Method Article

Применение проточного цитометрического анализа для измерения множественных митохондриальных параметров в 3D-органоидах мозга

DOI:

10.3791/65621

⸱

August 4th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлен уникальный метод использования проточного цитометра и нескольких антител для одновременной оценки нескольких митохондриальных функциональных параметров, включая изменения объема митохондрий, количество сложных субъединиц митохондриальной дыхательной цепи (MRC) и репликацию митохондриальной ДНК (мтДНК).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондриальная дисфункция является распространенным первичным или вторичным фактором многих типов нейродегенерации, и изменения в митохондриальной массе, комплексах митохондриальной дыхательной цепи (MRC) и количестве копий митохондриальной ДНК (мтДНК) часто участвуют в этих процессах. Органоиды человеческого мозга, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека, повторяют трехмерное (3D) цитоархитектурное устройство мозга и дают возможность изучать механизмы заболевания и проводить скрининг новых методов лечения в сложной системе человека. В этой статье мы сообщаем об уникальном подходе, основанном на проточной цитометрии, для измерения нескольких митохондриальных параметров в корковых органоидах, полученных из iPSC. В этом отчете подробно описан протокол генерации кортикальных органоидов головного мозга из ИПСК, диссоциации одиночных клеток сгенерированных органоидов, фиксации, окрашивания и последующего проточного цитометрического анализа для оценки нескольких митохондриальных параметров. Двойное окрашивание антителами против субъединицы комплекса MRC NADH: субъединицы убихиноноксидоредуктазы B10 (NDUFB10) или митохондриального транскрипционного фактора А (TFAM) вместе с потенциал-зависимым анион-селективным каналом 1 (VDAC 1) позволяет оценить количество этих белков в митохондрии. Поскольку количество TFAM соответствует количеству мтДНК, это позволяет косвенно оценить количество копий мтДНК на одно митохондриальное содержимое. Вся эта процедура может быть завершена в течение 2-3 часов. Важно отметить, что это позволяет проводить одновременную количественную оценку нескольких митохондриальных параметров, включая как общие, так и специфические уровни относительно митохондриальной массы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии являются важными клеточными органеллами и основным местом производства аденозинтрифосфата (АТФ). В дополнение к обеспечению клеток энергией, митохондрии также участвуют во многих клеточных процессах, включая передачу клеточной информации, дифференцировку клеток и апоптоз, а также обладают способностью регулировать рост клеток и клеточный цикл. Изменения функции митохондрий были выявлены при различных нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Паркинсона (БП)1,2, болезнь Альцгеймера (БА)3 и боковой амиотрофический склероз (БАС)4. Митохондриальная дисфункция играет роль в процессе старения, накапливая соматические мутации мтДНК и снижая функцию дыхательной цепи5.

Различные типы митохондриальной дисфункции возникают при нейродегенерации, и возможность измерения таких изменений чрезвычайно полезна при изучении механизмов заболевания и тестировании потенциальных методов лечения. Кроме того, создание подходящих модельных систем in vitro, которые повторяют болезнь в клетках мозга человека, имеет жизненно важное значение для лучшего понимания механизмов заболевания и разработки новых методов лечения. ИПСК пациентов с нейродегенеративными заболеваниями были использованы для создания различных клеток мозга, которые проявляют повреждение митохондрий 6,7,8,9. Разработка трехмерных органоидов мозга, полученных из ИПСК ИПСК является важным шагом в моделировании заболеваний. Эти органоиды мозга, полученные из iPSC, обеспечивают сложность и содержат собственный генетический фон пациента, тем самым обеспечивая модель заболевания, которая более точно отражает патологию в мозге пациента.

Несмотря на то, что были проведены некоторые исследования митохондриальных исследований с использованием органоидов мозга, полученных из ИПСК 10,11,12, удобные и надежные методы определения множественных митохондриальных функциональных параметров в органоидах мозга, полученных из ИПСК, остаются ограниченными. Проточная цитометрия является мощным инструментом для измерения митохондриальных параметров на уровне отдельных клеток, как мы уже демонстрировалиранее13. В этом исследовании представлен подробный протокол генерации кортикальных органоидов из ИПСК в сочетании с новым подходом, основанным на проточной цитометрии, для одновременного измерения нескольких митохондриальных параметров, включая митохондриальную массу, субъединицы комплекса дыхательной цепи и количество копий мтДНК (рис. 1). Важно отметить, что, используя митохондриальную массу в качестве знаменателя, эти протоколы позволяют измерять как общий, так и специфический уровни на митохондриальную единицу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Дифференцировка ИПСК в корковые органоиды

  1. Подготовка пластин с матричным покрытием
    1. Разморозьте флакон имеющейся в продаже матрицы базальной мембраны на льду на ночь. Разведите в соотношении 1:100 в холодном Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 (конечная концентрация 1%). Сделайте аликвоты и храните их при температуре -20 °C (см. Таблицу материалов).
    2. Разморозьте раствор мембранной матрицы при температуре 4 °C (держите его холодным) и обмажьте необходимое количество лунок (1 мл на одну лунку в 6-луночном планшете). Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Достаньте тарелку из инкубатора и дайте ей нагреться до комнатной температуры (RT) (оставьте на час).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелки можно хранить до 2 недель в холодильнике (не забудьте вынуть их и прогреть необходимые для этого дня лунки с покрытием в RT, пока они не перестанут остывать на ощупь перед использованием). Рекомендуется использовать пластины в течение 3 дней. Для длительного хранения добавьте 1 мл Essential 8 Medium (см. Таблицу материалов) в пластину с покрытием, чтобы избежать высыхания геля.

2. Препарат Эссенциал 8 (Е8) среда для посева iPSC

  1. В стерильной среде приготовьте среду Е8, сочетая базальную среду Е8 с добавкой Е8 (см. Таблицу материалов). Его можно хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте замороженную добавку E8 при 4 °C в течение ночи перед приготовлением готовой среды. Размораживать замороженную добавку при 37 °C не рекомендуется; использовать E8 Medium в течение 2 недель. Перед использованием необходимо согреть E8 Medium в течение этого дня в RT до тех пор, пока он не перестанет быть холодным на ощупь.

3. Субкультурация ИПСК

  1. Предварительно подогреть пластины с матричным покрытием в RT или инкубаторе при температуре 37 °C в течение 20-30 минут. Предварительно разогрейте необходимое количество E8 Medium по RT.
  2. Отсадите питательную среду с помощью пипетки.
  3. Промойте иПСК (см. Таблицу материалов) фосфатно-солевым буфером Дульбекко (Ca2+/Mg2+ free) (DPBS-/-) (4 мл на одну лунку в 6-луночном планшете).
  4. Добавьте этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (0,5 мМ) (1 мл на одну лунку в 6-луночном планшете). Инкубируйте при температуре 37 °C до тех пор, пока края колоний не начнут отделяться от пластины (обычно 3-5 минут).
  5. Отсасывайте диссоциативный раствор.
  6. Добавьте предварительно подогретую среду E8 (4 мл на одну лунку в 6-луночном планшете) и под высоким давлением отделите колонии iPSC.
  7. Переложите в две разные лунки в 6-луночный планшет с матричным покрытием (2 мл на одну лунку в 6-луночном планшете) и инкубируйте при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно встряхните перед тем, как поместить пластину в инкубатор. Коэффициент разделения может составлять 1:2-1:4.
  8. Обменивайтесь медиа ежедневно, пока колонии не получат 80% слияния с хорошим размером и соединениями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторьте колонии соответствующего размера, обычно характеризующиеся четко выраженной круглой формой и диаметром от 0,5 до 1 мм. Колонии должны демонстрировать плотную, компактную структуру с четко очерченными, плавными границами.

4. Формирование эмбриоидных тел (БЭ) и нервная индукция

  1. Приготовьте нейроиндукционную среду (NIM), комбинируя компоненты, перечисленные в Таблице материалов.
  2. Отсадите среду и промойте клетки DPBS -/- (4 мл на лунку в 6-луночном планшете).
  3. Добавьте в лунку предварительно подогретую Аккутазу (1 мл на лунку в 6-луночном планшете) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут.
  4. Аккуратно пипетируйте раствор вверх и вниз 3–4 раза с помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл.
  5. Нейтрализуйте 2 мл DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и центрифугируйте коническую пробирку объемом 15 мл с клетками при 600 x g в течение 5 минут при RT. Аспирируйте надосадочную жидкость.
  6. Повторно суспендируйте клеточные гранулы, аккуратно пипетируя вверх и вниз до одноклеточных поддонов.
  7. Подсчитывайте и рассчитывайте концентрацию живых клеток с помощью трипана синего14 в автоматическом счетчике клеток.
  8. Рассчитайте коэффициент разведения и разбавьте клетки в NIM, чтобы конечная концентрация клеток составила 60 000 живых клеток/мл.
  9. Добавьте в клеточную суспензию ингибитор Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) Y-27632 (конечная концентрация 50 мкМ) (см. Таблицу материалов) и аккуратно перемешайте.
  10. Добавьте по 150 мкл одноклеточной суспензии в каждую лунку сверхнизкой насадки 96-луночного планшета (см. Таблицу материалов) и поместите в инкубатор. Настройте как Day 0.
  11. В день 1 проверьте клетки и формы EB в каждой лунке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оценивайте успешное образование БЭ на основе их яркого, сферического и полупрозрачного внешнего вида под микроскопом, их способности оставаться свободно плавающими и отдельными, а также отсутствия мертвых клеток, которые проявляются в виде темных пятен.
  12. На 2-й день осторожно удалите 75 мкл среды из каждой лунки и добавьте в каждую лунку 150 мкл NIM вместе с 50 мкМ Y-27632.
  13. На 4, 6 и 8 день удалите по 100 мкл среды из каждой лунки и добавьте 150 мкл NIM в каждую лунку.

5. Генерация корковых органоидов

  1. Приготовьте нейродифференцировочную среду за вычетом витамина А (NDM-), комбинируя компоненты, перечисленные в таблице материалов.
  2. На 10-й день перенесите БЭ с 96-луночного планшета со сверхнизким уровнем насадки на 6-луночный планшет со сверхнизким уровнем насадки с помощью пипетки объемом 5 мл. Осторожно перенесите восемь БЭ в каждую скважину (Рисунок 2). Добавьте по 5 мл NDM- в каждую лунку.
  3. Поместите пластину на орбитальный шейкер внутри инкубатора и начните вращение со скоростью 80 оборотов в минуту.
  4. На 12, 14 и 16 день замените NDM- на 4 мл после аспирации 3 мл старой среды.

6. Созревание и долгосрочное культивирование корковых органоидов

  1. Приготовьте среду для нервной дифференцировки с витамином А (NDM+) и нейротрофическим фактором мозга (BDNF). Подробнее см. Таблицу материалов.
  2. На 18-й день удалите 3 мл среды и добавьте 4 мл NDM+.
  3. Верните тарелку в прядильную культуру.
  4. Кормите каждые 4 дня и поддерживайте дифференцированные корковые органоиды в NDM+ до использования. Для последующего анализа использовали корковые органоиды возрастом 25-40 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корковые органоиды могут поддерживаться дольше (до 3-4 месяцев); Но жизнеспособность клеток будет снижена из-за отсутствия обмена питательными веществами.

7. Характеризация клеток методом иммуноцитохимии и иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. С помощью пипетки объемом 1000 мкл аккуратно соберите органоид из среды и аккуратно поместите его на среду с минимальным количеством среды на стандартном предметном стекле микроскопа.
  2. Дайте полностью высохнуть при RT. Добавьте 4% параформальдегид (PFA) (300 μл на образец) в течение 30 минут. Удалите PFA, а затем дважды промойте PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПФА токсичен и предположительно является канцерогеном. Избегайте попадания на кожу и в глаза, а также обращайтесь под вытяжным шкафом для химикатов.
  3. Добавьте 30% раствор сахарозы (300 μл на образец) в предметные стекла и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
  4. Блокируют и проникают органоиды блокирующим буфером (BB) (300 мкл на образец), содержащим PBS (с Ca2+/Mg2+), 0,3% Triton X-100 и 10% нормальной козьей сыворотки в течение 2 ч при ОТ (или в течение ночи при 4 °C). Обведите органоиды с помощью гидрофобной барьерной ручки, чтобы буфер оставался на предметном стекле.
  5. Наложите образцы с первичным антителом в блокирующий буфер (300 μL на образец), анти-SRY (область определения пола Y)-бокс 2 (SOX2, 1:100) и анти-нейронный маркер туберин бета III (Tuj1, 1:1000) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C в темноте (см. Таблицу материалов).
  6. Стирать в PBS в течение 3 часов с двумя-тремя сменами буфера на пологой качающейся платформе.
  7. Инкубируйте с вторичными антителами (300 мкл на образец), анти-Alexa Flour 488 (1:800) и анти-Alexa Flour 594 (1:800) в течение ночи при 4 °C во влажной темной комнате. Одновременно добавьте ядерное пятно Hoechst 33342 (1:5000) (см. Таблицу материалов).
  8. Аспирируйте антитела и быстро промойте PBS, затем добавьте PBS, содержащий 0,01% NaAzide, в течение 1-2 дней при 4 °C для предотвращения загрязнения.
  9. Отсадите PBS и удалите излишки раствора. Закрепите органоиды с помощью монтажного носителя (см. Таблицу материалов), затем добавьте покровное стекло. Избегайте образования пузырьков воздуха и поместите в темное помещение при температуре RT не менее чем на 12 часов, чтобы крепление полностью полимеризовалось.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь образец готов к представлению под флуоресцентным микроскопом.

8. Диссоциация корковых органоидов

  1. Добавьте 30 мл DPBS -/- в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  2. Аккуратно соберите органоиды мозга в пробирку с помощью пипетки объемом 10 мл. Для одного окрашивания используется не менее 3 органоидов, и они должны быть старше 25 дней, но меньше 40 дней.
  3. Осадить органоиды примерно на 5 мин. Не центрифугировать.
  4. Отсадите DPBS и добавьте в пробирку 2 мл предварительно подогретой Аккутазы. Инкубировать образец на водяной бане в течение 5 минут при температуре 37 °C.
  5. Аккуратно взрастите 15 раз с помощью наконечника для дозатора объемом 1000 μл, не образуя пузырьков. Инкубируйте образец еще 5 минут при температуре 37 °C на водяной бане.
  6. Бережное диссоциирование с помощью наконечников дозатора объемом 1000 мкл 15 раз без образования пузырьков (рис. 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если все еще есть несколько недиссоциированных клеток, перенесите недиссоциированные клетки в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл и затем инкубируйте еще 5 минут при температуре 37 °C водяной бани. Затем аккуратно диссоциируйте с помощью наконечников дозатора объемом 1000 мкл 20 раз.
  7. Нейтрализовать 4 мл DMEM с 10% FBS и центрифугировать коническую пробирку объемом 15 мл с клетками при 600 x g в течение 5 минут при RT.
  8. Асасировать надосадочную жидкость и ресуспендировать 200 мкл DPBS с помощью наконечников дозатора 1000 мкл 10 раз, не образуя пузырьков.
  9. Добавьте 200 μL DPBS, чтобы получить общий объем 400 μL клеточных суспензий в DPBS.
  10. Фильтруйте с помощью фильтра или трубки фильтра (используйте фильтры 35 или 40 μм и промойте фильтр DPBS перед использованием фильтра).
  11. Отделите половину раствора в пробирке и используйте ее как неокрашенный образец.

9. Измерение проточной цитометрии субъединиц комплекса MRC и TFAM в фиксированных клетках

  1. Добавьте окрашивающий краситель Live and Dead (L/D) (1:1000) (см. Таблицу материалов) (либо с дальним красным, либо с ближним инфракрасным диапазоном, в зависимости от настройки маркеров для проточной цитометрии).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если открыт новый флакон с L/D красителем, добавьте 50 μL DMSO для восстановления и сделайте аликвоту 10 μL для хранения при -20 °C.
  2. Держать в RT и темноте 30 минут. Добавьте 40 мл DPBS -/-. Центрифугируйте при 600 x g в течение 5 мин.
  3. Ресуспендия в одноклеточную суспензию после отбрасывания надосадочной жидкости.
  4. Зафиксировать и пропитать клетки 1 мл ледяного 90% метанола при температуре -20 °C в течение 20 минут.
  5. Заблокируйте образцы в 1 мл блочного буфера, содержащего 0,3 М глицина, 5% козьей сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS (с Ca2+/Mg2+).
  6. Промойте проточным буфером объемом 20 мл, содержащим PBS (с Ca2+/Mg2+) с 0,2% BSA один или два раза.
  7. Добавьте первичные антитела anti-NDUFB10, конъюгированные с Alexa Fluor 405 (1:100), анти-VDAC 1, конъюгированные с Alexa Fluor PE (1:100), и антитела против TFAM, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (1:200) в течение 30 минут (см. Таблицу материалов).
  8. Умойте с буфером потока 20 мл.
  9. Отсадите и оставьте около 100 μL и восстановите клеточные гранулы в буфер объемом 300 μL.
  10. Переложите ячейки в проточные трубки объемом 1,5 мл. Хранить в темноте и на льду.
  11. Анализ проводится на проточном цитометре (см. Таблицу материалов). Сигналы были обнаружены для Anti NDUFB10-Alexa 405 с использованием полосового фильтра 450/50, TFAM-Alexa 488 с использованием полосового фильтра 530/30, VDAC 1-Alexa 647 с использованием полосового фильтра 670/14 и красителя L/D с полосовым фильтром 780/60 (рис. 3B).

10. Сбор и анализ проточной цитометрии

  1. Используйте неокрашенные и одинарно окрашенные образцы контрольного органоида для установки напряжения настроек цитометра.
  2. Используйте неокрашенную контрольную трубку для установки диаграмм рассеяния прямой области рассеяния (FSC-A) и боковой области рассеяния (SSC-A) в зависимости от размера и гранулярности популяции клеток (рис. 4A).
  3. Удаление мусора для выбора живых клеток с графиков FSC-A и SSC-A. Выталкивание дублетов с использованием высоты бокового рассеяния (SSC-H) по сравнению с График SSC-A (рис. 4B).
  4. Выберите живые клетки на основе окрашивания красителя L/D путем переключения на APC-cy7 по сравнению с APC-cy7. График FSC-A (рис. 4C).
  5. Используя незапятнанные образцы каждой линии, нарисуйте гейт над основной совокупностью событий в FSC-A vs. графики флуорохромных каналов (FITC, APC, BV 421).
  6. Настройка компенсирует проточный цитометр15.
  7. Используйте контроль изотипа для отрицательного контроля для наблюдения за фоновым окрашиванием.
  8. Выполнение сбора данных.
    1. Выберите живые клетки на основе окрашивания красителя L/D путем переключения на APC-cy7 по сравнению с APC-cy7. график FSC-A (рис. 4C).
    2. Используйте незапятнанное в качестве негативного контроля. Затем, при рассмотрении дела FSC-A против Графики флуорохромных каналов (FITC, APC, BV 421) устанавливают ворота над основной популяцией событий одиночных клеток (рисунок 4D-F).
  9. Выполнение анализа данных с помощью программного обеспечения FlowJo (см. Таблицу материалов).
    1. Продублируйте положения ворот на окрашенных образцах клеток. Запишите количество клеток, которые демонстрируют положительное окрашивание.
    2. Для каждой целевой популяции оцените медианную интенсивность флуоресценции (MFI) различных каналов (FITC, APC, BV 421), нанесенных на ось x гистограммы, чтобы идентифицировать митохондриальный сигнал. Специфические значения для субъединицы комплекса I NDUFB10 и TFAM могут быть определены путем деления MFI экспрессии комплекса или TFAM на индикатор митохондриальной массы, VDAC 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 представлена диаграмма процесса дифференцировки и стратегий, используемых для проточного цитометрического анализа. ИПСК человека культивировали в неадгезивных 96-луночных планшетах для формирования БЭ, а затем переносили в неадгезивные 6-луночные планшеты для получения полностью выращенных кортикальных органоидов. Клеточный состав органоидов валидировали с помощью конфокальной микроскопии после иммуноокрашивания нейрональными16 и глиальными маркерами

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол генерации кортикальных органоидов головного мозга из ИПСК человека и проведения проточного цитометрического анализа митохондриальных параметров в отдельных клетках, выделенных из этих органоидов. Клеточный состав органоидов верифицировали методом конфокальной микроскопии с иммуногистохимическим окрашиванием на маркеры нейрональных и глиальных клеток. Было показано, что стратегия совместного окрашивания на основе проточной цитометрии с анти-NDUFB10, VDAC 1 и TFAM позв...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выражаем искреннюю благодарность Гарету Джону Салливану из Института фундаментальных медицинских наук Университета Осло, Норвегия, за щедрое предоставление нам клеточной линии AG05836 (RRID:CVCL_2B58). Мы выражаем благодарность Центру молекулярной визуализации, Центру проточной цитометрии Университета Бергена в Норвегии. Эта работа была поддержана следующим финансированием: K.L была частично поддержана University of Bergen Meltzers Høyskolefonds (номер проекта: 103517133) и Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (номер проекта: 103816102). L.A.B был поддержан Норвежским исследовательским советом (номер проекта: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat и Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Антитела с использованием в проточной цитометрии
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS biologicalsNBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647Santa cruz technologysc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L/D Исправимый набор для окрашивания мертвых клеток в ближнем инфракрасном диапазонеLife technologiesL10119
Использование антител в иммунофлюорентном окрашивании
anti-Tuj1Abcamab78078
anti-SOX2 Abcamab97959
anti-Alexa Flour 488Thermo Fisher ScientificA28175
anti-Alexa Flour 594Thermo Fisher ScientificA-21442
Commercial cells
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)Предоставлено Гаретом Джоном Салливаном из Института фундаментальных медицинских наук при Университет Осло, Норвегия
Essential 8 Medium (культуральная среда iPSC)
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 Добавка (50x) 2% (v/v)Thermo Fisher ScientificA1517101
хранить при температуре 4 ° C и прогреть до RT перед использованием.
Instruments
Heracell 150i CO2-инкубаторыFisher Scientific, США
Орбитальные шейкеры - SSM1, SSL1Stuart Equipment, Великобритания
ПЗС-микроскоп Камера Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Германия
Водяная баня Jb Academy Basic JBA5 JBA5 Грант ИнструментыGrant Instruments, США
Система аспирации жидкости BVC controlVacuubrand, Германия
Leica TCS SP8 STED конфокальный микроскопLeica Microsystems, Германия
50 мл соколиная трубкаSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, США
Flowjo Sampler AnalysisООО «ФлоуДжо», США
пипетку 10 млSigma-AldrichSIAL1100
1, 10, 100, 1000 мл пипеткуSigma-Aldrich
40 &микро; m Клеточный старинерSigma-AldrichCLS431750
сверхнизкое вложение 96-луночная пластинаS-BIOMS-9096UZ
Графиня II автоматизированный счетчик клетокThermo Fisher Scientific
Среда нейронной дифференцировки  (NDM+)
DMEM/F12Life technologies11330032
Нейробазальная средаLife technologies2110349
добавка Glutamax 1% (v/v)Life technologies35050
N2 добавка 0,5% (v/v)Life technologies17502-048
B27 добавка 1% (v/v)Life технологии17504-044
&бета;-Меркаптоэтанол 50&микро; MSigma-aldrichM3148
BDNF 20 нг/млPeprotech450-02
Аскорбиновая кислота 200 &; МСигма-Олдрич A92902
Магазин по адресу 4° C в течение 2 недель
<сильная>среда дифференцировки нейронов минус виатмин A (NDM-)
DMEM/F12Технологии жизни11330032
Нейробазальная средаТехнологии жизни2110349
% (v/v)Технологии жизни35050
N2 добавка 0,5% (v/ v)Life technologies17502-048
B27 дополнение W/O vit. A 1% (v/v)Life technologies12587010
&бета;-Меркаптоэтанол 50 &микро; MSigma-aldrichM3148
Магазин по адресу 4° C в течение 8 дней
<сильная>Нейроиндукционная среда (NIM)
DMEM/F12Технологии жизни11330032
Замена сыворотки нокаута 15% (v/v)Life technologies10828028
добавка глутамакса 1% (v/v)Life technologies35050
β- Меркаптоэтанол 100 & микро; MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 нМStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 &микро; MTocris1614
XAV939 2 & микро; MSigma-AldrichX3004
магазин по адресу 4° C в течение 10 дней
<сильная>нейтрализующая среда
IMDMLife технологии21980032
FBS 10%Sigma-Aldrich12103C
Другие реагенты
DPBS (Ca2+/Mg2+ free)Thermo Fisher Scientific14190250
Бычья сыворотка АльбуминEuropa BioproductsEQBAH62-1000
AccutaseLife technologiesA11105-01
GeltrexLife technologiesA1413302
EDTALife technologies15575038
Advanced DMEM / F12Lifetechnologies 12634010
нервной ткани набор для диссоциацииMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 дигидрохлорид Ингибитор горных породBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G™ Монтаж среднийSouthernBiotech0100-20
PFAThermo Fisher Scientific28908
добавка глутамакс 1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  3. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  4. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  5. Trifunovic, A., Larsson, N. G. Mitochondrial dysfunction as a cause of ageing. Journal of Internal Medicine. 263 (2), 167-178 (2008).
  6. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  7. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  10. Xu, L., et al. Abnormal mitochondria in Down syndrome iPSC-derived GABAergic interneurons and organoids. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1868 (6), 166388(2022).
  11. Liu, C., et al. Mitochondrial HSF1 triggers mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Huntington's disease. EMBO Molecular Medicine. 14 (7), e15851(2022).
  12. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  13. Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives. The Journal of Visualized Experiments. 177, e63116(2021).
  14. Strober, W. Trypan Blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  15. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. Chapter 1 (Unit 1), 14(2002).
  16. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biology. 6 (1), 204(2005).
  17. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  18. Xiang, Y., et al. Generation and fusion of human cortical and medial ganglionic eminence brain organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 47 (1), e61(2018).
  19. Pevny, L., Placzek, M. SOX genes and neural progenitor identity. Current Opinion in Neurobiology. 15 (1), 7-13 (2005).
  20. Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cytoskeleton and Cell Motility. 17 (2), 118-132 (1990).
  21. Rosebrock, D., et al. Enhanced cortical neural stem cell identity through short SMAD and WNT inhibition in human cerebral organoids facilitates emergence of outer radial glial cells. Nature Cell Biology. 24 (6), 981-995 (2022).
  22. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  23. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  24. Yan, Y., Zhang, S. C. Generation of cerebral cortical neurons from human pluripotent stem cells in 3D culture. Methods in Molecular Biology. 2683, 1-11 (2023).
  25. Pamies, D., et al. Human IPSC 3D brain model as a tool to study chemical-induced dopaminergic neuronal toxicity. Neurobiology of Disease. 169, 105719(2022).
  26. Pamies, D., Hartung, T., Hogberg, H. T. Biological and medical applications of a brain-on-a-chip. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J. : Online). 239 (9), 1096-1107 (2014).
  27. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  28. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryBrain OrganoidsMitochondrial ParametersiPSC Derived OrganoidsMitochondrial DysfunctionSingle Cell DissociationMitochondrial MassMRC ComplexesTFAM StainingmtDNA Copy Number
Video Coming Soon

Related Articles