Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Скрининг чувствительности к сфероидальным препаратам в линиях стволовых клеток глиомы

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65655

⸱

2 февраля 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Скрининг чувствительности к лекарствам in vitro является важным инструментом для поиска комбинаций противораковых препаратов. Клетки, выращенные в сферах, активируют различные сигнальные пути и считаются более репрезентативными для моделей in vivo, чем монослойные клеточные линии. Этот протокол описывает метод скрининга лекарственных препаратов in vitro для сфероидальных катетеров.

Аннотация

Скрининг чувствительности к лекарствам in vitro является важным инструментом в открытии комбинированной терапии противораковых препаратов. Как правило, эти скрининги лекарств in vitro проводятся на клетках, выращенных в монослое. Однако эти двумерные (2D) модели считаются менее точными по сравнению с трехмерными (3D) моделями сфероидальных ячеек; Особенно это касается линий стволовых клеток глиомы. Клетки, выращенные в сферах, активируют различные сигнальные пути и считаются более репрезентативными для моделей in vivo, чем монослойные клеточные линии. Этот протокол описывает метод скрининга лекарственных средств сфероидальных линий in vitro; В качестве примера используются линии стволовых клеток глиомы мыши и человека. Этот протокол описывает 3D-сфероидальный анализ чувствительности к лекарственным средствам и синергии, который может быть использован для определения того, вызывает ли лекарство или комбинация лекарств гибель клеток и синергизирует ли два препарата. Линии стволовых клеток глиомы модифицируют для экспрессии RFP. Ячейки помещаются в низкое крепление круглым дном лунки 96 пластинами, а сферам дают образоваться в течение ночи. Добавляются лекарственные препараты, и рост контролируется путем измерения сигнала RFP с течением времени с помощью системы визуализации в реальном времени Incucyte, флуоресцентного микроскопа, встроенного в инкубатор для культуры тканей. Половина максимальной ингибиторной концентрации (IC50), медиана летальной дозы (LD50) и показатель синергии впоследствии рассчитываются для оценки чувствительности к препаратам по отдельности или в комбинации. Трехмерный характер этого анализа обеспечивает более точное отражение роста опухоли, поведения и чувствительности к лекарствам in vivo, тем самым формируя основу для дальнейших доклинических исследований.

Введение

Глиобластома является разрушительным новообразованием головного мозга высокой степени злокачественности с 5% общей пятилетней выживаемостью1. Глиомы высокой степени злокачественности (ГГГ), такие как глиобластома, являются основной причиной смертности, связанной с раком, в педиатрической популяции2 и являются одной из наиболее труднодоступных опухолей для лечения и у взрослых3. Несмотря на значительные успехи в понимании молекулярных факторов гормона роста, варианты лечения остаютсяограниченными3, что подчеркивает необходимость методов скрининга лекарственных средств, которые более точно прогнозируют терапевтическую чувствительность в клинике.

Трехмерные клеточные культуры в основном использовались для моделирования физиологически значимого поведения клеток4. Кроме того, 3D-архитектура опухолевого микроокружения может быть воспроизведена in vitro путем проведения 3D-анализов роста5. Рост сфероидов также активирует различные сигнальные пути и, следовательно, считается более репрезентативным для моделей in vivo 6,7 по сравнению с 2D-культурой. Педиатрические стволовые клетки HGG и наши линии стволовых клеток глиомы NF1 мыши естественным образом растут как нейросферы, и использовали эти линии клеток глиомы NF1 мыши в скрининге лекарств со средней пропускнойспособностью8. Использованные здесь педиатрические линии были получены из полушарного, срединного и мозжечкового детского HGG и были получены и полностью охарактеризованы Сетью опухолей детского мозга (профили мутаций и экспрессии генов)9. Эти линии были модифицированы для экспрессии ядерного красного флуоресцентного белка (RFP), который позволяет отслеживать пролиферацию и выживаемость с помощью системы визуализации в реальном времени Incucyte. Интенсивность сигнала RFP репрезентативна для количества присутствующих клеток. Другие флуорофоры, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), также могут быть использованы.

Комбинированная химиотерапия при остром лимфобластном лейкозе, лимфомах, злокачественных новообразованиях эпителия и многих других видах рака у детей является эффективным способом эрадикации опухолей и предотвращения лекарственной устойчивости к отдельным препаратам10,11. Тем не менее, существует ограниченная информация о том, какие агенты следует комбинировать для достижения терапевтической чувствительности при HGG, что способствует использованию более точных сфероидальных моделей при тестировании лекарств in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протокольные процедуры были одобрены Советом по институциональному обзору (IRB) Детской больницы Филадельфии.

1. 3D покрытие сфероидальных ячеек

  1. Приготовьте среду для стволовых клеток глиомы: Чтобы сделать базовую среду, добавьте 50 мл пролиферативной добавки и 5 мл 100-кратного раствора пенициллина-стрептомицина (10 000 ЕД/мл) в базальную среду (500 мл). Чтобы получить среду для производства стволовых клеток глиомы, добавьте эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF) до конечной концентрации 20 нг/мл и 10 нг/мл соответственно, в соответствии с описанием производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среду для обработки стволовых клеток глиомы можно использовать в течение 1 недели при хранении при температуре 4 °C.
  2. Диссоциация клеток, экспрессирующих RFP:
    Примечание: В данном примере используется мышиная линия стволовых клеток NF1 HGG 5746.
    1. Перенесите сферы глиомы в коническую пробирку объемом 15 мл и вращайте сферы глиомы в центрифуге (150 x g в течение 5 минут). Удалите надосадочную жидкость и добавьте 300 мкл аккутазы для диссоциации сфер (инкубировать в течение 5 мин при 37 °C).
    2. Добавьте 1 мл среды для лечения стволовых клеток глиомы и разрушьте сферы с помощью щадящего пипетирования. Центрифугируйте диссоциированные клетки в течение 5 мин при 150 x g, аспиратируйте надосадочную жидкость и растворите гранулу в 1 мл среды стволовых клеток глиомы.
  3. Измерьте концентрацию клеток с помощью клеточного счетчика или гемоцитометра. При использовании флуоресцентного счетчика клеток добавьте 18 мкл клеточной суспензии в 2 мкл красителя Acridine Orange/Propidium Iodide. Загрузите 12 мкл этой суспензии в гемоцитометр, чтобы подсчитать количество живых/мертвых клеток, присутствующих в суспензии.
  4. Разбавьте клетки до конечной концентрации 2000 клеток на 100 мкл среды стволовых клеток глиомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения концентрации клеток могут зависеть от клеточной линии и могут быть скорректированы соответствующим образом.
  5. С помощью многоканальной пипетки дозируйте 100 мкл клеточной суспензии (2000 клеток на 100 мкл) в каждую лунку 96-луночной пластины с круглым дном с низким прикреплением путем обратного пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте низкие крепежные пластины с круглым дном; Эти пластины будут стимулировать образование единой сферы глиомы в каждой лунке. Обратное пипетирование позволяет избежать образования пузырьков, которые будут мешать получению изображений с помощью системы анализа живых клеток.
  6. Центрифугируйте планшеты при давлении 150 x g в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование является критически важным этапом для инициирования формирования 3D-нейросферы.
  7. Инкубируйте в течение ночи, чтобы в каждой лунке образовалась одна сфера.

2. Добавление препаратов для синергетического анализа (Рисунок 1)

  1. Убедитесь, что каждая лунка 96-луночного планшета получает определенную концентрацию обоих препаратов 1 и 2. Создайте сетку, в которой каждая концентрация препарата 1 будет объединена с каждой концентрацией препарата 2 в двух экземплярах.
  2. Произведите серийное разведение двух препаратов, для которых будет определен синергизм (5 разведений препарата 1 и 7 разведений препарата 2) с использованием среды стволовых клеток глиомы (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании используется 50% серийный ряд разведения; Тем не менее, можно использовать любую серию разрежений.
    1. Серия разведения должна быть в 7 раз более концентрированной, чем желаемая конечная концентрация в каждой лунке. Например, если наибольшая конечная концентрация для препарата 1 составляет 1 мкМ, сделайте первую концентрацию из ряда разведения для препарата 1, 7 мкМ (1 мл, пробирка B или I на рисунке 1А).
    2. Добавьте 500 мкл среды для стволовых клеток глиомы в каждую дополнительную пробирку серии разведения (пробирки C-H и J-M, как показано на рисунке 1).
    3. Для создания серии разведения необходимо аспирировать 500 мкл лекарственной смеси из пробирки B или пробирки I и добавить ее в следующую пробирку серии разведения пробирку C или пробирку J соответственно (содержащую 500 мкл среды стволовых клеток глиомы). Хорошо перемешайте и повторите до следующей пробирки в серии разбавления. Изготовьте регулятор ДМСО (трубка А) и убедитесь, что концентрация ДМСО одинакова в любых условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно вносить изменения в концентрации препарата и ряды разведения. Убедитесь, что в дополнительном файле 1 указаны правильные концентрации препарата, если серия разведения изменилась.
  3. В каждую лунку из 96 луночных планшетов добавьте 20 мкл препарата 1 и 20 мкл препарата 2 методом обратного пипетирования, как показано на рисунке 1В, для получения конечного объема 140 мкл на лунку; Комбинации препаратов оцениваются в двух экземплярах. Если вы используете предоставленный анализ для IC50 и LD50, используйте схему препарата, как показано на рисунке 1B.
    1. В этом анализе также измеряется действие каждого препарата как такового (без присутствия другого препарата). Обязательно добавьте 20 мкл контрольной среды ДМСО (трубка А на рисунке 1B) в эти одиночные лунки для лекарств, чтобы довести конечный объем каждой лунки до 140 мкл.
    2. Убедитесь, что лунки не содержат пузырьков, так как это повлияет на визуализацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В окончательный объем могут быть внесены изменения; Тем не менее, обязательно отрегулируйте концентрации в пункте 2.2.
  4. Поместите пластины в тепловизор в реальном времени и отслеживайте рост каждой сферы в каждой скважине с помощью сфероидального модуля, устанавливающего одну сферу, визуализирующего как светлое поле, так и RFP с 4-кратным увеличением.
  5. Мониторьте планшеты в течение 72 часов, визуализируя каждую лунку планшета через равные промежутки времени, обычно 2 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите правильную карту номерных знаков; это обеспечит надлежащий анализ на последующих этапах (рис. 1C).

3. Расчет IC50, LD50 и оценки синергии (Рисунок 2 и Рисунок 3)

  1. Анализируйте интенсивность RFP для каждой скважины и каждой временной точки с помощью программного обеспечения для формирования изображений в реальном времени. Используемые параметры анализа перечислены в дополнительных файлах (Дополнительный файл 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве предпочтительных можно использовать различные параметры анализа.
  2. Экспортируйте данные RFP в виде общей красной интегрированной интенсивности RFP для каждой скважины, обязательно экспортируя необработанные несгруппированные данные (Рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если для расчета IC50 и LD50 используется предоставленный шаблон (Дополнительный файл 1), необходимо придерживаться пункта 3.2
  3. Определите среднее значение и стандартное отклонение для каждой комбинации препаратов от (1) кратного изменения по сравнению только с ДМСО (для этого расчета значения 0 ч не нужны) и (2) Log2 кратного изменения по сравнению с 0 ч путем вставки исходных данных в предоставленный лист Excel (рис. 2B и см. пример в дополнительном файле 1).
  4. Отрегулируйте максимальную концентрацию наркотиков 1 и 2 в таблице (рисунок 2В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно отрегулируйте концентрации препаратов 1 и 2; в противном случае будут рассчитаны неверные значения LD50 и IC50.
  5. Рассчитайте значения IC50 с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа данных (в данном случае используется GraphPad). Для расчета значения IC50 используйте среднее кратное изменение и изменение стандартного отклонения по сравнению с ДМСО , определенные только на шаге 3.4, и скопируйте таблицы IC50 для препаратов 1 и 2 в программное обеспечение для анализа данных (Log (ингибитор) в сравнении с нормализованной реакцией, переменный наклон) (рис. 3A).
    1. Для расчетов IC50 используйте только данные из скважин, к которым был добавлен один компонент. Используйте логарифмические значения концентрации наркотиков в программном обеспечении для анализа данных, которые автоматически рассчитываются в предоставленной таблице.
  6. Рассчитайте показатель синергии:
    1. Используйте среднее изменение складки по сравнению с ДМСО только для каждой комбинации для расчета показателя синергии с помощью программного пакета или веб-сайта. Например, https://synergyfinder.fimm.fi/ 12 (параметры: аппроксимация кривой LL4, метод ZIP для расчета оценки синергии). Дополнительный файл 1 автоматически вычисляет значения, необходимые для создания входной таблицы синергии, которая может быть загружена в SynergyFinder (рисунок 3B). Пример входной таблицы синергии приведен в дополнительном файле 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка выше 10 означает синергию, оценка ниже -10 означает антагонизм, а оценка от -10 до 10 указывает на аддитивные эффекты.
  7. Рассчитайте балл LD50:
    1. Для каждой концентрации препарата 1 рассчитайте LD50 препарата 2. Дополнительный файл автоматически вычисляет значение Log2 и стандартное отклонение для каждой концентрации (рисунок 3C).
    2. Введите среднее значение и стандартное отклонение изменения Log2 по сравнению с 0 ч, а также количество репликаций в программном обеспечении для анализа данных (в данном исследовании 2,) и рассчитайте значение LD50 и стандартное отклонение LD50, определив концентрацию при -1 (Log2 = -1 представляет значение log2, при котором теряется 50% сигнала по сравнению с 0 ч). В этих расчетах используйте модель Log(inhibitor) vs. response, variable slope 4 parameters.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа данных не рассчитывает автоматически концентрацию препарата, соответствующую значению log2 = -1; однако это значение может быть добавлено к расчетам программного обеспечения для анализа данных в виде определяемого пользователем уравнения (рисунок 3C). Обязательно используйте значения концентрации Log в программном обеспечении для анализа данных, которые автоматически рассчитываются в предоставленной электронной таблице. В дополнительном файле 4 показаны панели IC50 и LD50 в программном обеспечении GraphPad.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве примера был оценен синергизм траметиниба (ингибитора MEK) и GDC-0941 (ингибитора PI3K), которые ингибируют два нисходящих эффекторных пути RAS в линии стволовых клеток глиомы мыши 5746 (экспрессия RFP) (экспрессия RFP) (рис. 4). На рисунке 4А показана та же сфера через 0 ч и 72 ч, обработанная комбинацией траметиниба и GDC-0941. Эти изображения были экспортированы непосредственно из программного обеспечения для обработки изображений в реальном времени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе описываются 3D-скрининговые анализы лекарств, которые были эффективно использованы для оценки уязвимости лекарств в сфероидальных моделях глиомы8. Эта система 3D-анализа сфероидов была специально разработана для более точного доклинического исследования комбинаторной химиотерапии клеточных линий глиомы, выращенных в сферах. Для HGG этот метод обеспечивает основу для определения перспективных уязвимостей лекарств от этого разрушительного заболевани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужные пробирки 15 млCELLTREAT22941115 мл полипропиленовые центрифужные пробирки, стерильные
96-луночные планшетыS-bioMS9096UZ96-луночная пластина с круглым дном сверхнизкой адгезии
AccutaseSTEMCELL Technologies7922Раствор для отслоения клеток
Acridine Orange/Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Живой/мертвый морилка для подсчета клеток
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2Человеческий рекомбинантный счетчик клеток bFGF
Счетчик клетокLogos BiosystemsL20001LUNA-FL Двойная флуоресцентная клеточная счетчик
ЦентрифугаEppendorf5810RЦентрифугирование клеток и планшетов
DMSOPierce20688растворитель для соединений
EGFSTEMCELL Технологии78006.2Человеческий рекомбинантный EGF
Eppendorf tubesCostar07-200-534Микроцентрифужные пробирки
ExcelMicrosoftMicrosoft Excel
GDC-0941SelleckchemS1065Drug 1
GraphPadGraphPad GraphPad Prism 9Расчет логотипов гемоцитометра IC50 и LD50
BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3встроенный в инкубатор для тканевых культур, который визуализирует каждую лунку через определенные промежутки времени.
Программное обеспечение IncucyteSartoriusIncucyte 2022BАнализ данных о пролиферации
MediaSTEMCELL Technologies5702NeuroCult (Mouse and Rat) Пролиферативный набор, содержащий базальную среду и добавку роста
Пенициллин-Стрептомицин Gibco15140122Антибиотики для добавления в среду
ТраметинибSelleckchemS2673Препарат 2
флуоресцентный микроскоп ,

Ссылки

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
  2. Jones, C., et al. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (7), 400-413 (2012).
  3. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacological Research. 171, 105780(2021).
  4. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Molecular Oncology. 1 (1), 84-96 (2007).
  5. Lv, D., et al. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  6. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  7. Kim, H., et al. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors: an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model. PLoS One. 7 (6), e39556(2012).
  8. Dougherty, J., et al. Identification of therapeutic sensitivities in a spheroid drug combination screen of Neurofibromatosis Type I associated high grade gliomas. Plos One. 18 (2), e0277305(2023).
  9. Ijaz, H., et al. Pediatric high-grade glioma resources from the Children's Brain Tumor Tissue Consortium. Neuro Oncology. 22 (1), 163-165 (2020).
  10. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Jr Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews. Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  11. Al-Lazikani, B., et al. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nature Biotechnology. 30 (7), 679-692 (2012).
  12. Ianevski, A., et al. SynergyFinder 3.0: an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W739-W743 (2022).
  13. Ledur, P. F., et al. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  14. Sazonova, E. V., et al. Drug toxicity assessment: cell proliferation versus cell death. Cell Death Discovery. 8 (1), 417(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Скрининг лекарственных препаратов на сфероидахстволовые клетки глиомыанализ чувствительности к лекарственным препаратам3D-модели клетоккомбинированная терапия препаратамианализ гибели клетокпоказатель синергииэкспрессия RFPвизуализация живых объектоврасчет IC50

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.