Метод вертикальной иммобилизации для анализа методом покадровой микроскопии нитчатых цианобактерий

Summary

Представлен простой и доступный метод нитевидной визуализации цианобактерий в плоскости XY. Была использована агарозная матрица с низкой температурой плавления, позволяющая получать изображения белков, участвующих в делении, в вертикальной ориентации. Таким образом, эта методика может быть применена к любому нитевидному организму и различным видам белков.

Abstract

Основным событием в делении бактериальных клеток является процесс септации, где белок FtsZ является ключевым элементом. FtsZ полимеризуется, образуя кольцеобразную структуру (Z-кольцо) в середине клетки, которая служит каркасом для других белков деления. Микроскопия сверхвысокого разрешения на бактериальных моделях Escherichia coli и Bacillus subtilis показала, что Z-кольцо является прерывистым, в то время как исследования визуализации живых клеток показали, что FtsZ движется вдоль кольца с помощью механизма, известного как беговая дорожка. Для изучения динамики FtsZ in vivo необходимо специальное размещение ячейки в вертикальном положении для визуализации полной структуры кольца в плоскости XY. В случае визуализации FtsZ у многоклеточных цианобактерий, таких как Anabaena sp. PCC7120, поддержание нитей в вертикальном положении является сложной задачей из-за размера клеток и длины нитей. В этой статье мы описываем метод, который позволяет вертикально иммобилизовать нити Anabaena sp. PCC 7120 с использованием агарозы и шприцев с низкой температурой плавления для записи Z-кольца в мутанте, экспрессирующем слитый белок FtsZ-sfGFP. Этот метод является быстрым и недорогим способом регистрации динамики белка в месте деления с помощью конфокальной микроскопии.

Introduction

Деление бактериальных клеток — это процесс, при котором материнская клетка генерирует две дочерние клетки, в большинстве случаев с помощью механизма, известного как бинарное деление. Одним из самых ранних событий в процессе септации является локализация FtsZ в середине клетки¹. Этот белок, который структурно гомологичен тубулину², сохраняется и широко распространен у большинства бактерий, а его полимеризация создает сократительную структуру, известную как Z-кольцо³. Это кольцо служит каркасом для других белков деления, и вместе они образуют молекулярный механизм, называемый дивисомой. Несколько исследований показали, что Z-кольцо очень динамично и что протофиламенты FtsZ движутся с помощью беговой дорожки ^4,5,6. Для изучения Z-кольца в покадровых экспериментах целесообразно записать участок деления в плоскости XY для лучшего разрешения и быстрой выборки. Для достижения этой цели необходимо разработать методы вертикальной иммобилизации клеток, которые обычно включают наноизготовление микродырочных клеточных ловушек и сложных микрофлюидных устройств⁷.

Цианобактерии - это фотосинтезирующие микроорганизмы, которые классифицируются как грамотрицательные по своей клеточной морфологии. Однако филогенетически они ближе к грамположительным бактериям⁸. Эти организмы имеют гены клеточного деления, которые распространены в грамположительных и грамотрицательных бактериях, но их дивисома также содержит уникальные элементы⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (далее Anabaena sp.) представляет собой нитчатые цианобактерии с одной плоскостью деления и является моделью для изучения клеточного деления у многоклеточных цианобактерий. В этом штамме удалось определить положение FtsZ в середине ячеек¹⁰. Тем не менее, исследований, показывающих динамику FtsZ in vivo в этой модели, нет. В нашей лаборатории путем триродительского спаривания и гомологичной рекомбинации мы получили полностью сегрегированный мутант Anabaena sp., который экспрессирует белок FtsZ, слитый с sfGFP, который заменил полный эндогенный ген ftsZ. Мы разработали быстрый и простой метод иммобилизации клеток, который способствует вертикальной ориентации нитей мутантных штаммов для покадровых экспериментов по визуализации белков деления в нитевидных цианобактериях. Этот метод не нуждается в микрофлюидных устройствах, которые могут быть дорогими и сложными в разработке. В качестве примера мы использовали этот протокол для визуализации Z-кольца в мутанте FtsZ-sfGFP с помощью конфокальной микроскопии.

Protocol

1. Соображения и выбор клеточной модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Цианобактерии обладают сильной автофлуоресценцией из-за присутствия фотосинтетических пигментов. Этот сигнал находится в красной части спектра, поэтому флуоресцентные белки, подходящие для визуализации у цианобактерий, далеки от красного излучения. Например, GFP, YFP, Venus, Turquoise и BFP.

1. Выберите компонент дивисомы, присутствующий в целевом нитчатом штамме цианобактерий. Для экспериментов необходимо сконструировать нитчатый мутант цианобактерий, экспрессирующий выбранный компонент дивисомы, слитый с флуоресцентным белком. В этом протоколе в качестве примера можно привести мутант Anabaena sp., который экспрессирует FstZ-sfGFP. Этот штамм был получен путем трехродительского спаривания с E. coli¹¹.
2. Проверьте уровень сегрегации мутанта, который будет использоваться. В примере сегрегацию определяли методом ПЦР-амплификации гена-мишени. Мутант FtsZ-sfGFP, используемый в этом протоколе, представляет собой полностью сегрегированный штамм, в котором отсутствует ген ftsZ дикого типа.

2. Условия произрастания

1. Сделайте свежую субкультуру мутанта, используя 10 мл культуры в стационарной фазе (выращиваемой в течение примерно 14 дней при постоянном освещении при 25 ° C для Anabaena sp.) и добавляя к 90 мл среды BG11 с добавлением антибиотиков (спектиномицин и стрептомицин 10 мкл мл-1 для мутанта FtsZ-sfGFP).
2. Выращивайте новую клеточную культуру при постоянном освещении и при оптимальной температуре до достижения экспоненциальной фазы. Мутант FtsZ-sfGFP Anabaena sp. выращивают при 25 °C в течение 7 дней перед пробоподготовкой.

3. Пробоподготовка в агарозной матрице

1. Возьмите 2 мл гомогенизированной ростовой культуры.
2. Центрифуга при 2 500 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Тем временем в колбе объемом 50 мл нагрейте 30 мл 3% агарозы с низкой температурой плавления в жидкой среде BG11. Используйте микроволновую печь, установленную на средний уровень мощности, и проверяйте раствор каждые 15 с до полного растворения. Отложите в сторону, чтобы остыть до 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавируйте раствор агарозы, чтобы избежать загрязнения.
4. После завершения центрифугирования откажитесь от 1,9 мл надосадочной жидкости и ресуспендируйте клетки в оставшемся объеме, пипетируя не менее трех раз вверх и вниз.
5. Смешайте ресуспендированные клетки с 900 мкл 3% раствора агарозы, пипеткой вверх и вниз не менее трех раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор агарозы должен быть жидким, но не слишком горячим, чтобы избежать повреждения клеток. Следующий шаг должен быть выполнен быстро и до того, как раствор агарозы образует гелеобразную консистенцию =.
6. Осторожно аспирируйте агарозный матрикс в шприц объемом 1 мл. Важно избегать образования пузырьков во время аспирации образца с помощью шприца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом убедитесь, что кончик шприца отрезан, чтобы исключить узкое входное отверстие.
7. Дайте образцу-агарозной смеси застыть, поместив шприц в горизонтальное положение при комнатной температуре на 2 часа.
8. Осторожно снимите агарозную матрицу с помощью поршня и положите ее на чистую и ровную поверхность.
9. Застывший образец нарезать ломтиками, в диапазоне толщин 0,5 – 1 мм, сохраняя целостность матрицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего результата разрежьте агарозную матрицу с помощью скальпеля или тонких бритвенных лезвий.
10. Положите ломтики рядом на покровное стекло. Количество дисков на покровном листе будет зависеть от его габаритов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для покадровой микроскопии рекомендуется использовать клеточную камеру, предназначенную для микроскопического анализа (например, магнитные камеры Attofluor или Chamlide). Эти камеры позволяют получать образец, избегая обезвоживания. В этом примере образцы готовятся на закругленных покровных стеклах (25 мм) с использованием камеры Attofluor.
11. Добавьте 2 мл расплавленного 3% раствора агарозы на образец, помещенный в камеру, чтобы предотвратить обезвоживание.
12. Дождитесь полного застывания раствора агарозы, чтобы образовался гель.

4. Получение изображения

1. Стандартизировать параметры для визуализации интересующего флуоресцентного белка в мутантном штамме в конфокальном микроскопе. Убедитесь, что микроскоп может обнаружить как автофлуоресценцию, так и выбранный флуоресцентный маркер.
2. Визуализируйте образец в конформации яркого поля с максимальным увеличением и найдите вертикально ориентированную нить, как показано на рисунке 1.
3. Найдите интересующий участок деления с помощью начального сканирования с использованием сигнала автофлуоресценции вдоль плоскости Z.
4. Используйте параметры маркера флуоресцентного белка для визуализации сигнала интересующего белка в месте деления.
5. Проводите покадровые эксперименты в соответствии с биологической моделью и интересующим белком. Например, в этом случае были проведены покадровые эксперименты продолжительностью 10 с за 50 с для регистрации динамики FtsZ вдоль Z-кольца у Anabaena sp. (рис. 2).

Results

Визуализация Z-кольца у Anabaena sp. методом вертикальной иммобилизации
Для изучения динамики компонентов Z-кольца у бактерий необходимо получение изображений в вертикально ориентированных клетках. В этом положении можно визуализировать Z-кольцо и основные белки дивисомы для мониторинга динамики белков с помощью покадровой микроскопии. Классическая пробоподготовка для бактерий не работает для нитчатых цианобактерий. В случае Anabaena sp. нити ориентированы в положении, которое не поз...

Discussion

Изучение динамики дивисомных белков, без сомнения, является сложной задачей. В частности, у нитчатых цианобактерий одной из проблем является визуализация Z-кольца в горизонтальной плоскости, для чего клетки должны быть ориентированы вертикально. Метод, который мы здесь описали, позволяет позиционировать Z-кольцо в плоскости XY для выполнения различных анализов. Это первый простой метод для нитчатых цианобактерий, который позволяет полностью визуализировать Z-кольцо.

Несмотря на то, что этот п...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Шприц 1 мл	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	Одноразовый медицинский пластиковый шприц с иглой 1 мл обычно используется для перекачивания жидкости или инъекционной жидкости, в этом эксперименте он используется для отсасывания образца и его полимеризации.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	Cell-камера Attofluor представляет собой прочный и практичный держатель покровного стекла, предназначенный для просмотра живых образцов клеток в вертикальном или перевернутом микроскопе.
Термоамплификатор Axygen MaxyGene II с блоком на 96 лунок	CORNING	THERM-1001	Новый термоамплификатор MaxyGene II с увеличенной скоростью и расширенными функциями, обеспечивающими превосходную производительность, которую вы привыкли ожидать от продукции бренда Axygen. Уникальное гибкое программирование. Быстрое время работы. Улучшен рабочий процесс по сравнению с традиционными градиентными амплификаторами. Наращивание темпов до 5°С; К/сек. Регулируемая крышка с подогревом вмещает полоски, трубки и микропланшеты.
Чехлы Fisherbrand: круги	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Изготовлены из тончайшего оптического боросиликатного стекла, с одинаковой толщиной и размером. Круглая форма. Коррозионная стойкость.
Агароза с низкой температурой плавления	Promega	V3841	Agarose, низкая температура плавления, аналитический класс, идеально подходит для применений, требующих восстановления неповрежденных фрагментов ДНК после гель-электрофореза.
Микроскоп LSM 880 от Zeiss Airyscan		Zeiss-Микроскоп	Zeiss Airyscan LSM 880 представляет собой лазерный сканирующий фокальный микроскоп, который может получать изображения с пределом разрешения (боковое разрешение ~ 120 нм и осевое разрешение ~ 350 нм). Детекторы обладают высокой чувствительностью, что позволяет получать изображения сверхвысокого разрешения с высокой скоростью.
Микроцентр; fuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Ускорьте рутинные процессы подготовки образцов до 17 000 г с помощью нашей стандартной микроцентрифуги, доступной в охлаждении. Эти микроцентрифуги обеспечивают производительность, универсальность, безопасность и удобство в простом в использовании и компактном лабораторном приборе.
		Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Nikon C2 является идеальным микроскопом для длительной таймлапс-съемки, ведь благодаря своей инкубационной камере можно выдерживать образцы в оптимальных условиях более 8 часов.
Тонкие бритвенные лезвия Schick Super Chromium	Farmazon	Артикул: 401146	Тонкие бритвенные лезвия используются для резки агарозной матрицы, что позволяет получить диски с образцом с сохранением целостности матрицы.