные эффекты значительны, что является основной причиной высокой экономической нагрузки на индивидуумов и общество6.

Туйна – это экологичный, экономичный, безопасный и эффективный метод наружного лечения традиционной китайской медицины7. Многие клинические исследования доказали обезболивающий эффект туины на рНЧ, а основные исследования подтвердили немедленный и кумулятивный анальгетический эффект туины 8,9. Основным кумулятивным обезболивающим механизмом туйны является снижение уровня воспалительных факторов и ингибирование активации глиальных клеток 10,11. Предыдущее исследование подтвердило кумулятивный обезболивающий эффект туины и обнаружило дифференциально экспрессируемые гены (DEG) в ганглиях дорсального корешка (DRG) и спинальном дорсальном роге (SDH) крыс с повреждением седалищного нерва после 20-кратного лечения туйна, в основном связанные с связыванием белка, реакцией на давление и проекцией нейронов. В недавних исследованиях было подтверждено, что туина обладает немедленным обезболивающим эффектом и что однократное вмешательство туина может облегчить гипералгезию у незначительных крыс CCI и особенноболее эффективно облегчить термическую гипералгезию. Тем не менее, оптимальный временной момент для обезболивающего эффекта туйны может варьироваться в зависимости от ощущения от травмы (холод, жара, механическое), что влияет на изучение механизма инициации анальгезии туйны.

Медиаторы воспаления могут сенсибилизировать и активировать болевые рецепторы, что приводит к снижению порогов разряда и эктопических разрядов, тем самым способствуя периферической сенсибилизации14,15. После повреждения периферических нервов TNF-α является инициатором воспалительной реакции, которая может способствовать синтезу воспалительных факторов, таких как IL-10 и IL-1β, вызывая прямое воспалительное повреждение тканей, стимулируя местные нервные окончания и вызывая боль 16,17,18. Туина может достигать обезболивающего эффекта за счет снижения экспрессии воспалительных факторов, таких как TNF-α, IL-10, IL-6 и IL-1β 19,20,21. В исследовании были отобраны малые крысы модели CCI для моделирования клинической пНЧ и выбраны различные временные точки для поведенческого тестирования боли при холодовой, термической и механической стимуляции после 1-разового вмешательства туйна с помощью порога чувствительности к холоду (CST), порога механической абстиненции (MWT), латентности термической абстиненции (TWL), а также выбора IL-10 и TNF-α в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для того, чтобы выбрать момент времени, в который анальгетический эффект туйны является значительным, это дает основу для изучения механизма инициации анальгезии туйна на более поздней стадии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Комитет по защите и использованию животных Пекинского университета китайской медицины (BUCM-4-2022082605-3043) одобрил все процедуры, использованные в этом исследовании.

1. Животные и дизайн исследования

  1. Получить 49 самцов крыс породы Спрэг-Доули (SD) в возрасте 8 недель, массой 200 ± 10 г.
  2. Используя метод таблицы случайных чисел, разделите крыс на фиктивную операционную группу (n = 7), модельную группу (n = 7) и сразу после группы туйна (n = 7), через 6 часов после группы туйна (n = 7), через 12 часов после группы туйна (n = 7), через 18 часов после группы туйна (n = 7) и через 24 часа после группы туйна (n = 7).

2. Создание крысиной модели малой ЧМТ (Рисунок 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод моделирования минорной ЧМТ был таким, как он был описан в предыдущих исследованиях 22,23,24.

  1. Разрешить адаптивное кормление крысы SD в течение 7 дней. Дайте крысе поголодать 2-3 часа перед моделированием.
  2. Поместите крысу в коробку, наполненную 3-5% изофлураном для обезболивания наркозным аппаратом. После анестезии нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
  3. Зафиксируйте крысу в положении лежа на столе, сбрейте шерсть в области правого тазобедренного сустава и продезинфицируйте область йодом (рисунок 1В).
  4. Подтвердите операционную плоскость анестезии ущипнутием пальца ноги. Сделайте разрез кожи примерно на 0,5-1 см по направлению ходьбы седалищного нерва, тупо отделите мышечный слой и полностью обнажите нижний край грушевидной мышцы (рисунок 1С).
  5. Неплотно завяжите рассасывающийся хромовый кишечный шов (тип 4-0) вокруг нерва, не прерывая кровообращение экстраневральных сосудов. Обнажайте седалищный нерв крыс фиктивной группы в течение 3 минут без перевязки (рис. 1A, D, E).
  6. С помощью шприца без иглы нанесите 1 каплю 0,9% раствора натрия хлорида на седалищный нерв, чтобы помочь его сбросить. Наложите шов слой за слоем, дайте соответствующее количество противовоспалительного препарата, такого как порошок амоксициллина, зашите мышечный слой 1 стежком и зашите кожу 2 швами (рис. 1F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С шага 2.3 по шаг 2.6 следите за тем, чтобы 2%-3% изофлурана поступало в рот и нос крыс для поддержания анестезии.
  7. Держите крысу в тепле и ждите, когда она проснется. Верните крыс в помещение для разведения.

3. Интеллектуальный симулятор манипуляции туиной (Рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение началось на7-й день после установления модели.

  1. Отрегулируйте параметры прибора до силы стимуляции 4 Н, частоты стимуляции 60 раз/мин и температуры 36 °C в интерфейсе работы компьютера. Поместите крысу в фиксатор крысы и обнажите расположение акупунктурных точек задних конечностей (рис. 2А, машина собственной разработки, патент No. ZL 2023 20511277.5)25.
  2. Активируйте инструмент для выполнения методов нажатия на острие, ощипывания и замешивания (Таблица 1). Нажмите на точки « Нажатие на острие», «Ощипывание» и «Разминание », отображаемые на экране компьютера в последовательности на точках Иньмэнь (BL37), Чэншань (BL57) и Янлинцюань (GB34) (Таблица 2) на модельной стороне крысы группы туйна (Рисунок 2B, C)26.
    1. Для группы туйна выполняйте одно вмешательство один раз в день в течение 1 дня с силой 4 Н, частотой 60 раз/мин и в общей сложности 9 мин на точку на метод.
    2. Удерживайте фиктивную и модельную группы в течение 9 минут, столько же, сколько и группу туина.

4. Поведенческие измерения

ПРИМЕЧАНИЕ: После вмешательства пороговый порог чувствительности к холоду (CST), порог механического поглощения (MWT) и латентность теплового отвода (TWL) были протестированы в 5 подгруппах tuina, модельной группе и группе фиктивных операций соответственно. Время тестирования для модельной и фиктивной групп такое же, как и для группы туина (т.е. 24 ч).

  1. Порог чувствительности к холоду (CST)
    1. Поместите крысу на интеллектуальный датчик боли с холодной и горячей пластиной с температурой поверхности 4 ± 1 °C (нажмите на кнопку СТАРТ > СЕТ) и накройте ее прозрачной пластиковой клеткой.
    2. Наблюдайте за исследовательской деятельностью крыс в течение 5 минут, пока они не акклиматизируются в прозрачной пластиковой клетке.
    3. Наблюдайте и записывайте количество подъемов ног на операционной стороне задней конечности в течение следующих 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество подъемов ног, вызванных изменениями в активности или осанке крысы, не учитывается.
  2. Механический порог отбора (MWT)
    1. Поместите крысу на нижнюю поверхность в виде сетки (0,5 см × 0,5 см) в тестовый бокс на 15-30 минут перед испытанием.
    2. Переместите зонд боли (тип EVF 5) к центру правой задней подошвенной области крысы, линейно увеличивайте давление рукой и записывайте порог, отображаемый на экране прибора, когда крыса поднимает и облизывает ноги. Измеряйте непрерывно 5 раз, с интервалом измерения 10 мин каждый.
  3. Задержка теплоотвода (TWL)
    1. Поместите крысу в тестовый бокс со стеклянной нижней поверхностью и дайте ей адаптироваться в течение 15 минут перед началом теста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрытый период термосократительного рефлекса стопы определяли с помощью инструмента для термостимуляции боли (тип PL200).
    2. Задайте параметры: максимальное время испытания — 30 с, а интенсивность — 50%. Нажмите на кнопки СТАРТ и направление.
    3. Переместите инфракрасный зонд к центру правой задней подошвенной области крысы и начните обнаружение.
    4. Запишите латентность рефлекса втягивания лап, когда крыса поднимает и облизывает ноги. Измеряйте задержку непрерывно 5 раз с интервалом в 10 минут между каждым измерением.

5. ИФА

  1. Обезболить крысу дозой 35 мл/100 г 4% гидрата хлора для внутрибрюшинного инъекционного обезболивания после поведенческого тестирования. Разрежьте кожу и мышцы в продольном направлении вдоль середины живота крысы, чтобы обнажить ее внутренние органы.
  2. Используйте балласт и иглодержатель для чистого разделения, определите брюшную аорту, возьмите свежую кровь и сохраните образец для тестирования. Используйте разделительную трубку для отделения сыворотки. Возьмите образец сыворотки для немедленного обнаружения, или упакуйте его отдельно и храните в холодильнике при температуре -80°С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед отделением дайте образцу крови слипнуться в течение 30 минут.
  3. Подготовьте сыворотку крови крыс к процессу тестирования и храните ее при комнатной температуре (ОТ) не менее 30 минут.
  4. Настройте глухие лунки и стандартные лунки для образца, который будет исследуем. Добавьте в общей сложности 50 мкл стандартных образцов в ферментный планшет. Сначала добавьте 40 μL разбавителя, а затем добавьте 10 μL образца в исследуемую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении образцов необходимо добавить их на дно лунки, помеченной ферментом, следя за тем, чтобы они максимально не касались стенки лунки, а также аккуратно встряхнуть и хорошо перемешать. Пустая лунка не содержит образцов или меченых ферментами реагентов, и другие этапы такие же. Итоговое разведение пробы – 5 раз.
  5. Запечатав пластину герметизирующей пленкой, поместите ее в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут.
  6. Разбавьте в 30 раз концентрированный моющий раствор дистиллированной водой и отставьте в сторону.
  7. Снимите герметизирующую пленку, вылейте жидкость из лунки и вытряхните ее насухо. Наполните каждую лунку жидкостью для стирки, дайте ей постоять 30 с, а затем вылейте ее. Повторите этот шаг 5 раз, и, наконец, вытряхните его насухо.
  8. Добавьте меченный пероксидазой хрена авидин (100 мкл на лунку).
  9. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл проявителя цвета А, затем добавьте 50 мл проявителя цвета В. Осторожно встряхните и перемешайте, а затем поместите в среду при температуре 37 °C на 10 минут в темноте.
  10. Добавьте 50 мкл раствора для остановки в лунку, чтобы завершить реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе синий цвет станет желтым.
  11. Обнулите холостые лунки и измерьте оптическую плотность (значение наружного диаметра) каждой лунки последовательно на длине волны 450 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

САНТИСТОКС: По сравнению с модельной группой, количество подъемов ног в группе через 6 ч после туйны было достоверно снижено, и разница была статистически значимой (P < 0,05). По сравнению с фиктивной группой количество подъемов ног в модельной группе было достоверно увеличено, и разница была статистически значимой (P < 0,05) (табл. 3, рис. 3).

МВТ: По сравнению с модельн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В исследовании использовалась малая модель ЧМТ для моделирования pNP, вызванного клиническим повреждением седалищного нерва. Малая модель ЧМТ предполагает непрерывную, хроническую компрессию и фиксацию нервного ствола путем лигирования, сопровождающуюся постепенным отеком лигатуры, что приводит к отеку внутри седалищного нерва и формированию стабильной хронической боли через 3-5 дней27,28. В предварительном исследовании исследова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о каких-либо конфликтах интересов, финансовых или иных.

Благодарности

Авторы получили финансирование на исследование, написание и публикацию этой статьи от Национального фонда естественных наук Китая (NoNo 82074573 и 82274675) и Пекинского фонда естественных наук (No 7232278).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наркозный аппаратRuiwode Life Technology Co., Ltd., Шэньчжэнь, КитайR500Оборудование для респираторной анестезии животных Хромовый
кишечный шовShandong Boda Medical Products Co., Ltd., КитайBD210903Рассасывающийся хирургический шовный материал, в основном изготовленный из белка коллагена, полученного из кишечника здоровых молодых коз
Электронный инструмент фон ФреяBioseb, СШАBIO-EVF5Прибор для определения механического порога вывода
Интеллектуальный детектор боли на холодной и горячей пластинеAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd, Китай.ZH-6CПрибор для определения порога холодовой чувствительности
IsofluraneRuiwode Life Technology Co., Ltd., Шэньчжэнь, КитайR510-22-10Обезболивающий
многофункциональный полноволновой микропланшетный ридерMolecular Devices (Shanghai) Co., Ltd.SpectraMax M2Прибор для определения оптической плотности (OD)
Прибор для термической анальгезииChengdu Techman Software Co., Ltd., КитайPL-200Прибор для обнаружения задержки теплового отвода

Ссылки

  1. IASP taxonomy. ISAP. , Available from: https://www.iasp-pain.org/resources/terminology/#.2022 (2022).
  2. Baron, R., Binder, A., Wasner, G. Neuropathic pain: diagnosis, pathophysiological mechanisms, and treatment. Lancet Neurol. 9 (8), 807-819 (2010).
  3. Colloca, L., et al. Neuropathic pain. Nat Rev Dis Primers. 3, 17002(2017).
  4. Liu, Z., et al. A review on the mechanism of tuina promoting the recovery of peripheral nerve injury. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 6652099(2021).
  5. Scholz, J., et al. The IASP classification of chronic pain for ICD-11: chronic neuropathic pain. Pain. 160 (1), 53-59 (2019).
  6. Finnerup, N. B., et al. Pharmacotherapy for neuropathic pain in adults: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 14 (2), 162-173 (2015).
  7. Field, T. Massage therapy research review. Complement. Ther Clin Pract. 24, 19-31 (2016).
  8. Gok Metin, Z., et al. Aromatherapy massage for neuropathic pain and quality of life in diabetic patients. J Nurs Scholarsh. 49, 379-388 (2017).
  9. Izgu, N., et al. Effect of aromatherapy massage on chemotherapy-induced peripheral neuropathic pain and fatigue in patients receiving oxaliplatin: An open label quasi-randomized controlled pilot study. Cancer Nurs. 42, 139-147 (2019).
  10. Li, Y., et al. Mild mechanic stimulate on acupoints regulation of CGRP-positive cells and microglia morphology in spinal cord of sciatic nerve injured rats. Front Integr Neurosci. 13, 58(2019).
  11. Liu, Z. F., et al. Tuina for peripherally-induced neuropathic pain: A review of analgesic mechanism. Front Neurosci. 16, 1096734(2022).
  12. Lv, T., et al. Using RNA-seq to explore the repair mechanism of the three methods and three-acupoint technique on DRGs in sciatic nerve injured rats. Pain Res Manag. 2020, 7531409(2020).
  13. Xing, F., et al. MZF1 in the dorsal root ganglia contributes to the development and maintenance of neuropathic pain via regulation of TRPV1. Neural Plast. 2019, 2782417(2019).
  14. Cohen, S. P., Mao, J. Neuropathic pain: mechanisms and their clinical implications. BMJ. 348, 7656(2014).
  15. Tao, Y., et al. Effect of Bo'fa method on the expression of IL-1β in peripheral serum and 5-HT2A in spinal cord of CCI model rats. Global Traditional Chinese Medicine. 10, 905-909 (2017).
  16. Yang, J., et al. Study on curative effect of Duhuo Jisheng decoction combined with Tuina in patients with lumbar disc herniation and changes of TXB2, TNF-α and IL-1β. Chin Arch Tradit Chin Med. 38, 44-46 (2020).
  17. Yao, C., et al. Effects of acupressure at 'Shenshu' (BL 23)on lumbar intervertebral disc degeneration and related pain in aging rats. Chin J Tradit Chin Med Pharm. 37, 4360-4365 (2022).
  18. Wang, H., et al. Exploring the mechanism of immediate analgesic effect of 1-time tuina intervention in minor chronic constriction injury rats using RNA-seq. Front Neurosci. 16, 1007432(2022).
  19. Yao, C., et al. Exploring the mechanism of tuina-induced central analgesia in rats with lumbar disc herniation based on the p38MAPK signaling pathway. Chin J Tradit Chin Med Pharm. 38 (07), 3348-3352 (2023).
  20. Li, P. Study on the effects of modified Chuanqianghuo Decoction combined with tuina and physiotherapy on shoulder joint function and inflammation in patients with shoulder joint pain. New Chinese Medicine. 54 (13), 93-97 (2022).
  21. Ding, C., et al. Clinical efficacy of acupuncture and moxibustion, tuina and external application of traditional Chinese medicine on lumbar disc herniation and serum TXB2, IL-1β, Comparison of IL-10 levels. Advances in Modern Biomedicine. 21 (14), 2730-2734 (2021).
  22. Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
  23. Grace, P. M., et al. A novel animal model of graded neuropathic pain: Utility to investigate mechanisms of population heterogeneity. J Neurosci Methods. 193, 47-53 (2010).
  24. Wang, H., et al. Comparison of the characteristics of minor and classic CCI models. J Chin J Comp Med. 32 (10), 1-7 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. An intelligent massage and tuina technique simulator. , Beijing. CN219398169U,19393681 (2023).
  26. Jia, D. Effects of three methods and three points stimulation on sensory function in rats with sciatic nerve injury. , Available from: https://kns.cnki.net (2017).
  27. Grace, P. M., et al. Adoptive transfer of peripheral immune cells potentiates allodynia in a graded chronic constriction injury model of neuropathic pain. Brain Behav Immun. 25 (3), 503-513 (2011).
  28. MacDonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  29. Pan, F., et al. Chinese tuina downregulates the elevated levels of tissue plasminogen activator in sciatic nerve injured Sprague-Dawley rats. Chinese J Integr Med. 23 (8), 617-624 (2017).
  30. Lv, T., et al. An investigation into the rehabilitative mechanism of tuina in the treatment of sciatic nerve injury. Evid Based Complement Alternat Med. 2020, 5859298(2020).
  31. Lv, T., et al. Applying RNA sequencing technology to explore repair mechanism of Tuina on gastrocnemius muscle in sciatic nerve injury rats. Chin Med J. 135 (19), 2378-2379 (2022).
  32. Ruan, Y., et al. An effective and concise device for detecting cold allodynia in mice. Sci Rep. 8 (1), 14002(2018).
  33. Kim, S. O., Kim, H. J. Berberine ameliorates cold and mechanical allodynia in a rat model of diabetic neuropathy. J Med Food. 16 (6), 511-517 (2013).
  34. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Front Mol Neurosci. 10, 284(2017).
  35. Ruscheweyh, R., et al. Long-term potentiation in spinal nociceptive pathways as a novel target for pain therapy. Mol Pain. 7, 20(2011).
  36. Hargreaves, K., et al. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  37. Cheah, M., et al. Assesment of thermal pain sensation in rats and mice using the hargreaves test. Bio Protoc. 7 (16), 2506(2017).
  38. Challa, S. R. Surgical animal models of neuropathic pain: pros and cons. Int J Neurosci. 125 (3), 170-174 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анальгезия методом Туйнанейропатическая больмодель хронического сдавления (CCI)пороги болевой чувствительностипорог чувствительности к холодупорог механического отдергиваниялатентный период термического отдергиванияэкспрессия цитокиновповреждение седалищного нервамодель боли у крыс
Характеристика болевых изменений у крыс с повреждением нервов в течение 24 часов после однократного вмешательства Туйна
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.