Модель метастазирования дренирующих лимфатических узлов для оценки динамики антиген-специфических CD8⁺ Т-клеток в процессе онкогенеза

Иммунотерапия рака, особенно блокада контрольных точек иммунного ответа (ICB), произвела революцию^{в терапии} рака1. ICB блокирует коингибирующие иммунорецепторы (такие как PD-1, Tim-3, LAG-3 и TIGIT), которые высоко экспрессируются в истощенных CD8⁺ Т-клетках в опухолевом микроокружении (TME), что приводит к оживлению истощенных CD8⁺ Т-клеток². Учитывая гетерогенность истощенных CD8⁺ Т-клеток, накопление доказательств показало, что опухолеспецифичные CD8⁺ Т-клетки, полученные с периферии, включая дренирующий лимфатический узел (dLN), но не в TME, опосредуют эффективность ICB 3,4,5,6,7,8. Недавно было подтверждено, что полученные из TdLN TCF-1⁺TOX ^- опухолеспецифичные CD8⁺ Т-клетки памяти (TdLN-T_TSM) являются подлинными ответителями на ICB, которые воплощают в себе несколько функциональных свойств обычных Т-клеток памяти и могут в дальнейшем расширяться и дифференцироваться в истощенные клетки потомства при лечении ICB⁹. В целом, эти результаты подтвердили важность ЛН в формировании противоопухолевого иммунитета.

Лимфатические узлы функционируют как важнейшее место в содействии праймингу и активации опухолеспецифичных CD8⁺ Т-клеток, обеспечивая структурную основу, а также биологические сигналы¹⁰. Некоторые типы раковых клеток часто засеивают сторожевые лимфатические узлы (SLN, первый LN, дренирующий первичную опухоль) перед систематической диссеминацией¹¹. Наличие метастазов SLN связано с плохим исходом при раке человека, и доклинические модели показали, что опухолевые клетки в TdLN могут распространяться в отдаленные органы как через лимфатические сосуды, так и через кровеносные сосуды узла 12,13,14,15. Биопсия SLN в настоящее время представляет собой стандартную процедуру для принятия последующих решений о лечении многих типов солидных опухолей, что позволяет избежать ненужной резекции непораженного LN^16,17. Даже для пациентов с ВН остается спорным вопрос о том, нужна ли хирургическая резекция, и если да, то когда, поскольку несколько исследований показали, что удаление регионарной ВН не продемонстрировало улучшения общей выживаемости по сравнению с теми, кто получал лучевую или системную терапию без регионарной резекции ВН^18,19. Одна из интерпретаций заключается в том, что метастатическая ВН (мЛН) с микроскопическим заболеванием может сохранять некоторую способность обучать иммунные клетки и обеспечивать некоторые терапевтические преимущества. Таким образом, критически важно выяснить, как метастазы ЛН влияют на противоопухолевый иммунный ответ, особенно на свойства и функции TdLN-T_TSM.

До сих пор как доклинические, так и клинические данные выявили некоторые структурные и клеточные изменения в mLN²⁰. Однако динамические изменения опухолеспецифичных CD8⁺ Т-клеток при метастазировании ЛН не очерчены. Поэтому для дальнейшего изучения необходима разработка убедительной модели метастазирования ВН. Действительно, в нескольких исследованиях сообщалось о моделях mLN на мышах различными способами 14,21,22. Например, спонтанное метастазирование в подмышечных ЛУ проводили путем имплантации клеток рака молочной железы 4Т1 в жировую подушку^{молочной железы 22}. В другом исследовании Reticker-Flynn et al. создали клеточные линии меланомы с высокой частотой распространения от подкожной первичной опухоли к ВН путем последовательной инокуляции опухолевых клеток, культивируемых из диссоциированных тканей mLN (девять раундов)¹⁴. Другая широко используемая модель была получена путем инъекции опухолевых клеток в подушечку стопы, и метастатические локусы образовывались в подколенной LN²². Примечательно, что трудно оценить точные сроки вмешательства, поскольку метастазы ВН в этих моделях не всегда точны.

В настоящем исследовании мышиная метастатическая модель LN была создана путем интранодальной инъекции клеток B16F10-GP^23,24, полученных путем CRISPR/Cas9-опосредованной вставки последовательности гена гликопротеина (GP) вируса LCMV в геном клеточной линии⁹ B16F10. Затем этим мышам были пересажены клетки P14, которые содержат трансгенные Т-клеточные рецепторы (TCR), специфически распознающие эпитоп H-2D^b GP_33-41 ^25,26, и можно было исследовать системную и локальную динамику антиген-специфических CD8⁺ Т-клеток при метастазировании ЛН. Наш экспериментальный дизайн представляет собой полезную модель для изучения иммунных реакций, особенно антиген-специфических CD8⁺ Т-клеток во время метастазирования ЛН, что исключает возмущение CD8⁺ Т-клеток. Эти результаты повлияют на варианты клинического лечения, связанные с удалением или сохранением mLN, и прольют новый свет на манипуляции с mLN для достижения максимального терапевтического эффекта.

Мыши C57BL/6J (относящиеся к мышам B6) и наивные трансгенные мыши^{P14 9,27} были в возрасте 6-10 недель с массой тела 18-22 г. Как мужчины, так и женщины были включены в исследование без рандомизации или ослепления. Все исследования на животных проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Циндаоского сельскохозяйственного университета.

1. Приготовление среды и реагентов

1. Приготовьте питательную среду для клеток меланомы B16F10-GP, названную D10 (полная среда DMEM), добавив DMEM, 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 1% пенициллин/стрептомицин, 1% L-глютамин с дополнительными 100 ЕД/мл пуромицина. Поддерживайте стерильность D10 и храните до 2 недель при температуре 2-4 °C.
2. Приготовьте среду R2 (для прекращения лизиса эритроцитов), добавив RPMI-1640 с 2% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% L-глютамина.
3. Приготовьте буфер для флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS), добавив 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) с 2% FBS и 0,01% азида натрия. Добавление азида натрия позволяет продлить срок хранения буфера FACS, который может храниться месяцами при температуре 2-4°С.
4. Приготовьте буфер для лизиса эритроцитов (RBL), добавив 155 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃ и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в двойную дистиллированную воду и отрегулируйте ее pH до 7,3. Храните RBL-буфер при комнатной температуре (RT), и он остается стабильным до 3 месяцев.
5. Приготовьте анестетик, 2,2,2-трибромэтанол, как описано ниже.
   1. Отвесьте необходимое количество кристаллов 2,2,2-трибромэтанола в стерильной конической пробирке объемом 50 мл, обернутой алюминиевой фольгой. Добавьте в кристалл необходимое количество 2-метил-2-бутанола для приготовления исходного раствора с концентрацией 500 мг/мл.
   2. Перемешайте и нагрейте пробирку на водяной бане с температурой 37 °C, пока кристалл не растворится. Убедитесь, что все кристаллы растворились.
   3. Тщательно перемешайте раствор. Отфильтруйте исходный раствор фильтром 0,22 мкм в стерильный контейнер. Исходный раствор хранят замороженным, защищенным от света, при -20 °С или разбавляют ПБС в рабочий раствор в концентрации 12,5 мг/мл и хранят при 4 °С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать предписанную концентрацию, так как более высокие концентрации жидкости раздражают.

2. Приготовление клеточной суспензии B16F10-GP

1. Разморозьте и культивируйте флакон 1 x 10⁶ клеток B16F10-GP с 5 мл D10 в инкубаторе клеточных культур при 37 °C и 5% CO₂. Субкультура клеток, когда они достигают плотности от 80% до 90%, как описано ниже.
   1. Исходную питательную среду отбраковывают путем аспирации с помощью пистолета-пипетки и промывают клетки 2 раза PBS. При очистке адгезивных клеток с помощью PBS в чашке для клеточных культур переместите PBS к боковой стенке или опустите его в чашку.
   2. После аспирации ПБС добавляют 0,5-1 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА в чашку или колбу для клеточных культур. Аккуратно встряхните, чтобы покрыть всю поверхность клетки. Поместите чашку или колбу для клеточных культур в инкубатор при температуре 37 °C примерно на 1 минуту или на RT до тех пор, пока клетки не округлятся и не разделятся. Наблюдайте за отшелушиванием клеток с помощью инвертированного микроскопа.
   3. Добавьте равный объем свежеприготовленного D10, чтобы прекратить переваривание трипсина. Продуйте нижнюю поверхность колбы с клеточными культурами с помощью пистолета для пипетирования, чтобы убедиться, что все клетки были разделены.
   4. Переложите суспензию клеток B16F10-GP в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 163 x g в течение 4 мин при RT.
   5. Аспирируйте надосадочную жидкость и выбросьте. Ресуспендируйте клетки в 1-2 мл D10 для осаждения. Переносят клеточную суспензию B16F10-GP в новую чашку для клеточных культур или колбу, содержащую 8-10 мл D10, а затем инкубируют в клеточном инкубаторе при 37 °C при 5% CO₂.
2. В день имплантации опухоли соберите клетки B16F10-GP с плотностью примерно 90%, как описано в шагах 2.1.1 - 2.1.4. После центрифугирования аспирировать надосадочную жидкость и выбросить. Ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл PBS.
3. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью 0,4% гемоцитометра трипанового синего. Добавьте PBS, чтобы разбавить клетку до 5 x 10⁵ клеток на 100 мкл. Поместите клетки на лед до использования.

3. Эктопический посев клеток B16F10-GP в двустороннюю паховую область мышей

1. Аспирировать 100 мкл готовой клеточной суспензии B16F10-GP с помощью шприца объемом 1 мл. Щелкните по стенке трубки, чтобы переместить пузырьки наверх, и надавите на поршень, чтобы выдвинуть верхний пузырь.
2. Держите мышь в положении лежа на спине, обнажив ее брюшко. Надавите пальцем на правую заднюю конечность мыши в положении лежа на спине так, чтобы кожа в правой паховой области была полностью обнажена (то же самое с левой паховой областью).
3. Удалите шерсть на животе с помощью крема для депиляции, затем очистите двустороннюю область живота ватой, содержащей 75% этилового спирта.
4. Перед введением иглы убедитесь, что кожа в паховой области подтянута. Введите иглу под углом 45° в подкожное пространство паховой области верхней части бедра. Убедитесь, что игла скошена вверх, а глубина иглы 0,5-1 см.
5. Примените осторожное отсасывание перед инъекцией, если нет крови, введите медленно введенные клетки в подкожную клетчатку. При этом наблюдают небольшой болюс (образование жидкого кармана) в подкожной области.
6. После инъекции извлеките иглу, поместите ее в коробку для острых предметов и верните мышь в клетку.

4. Адоптивный перенос Т-клеток P14 мышам-опухоленосителям

1. Проводят адоптивный перенос у мышей-опухоленосителей через 6-8 дней после имплантации опухоли, когда опухоли пальпируются (примерно 3-5 мм в диаметре). Внутрибрюшинно вводят 4 мг циклофосфамида за сутки до переноса 28,29,30.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью инъекции CTX является создание пространства в лимфатическом компартменте для адоптивно перенесенных Т-клеток путем временного устранения пролиферирующих лимфоцитов.
2. Изолируйте лимфоциты из селезенки и ЛН наивных трансгенных мышей P14, как описано ниже^31,32 (6-10 недель, того же пола, что и мыши-носители опухолей, чтобы избежать проблем с отторжением).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие процедуры в шкафу биобезопасности, чтобы обеспечить строго стерильные условия.
   1. Приготовьте две чашки по 6 см и добавьте в одну из посуды 3 мл среды R2 и в другую чашку 3 мл буфера RBL. Поместите клеточный фильтр 70 мкм в чашку Петри, содержащую RBL-буфер.
   2. Усыпляют мышей P14 в герметичных контейнерах, содержащих изофлуран, с последующим вывихом шейки матки. Отрегулируйте количество мышей P14 в соответствии с количеством мышей-реципиентов.
   3. Соберите селезенку, паховые и подмышечные лимфатические узлы у усыпленных мышей и перенесите их в 6-сантиметровые чашки, содержащие 4 мл среды R2, и поместите их на лед.
   4. Поместите селезенку в ситечко, пропитанное 3 мл RBL-буфера, измельчите селезенку клюшкой внутри шприца объемом 1 мл. Инкубируют клетки при РТ в течение 1-2 мин, затем прекращают реакцию 3 мл холодной среды R2.
   5. Измельчите LN клюшкой внутри шприца объемом 1 мл до тех пор, пока в сетчатом фильтре с клеточным фильтром 70 мкм не останется только соединительная ткань. Промойте фильтр холодной средой R2 и перенесите суспензию ячейки в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют образцы при 500 x g в течение 6 мин при 4 °C.
   6. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки с помощью 3 мл PBS. Используйте клеточный фильтр 70 мкм для удаления хлопьевидного материала из клеточной суспензии.
   7. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 x g в течение 6 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте клетки с 3 мл PBS и поместите пробирку на лед. Возьмите небольшой образец, смешайте с трипановым синим и подсчитайте клетки с помощью планшета для подсчета клеток крови.
3. Определение процентного содержания клеток P14 (живых^{/мертвых} CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺) методом проточной цитометрии. Убедитесь, что перенесенные донорские клетки демонстрируют отчетливый конгенный маркер с мышами-реципиентами (мыши с опухолью B6 имеют CD45,2⁺). Перед переносом проведите окрашивание, чтобы убедиться в правильности фенотипа перенесенных клеток.
   1. Добавьте 5 x 10⁴- 1 x 10⁵ клеток в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл буфера FACS. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 x g при 4 °C в течение 3 мин.
   2. Выбросьте надосадочную жидкость, щелкните дном пробирки, чтобы рассеять клетки, и поместите пробирку на лед.
   3. Готовят следующую смесь конъюгированных антител ^9,32, разведенную в 100 мкл буфера FACS: анти-CD8, 1:200; анти-TCR Vα2, 1:100; анти-CD45.1, 1:200; Живое/мертвое пятно, 1:400. (Таблица материалов).
   4. Центрифугируйте смесь антител при концентрации 15 000 x g в течение 3 мин для агрегации частиц. Выложите смесь на лед и защитите ее от света, завернув в фольгу. Принимайте только надосадочную жидкость, чтобы избежать аспирации частиц.
   5. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл смеси антител и тщательно перемешайте, щелкнув стенкой пробирки. Завернув в фольгу, выдержите пробирку в течение 30 минут на льду.
   6. Промойте клетки 2 раза буфером FACS. Центрифугируйте пробирку при 500 x g при 4 °C в течение 3 мин. Ресуспендируйте ячейки с помощью 200 мкл буфера FACS и перенесите суспензию клеток в проточную трубку.
   7. Проведите проточную трубку с окрашенными клетками на проточном цитометре, чтобы определить процентное соотношение живых^{/мертвых} клеток CD45.1⁺CD8^+Vα2+.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, более 90% CD8⁺ Т-клеток трансгенных мышей P14 содержали ^Vα2+TCR, которые специфичны для эпитопа H-2D^b GP_33-41 LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита).
4. Рассчитайте абсолютное число живых^{/мертвых} клеток CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺ , умножив его процентное соотношение на число живых клеток, полученное на шагах 4.2 и 4.3.
5. Аспирировать 200 мкл суспензии клеток P14 (5 x 10⁵ клеток) инсулиновым шприцем 100 ЕД и удалить пузырьки. Исходное количество перенесенных наивных клеток P14 (5 х 10³ - 5 х 10⁵) не влияло на фенотип перенесенных клеток⁹.
6. Поместите мышей в клетку и согрейте инфракрасной лампой в течение 5-10 мин, чтобы расширить хвостовую вену. Закрепите на месте фиксатором мыши соответствующего размера, расправьте хвост и протрите его ватным тампоном, содержащим 75% этанола, чтобы сделать вены видимыми.
7. Введите иглу параллельно хвостовой вене и аккуратно потяните поршень назад. Если в шприц течет кровь, медленно протолкните клеточную суспензию в вену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время инъекции возникает сопротивление или отек хвоста, необходимо отрегулировать положение инъекции. Место инъекции должно начинаться с дистального конца.
8. После завершения инъекции быстро вытащите иглу и аккуратно прижмите место инъекции ватным тампоном. Верните мышь в новую чистую клетку и внимательно понаблюдайте за ней в течение нескольких минут на предмет каких-либо побочных эффектов.

5. Резекция первичной опухоли

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что все хирургические инструменты автоклавированы. Стерилизовать операционную зону внутри шкафа биобезопасности 75% этанолом с последующим УФ-облучением в течение не менее 30 минут. Во время операции носите чистые халаты, головные уборы, маски и стерильные перчатки.

1. Когда опухоль прощупается (примерно 5 мм в диаметре), извлеките первичную опухоль.
2. Обезболивайте мышей внутрибрюшинной инъекцией кетамина (75 мг/кг). Зажмите подушечку стопы, чтобы оценить степень анестезии, если болевого рефлекса нет, это указывает на правильное время для операции. Если задние конечности были удалены, обеспечьте еще одну дозу 10-30 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы внутрибрюшинный медетомидин (1 мг/кг массы тела; Domitor) рекомендуется для обезболивания мышей.
3. Нанесите на мышиные глаза защитную мазь от подсушивания. Удалите шерсть на животе с помощью крема для депиляции, чтобы полностью обнажить операционное поле.
4. Поместите мышь в шкаф биобезопасности и положите ее на анатомическую доску, покрытую чистой впитывающей бумагой, в положении лежа на спине так, чтобы продольная ось мыши была параллельна экспериментатору.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания строгой стерильной среды следующие процедуры должны выполняться в шкафу биобезопасности.
5. Продезинфицируйте брюшную полость мышей ватным тампоном, смоченным в повидон-йоде. Надрезать кожу возле места носителя опухоли стерильным скальпелем или офтальмологическими ножницами. Вставьте закрытый кончик ножниц в разрез, чтобы четко обнажить опухоль. При разрезании кожи следите за тем, чтобы не повредить паховые лимфатические узлы.
6. Во время удаления опухоли держите капсулу максимально неповрежденной. Аккуратно и аккуратно удалите соединительную ткань, прилегающую к опухоли, стерильными ножницами. Удаляйте опухоль на месте полностью, иначе она может рецидивировать.

6. Интранодальное введение клеток B16F10-GP в паховый лимфатический узел

ПРИМЕЧАНИЕ: После двустороннего очищения опухоли клетки B16F10-GP вводились в односторонний паховый лимфатический узел, а PBS вводился в другую сторону.

1. Аспирировать 20 мкл (5 x 10,⁴ клетки) клеточной суспензии B16F10-GP инсулиновым шприцем 100 U, удалить пузырьки и затем ввести в один паховый лимфатический узел. Введите равный объем PBS в паховый лимфатический узел с другой стороны.
   1. Во время инъекции вводят иглу с дистального конца лимфатического узла, а затем медленно вводят иглу в центр лимфатического узла. В это время, если жидкость точно вводится в лимфатический узел, можно заметить, что лимфатический узел значительно увеличивается.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда игла вводится из дистального конца лимфатического узла, следите за тем, чтобы не проколоть узел.
2. Зашить разрез 2-3 швами, используя шов 3-0. Продезинфицируйте кожу вокруг раны ватой, пропитанной повидон-йодом. Позаботьтесь о шунтировании лимфатических узлов во время наложения швов.
3. Поместите мышь в чистую клетку и согрейте инфракрасным светом в положении пролежня. Наблюдайте непрерывно до тех пор, пока сознание не восстановится. Следите за тем, чтобы мыши, перенесшие операцию, не возвращались в компанию других животных до полного выздоровления.
4. Назначайте бупренорфин каждые 4-6 ч в течение 3 дней подряд после операции для облегчения послеоперационной боли (в дозе 0,1-0,5 мг/кг, SQ или IP). Следите за зонами кормления, питья, движения и активности мышей. Обычно мыши восстанавливаются после хирургической травмы в течение 3 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если мыши не могут возобновить нормальное кормление и активность и проявляют какие-либо признаки инфекции, обратитесь к ветеринару для вмешательства или усыпите их.
5. Жертвоприношение мышей в разные моменты времени: на 8-й и 18-й день после интранодальной инъекции опухолевых клеток. Извлечение активированных донорских клеток с помощью анализа проточной цитометрии.

Принципиальная схема этого экспериментального проекта показана на рисунке 1А. В общей сложности 5 x 105 клеток B16F10-GP в 100 мкл PBS были подкожно имплантированы в двустороннюю паховую область мышей CD45.2 C57BL/6J. Через 7 дней этим мышам с опухолью внутривенно (в/в) вводили 4 мг CTX с последующим адоптивным переносом 5 x 105 клеток CD45.1+P14 через хвостовую внутривенную (внутривенную) инъекцию. Когда опухоли вырастали примерно до 3-5 мм в диаметре (примерно через 7 дней после переноса клеток P14), первичные опухоли резецировали, и 5 x 104 клеток B16F10-GP в 20 мкл PBS вводили непосредственно в односторонний паховый лимфатический узел. В паховый лимфатический узел с другой стороны вводили равные объемы PBS. Репрезентативное окрашивание гематоксилином и эозином (H&E, 100x) неметастатического лимфатического узла (nLN) и метастатического лимфатического узла (mLN) в указанные моменты времени показано на рисунке 1B. Структура nLN осталась нетронутой. На ранней стадии метастазирования ВН (D8) mLN был частично занят опухолевыми клетками (черная стрелка), и еще остается некоторый участок с лимфоцитами, которые не были захвачены опухолевыми клетками (красная стрелка). В то время как на поздней стадии метастазирования ВН (D18) mLN заполнен опухолевыми клетками, сопровождающимися опухолевым ангиогенезом и малым количеством лимфоцитов. Активированные клетки Р14, восстановленные в TdLN, продуцировали высокий уровень ИФН-γ после стимуляции пептидами GP33-41 9,31. Здесь процентное соотношение активированных клеток P14 было проанализировано с помощью проточной цитометрии в разные моменты времени, а стратегия стробирования показана на рисунке 2. Частота антиген-специфических CD8+ Т-клеток в периферической крови на ранней стадии (D8) и поздней (D18) составляет 2,81% и 1,48% соответственно (рис. 3А). Сообщалось, что опухолеспецифичные CD8+ Т-клетки строго находятся в dLN во время опухолегенеза, а недренирующие LN восстанавливают ограниченные донорские клетки33. Процент антиген-специфических клеток Р14 в нЛН был стабильным при метастазировании ВН. Интересно, что антиген-специфические CD8+ Т-клетки в мЛН были временно усилены на ранней стадии, о чем свидетельствует более высокая частота клеток Р14 по сравнению с нЛН, в то время как на поздней стадии она резко снизилась (рис. 3Б).

Рисунок 1: Принципиальная схема схемы эксперимента. (A) Мышам C57BL/6J (CD45.2+) имплантируют 5 x 105 опухолевых клеток B16F10-GP в двустороннюю паховую область. Через 7 дней этим мышам внутрибрюшинно вводят 4 мг CTX, а затем на следующий день проводят адоптивный перенос различных конконгенически маркированных (CD45.1+) клеток P14. Когда опухоли вырастают примерно до 3-5 мм в диаметре (примерно через 7 дней после переноса клеток P14), первичные опухоли резецируют, затем 5 x 104 клеток B16F10-GP в 20 мкл PBS вводят непосредственно в односторонний паховый лимфатический узел, а в паховый лимфатический узел с другой стороны вводят равные объемы PBS. (B) Репрезентативное окрашивание ЛН гематоксилином и эозином (H&E,100x). Сокращения: s.c. = подкожный; CTX= циклофосфамид; в/в = внутривенно; Сак = жертвоприношение; nLN = неметастатическая LN; мЛН = метастатическая ВН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Стратегия стробирования для анализа проточной цитометрии. Стратегия стробирования, используемая для идентификации донорских активированных антиген-специфических CD8+ Т-клеток. Аббревиатуры: L/D = живой/мертвый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Динамика антиген-специфических CD8+ Т-клеток при метастазировании в ЛН. Доля антиген-специфических CD8+ Т-клеток в (А) периферической крови, (В) нЛН и мЛН в разные моменты времени. Сокращения: nLN = неметастатическая LN; мЛН = метастатическая ВН. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.