Метод вертикальной иммобилизации для анализа методом покадровой микроскопии нитчатых цианобактерий

Краткое содержание

Представлен простой и доступный метод нитевидной визуализации цианобактерий в плоскости XY. Была использована агарозная матрица с низкой температурой плавления, позволяющая получать изображения белков, участвующих в делении, в вертикальной ориентации. Таким образом, эта методика может быть применена к любому нитевидному организму и различным видам белков.

Аннотация

Основным событием в делении бактериальных клеток является процесс септации, где белок FtsZ является ключевым элементом. FtsZ полимеризуется, образуя кольцеобразную структуру (Z-кольцо) в середине клетки, которая служит каркасом для других белков деления. Микроскопия сверхвысокого разрешения на бактериальных моделях Escherichia coli и Bacillus subtilis показала, что Z-кольцо является прерывистым, в то время как исследования визуализации живых клеток показали, что FtsZ движется вдоль кольца с помощью механизма, известного как беговая дорожка. Для изучения динамики FtsZ in vivo необходимо специальное размещение ячейки в вертикальном положении для визуализации полной структуры кольца в плоскости XY. В случае визуализации FtsZ у многоклеточных цианобактерий, таких как Anabaena sp. PCC7120, поддержание нитей в вертикальном положении является сложной задачей из-за размера клеток и длины нитей. В этой статье мы описываем метод, который позволяет вертикально иммобилизовать нити Anabaena sp. PCC 7120 с использованием агарозы и шприцев с низкой температурой плавления для записи Z-кольца в мутанте, экспрессирующем слитый белок FtsZ-sfGFP. Этот метод является быстрым и недорогим способом регистрации динамики белка в месте деления с помощью конфокальной микроскопии.

Введение

Деление бактериальных клеток — это процесс, при котором материнская клетка генерирует две дочерние клетки, в большинстве случаев с помощью механизма, известного как бинарное деление. Одним из самых ранних событий в процессе септации является локализация FtsZ в середине клетки¹. Этот белок, который структурно гомологичен тубулину², сохраняется и широко распространен у большинства бактерий, а его полимеризация создает сократительную структуру, известную как Z-кольцо³. Это кольцо служит каркасом для других белков деления, и вместе они образуют молекулярный механизм, называемый дивисомой. Несколько ис....

Протокол

1. Соображения и выбор клеточной модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Цианобактерии обладают сильной автофлуоресценцией из-за присутствия фотосинтетических пигментов. Этот сигнал находится в красной части спектра, поэтому флуоресцентные белки, подходящие для визуализации у цианобактерий, далеки от красного излучения. Например, GFP, YFP, Venus, Turquoise и BFP.

1. Выберите компонент дивисомы, присутствующий в целевом нитчатом штамме цианобактерий. Для экспериментов необходимо сконструировать нитчатый мутант цианобактерий, экспрессирующий выбранный компонент дивисомы, слитый с флуоресцентным белком. В этом протоколе в качестве примера м....

Результаты

Визуализация Z-кольца у Anabaena sp. методом вертикальной иммобилизации
Для изучения динамики компонентов Z-кольца у бактерий необходимо получение изображений в вертикально ориентированных клетках. В этом положении можно визуализировать Z-кольцо и основные белки дивисомы для мониторинга динамики белков с помощью покадровой микроскопии. Классическая пробоподготовка для бактерий не работает для нитчатых цианобактерий. В случае Anabaena sp. нити ориентированы в положении, которое не поз.......

Обсуждение

Изучение динамики дивисомных белков, без сомнения, является сложной задачей. В частности, у нитчатых цианобактерий одной из проблем является визуализация Z-кольца в горизонтальной плоскости, для чего клетки должны быть ориентированы вертикально. Метод, который мы здесь описали, позволяет позиционировать Z-кольцо в плоскости XY для выполнения различных анализов. Это первый простой метод для нитчатых цианобактерий, который позволяет полностью визуализировать Z-кольцо.

Несмотря на то, что этот п.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц 1 мл	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	Одноразовый медицинский пластиковый шприц с иглой 1 мл обычно используется для перекачивания жидкости или инъекционной жидкости, в этом эксперименте он используется для отсасывания образца и его полимеризации.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	Cell-камера Attofluor представляет собой прочный и практичный держатель покровного стекла, предназначенный для просмотра живых образцов клеток в вертикальном или перевернутом микроскопе.
Термоамплификатор Axygen MaxyGene II с блоком на 96 лунок	CORNING	THERM-1001	Новый термоамплификатор MaxyGene II с увеличенной скоростью и расширенными функциями, обеспечивающими превосходную производительность, которую вы привыкли ожидать от продукции бренда Axygen. Уникальное гибкое программирование. Быстрое время работы. Улучшен рабочий процесс по сравнению с традиционными градиентными амплификаторами. Наращивание темпов до 5°С; К/сек. Регулируемая крышка с подогревом вмещает полоски, трубки и микропланшеты.
Чехлы Fisherbrand: круги	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Изготовлены из тончайшего оптического боросиликатного стекла, с одинаковой толщиной и размером. Круглая форма. Коррозионная стойкость.
Агароза с низкой температурой плавления	Promega	V3841	Agarose, низкая температура плавления, аналитический класс, идеально подходит для применений, требующих восстановления неповрежденных фрагментов ДНК после гель-электрофореза.
Микроскоп LSM 880 от Zeiss Airyscan		Zeiss-Микроскоп	Zeiss Airyscan LSM 880 представляет собой лазерный сканирующий фокальный микроскоп, который может получать изображения с пределом разрешения (боковое разрешение ~ 120 нм и осевое разрешение ~ 350 нм). Детекторы обладают высокой чувствительностью, что позволяет получать изображения сверхвысокого разрешения с высокой скоростью.
Микроцентр; fuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Ускорьте рутинные процессы подготовки образцов до 17 000 г с помощью нашей стандартной микроцентрифуги, доступной в охлаждении. Эти микроцентрифуги обеспечивают производительность, универсальность, безопасность и удобство в простом в использовании и компактном лабораторном приборе.
		Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Nikon C2 является идеальным микроскопом для длительной таймлапс-съемки, ведь благодаря своей инкубационной камере можно выдерживать образцы в оптимальных условиях более 8 часов.
Тонкие бритвенные лезвия Schick Super Chromium	Farmazon	Артикул: 401146	Тонкие бритвенные лезвия используются для резки агарозной матрицы, что позволяет получить диски с образцом с сохранением целостности матрицы.