Здесь представлено новое автоматизированное устройство для ушиба спинного мозга для мышей, которое может точно воспроизводить модели ушиба спинного мозга различной степени.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Здесь представлено новое автоматизированное устройство для ушиба спинного мозга для мышей, которое может точно воспроизводить модели ушиба спинного мозга различной степени.
Повреждение спинного мозга (ТСМ) из-за травматических повреждений, таких как автомобильные аварии и падения, связано с постоянной дисфункцией спинного мозга. Создание контузионных моделей травмы спинного мозга путем воздействия на спинной мозг приводит к патологиям, сходным с большинством травм спинного мозга в клинической практике. Точные, воспроизводимые и удобные животные модели травмы спинного мозга имеют важное значение для изучения травмы спинного мозга. Мы представляем новое автоматизированное устройство для ушиба спинного мозга для мышей, интеллектуальную систему травм спинного мозга Университета Гуанчжоу Цзинань, которая может создавать модели ушибов спинного мозга с точностью, воспроизводимостью и удобством. Система точно создает модели различной степени повреждения спинного мозга с помощью лазерных датчиков расстояния в сочетании с автоматизированной мобильной платформой и передовым программным обеспечением. Мы использовали эту систему для создания трехуровневых моделей мышей с травмами спинного мозга, определили их баллы по шкале Бассо (BMS) и провели поведенческие анализы, а также тесты на окрашивание, чтобы продемонстрировать их точность и воспроизводимость. Показан каждый шаг разработки моделей травм с использованием этого устройства, формируя стандартизированную процедуру. Этот метод позволяет создавать воспроизводимые модели мышей с ушибом спинного мозга и снижает факторы манипулирования человеком за счет удобных процедур обращения. Разработанная животная модель является достоверной для изучения механизмов повреждения спинного мозга и связанных с ними подходов к лечению.
Травма спинного мозга обычно приводит к постоянной дисфункции спинного мозга ниже поврежденного сегмента. В основном это вызвано предметами, ударяющимися о позвоночник, и гиперэкстензией позвоночника, такими как дорожно-транспортные происшествияи падения1. В связи с ограниченной доступностью эффективных вариантов лечения травмы спинного мозга, выяснение патогенеза повреждений спинного мозга на животных моделях будет информативным для разработки соответствующих подходов к лечению. Модель ушиба спинного мозга, вызванной воздействием на спинной мозг, приводит к разработке животных моделей с аналогичной патологией к большинству клинических случаев повреждения спинного мозга 2,3. Поэтому важно создавать точные, воспроизводимые и удобные модели животных для ушиба спинного мозга.
С тех пор, как в 1911 году Аллен изобрел первую животную модель травмы спинного мозга, были достигнуты значительные успехи в разработке инструментов длясоздания моделей повреждений спинного мозга у животных. В зависимости от механизмов травмы модели повреждения спинного мозга классифицируются как ушиб, компрессия, дистракционная деформация, вывих, транссекция или химическая6. Среди них модели контузии, которые используют внешние силы для смещения и травмирования спинного мозга, наиболее близки к клинической этиологии большинства пациентов с травмой спинного мозга. Поэтому модель контузии использовалась многими исследователями при изучении травм спинного мозга 3,7. Для разработки моделей ушибов спинного мозга используются различные инструменты. Многоцентровые исследования травм спинного мозга животных (MASCIS) Нью-Йоркского университета (NYU) производят ушибы спинного мозга с помощью устройства для сброса веса8. После нескольких обновленных версий импактор MASCIS широко используется для разработки моделей животных при ушибе спинного мозга9. Однако, когда ударный стержень MASCIS падает и ударяется о спинной мозг, могут произойти множественные травмы, что влияет на степень повреждения в моделях травм спинного мозга. Кроме того, достижение механической точности для обеспечения точности прибора и повторяемости производственной модели также является сложной задачей. Импакторы с бесконечным горизонтом вызывают ушибы, контролируя силу, приложенную к спинному мозгу, а не тяжелые капли10. Он использует компьютер, подключенный к датчику, для непосредственного измерения силы удара между ударным механизмом и спинным мозгом. При достижении порога ударник немедленно втягивается, тем самым избегая отскока груза и повышая точность10,11. Тем не менее, использование этой мелкой моторики для нанесения повреждений может привести к непоследовательнымповреждениям и функциональным дефицитам6. Устройство Университета штата Огайо (OSU) сжимает дорсальную поверхность спинного мозга с переходной скоростью с помощью электромагнитного драйвера12,13. Это устройство похоже на импакторы с бесконечным горизонтом, так как оно использует компрессии на короткие расстояния для нанесения травм спинного мозга. Однако он имеет различные ограничения в том, что первоначальное определение нулевой точки вызовет ошибки из-за присутствия спинномозговой жидкости 6,14. Таким образом, существует множество инструментов, которые могут быть использованы для разработки моделей контузии спинного мозга на животных, но все они имеют некоторые ограничения, которые приводят к недостаточной точности и воспроизводимости моделей животных. Поэтому для более точного, удобного и воспроизводимого создания моделей ушиба спинного мозга мышью необходим автоматизированный и интеллектуальный импактор травмы спинного мозга.
Мы представляем новый импактор для травм спинного мозга, интеллектуальную систему травм спинного мозга Университета Гуанчжоу Цзинань (G smart SCI system; Рис. 1) для создания моделей ушибов спинного мозга. В качестве позиционирующего устройства устройство использует лазерный дальномер в сочетании с автоматизированной мобильной платформой для автоматизации ударов по заданным параметрам удара, включая скорость удара, глубину поражения и время пребывания. Автоматизированная работа снижает человеческий фактор и повышает точность, а также воспроизводимость моделей животных.
Исследования с участием животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике Цзинаньского университета.
1. Обезболивание животных и спинальная ламинэктомия Т10
2. Ушиб спинного мозга T10 с помощью системы G smart SCI
3. Послеоперационный уход
4. Тестирование последствий травмы позвоночника
Ламинэктомия была выполнена 24 самкам мышей (в возрасте 8 недель), как описано выше. Мыши в фиктивной группе (n=6) не подвергались повреждению спинного мозга, в то время как остальные мыши, включая группу 0,5 мм (n=6), группу 0,8 мм (n=6) и группу 1,1 мм (n=6), подвергались удару спинного мозга разной глубины. Показатели BMS регулярно регистрировались в течение 1 месяца после операции (рис. 4). Выявлены достоверные различия в послеоперационных показателях BMS мышей в разных группах. Через 1 месяц мыши в группе 0,5 мм имели от 4 до 6 послеоперационных баллов и восстановились до того же уровня, что и фиктивная группа. Мыши в группах 0,8 мм и 1,1 мм имели от 1 до 2 послеоперационных баллов. Через 1 месяц группа 0,8 мм восстановилась до 4-6 баллов, в то время как мыши в группе 1,1 мм почти не восстановились.
Через 1 месяц были проведены поведенческие анализы животных, включая дефект стопы, ротарод и подиум. При анализе разлома стопы (рис. 5А) не было выявлено существенных различий в разломе задней конечности между группами 0,5 мм и фиктивными группами. Тем не менее, дефект стопы задних конечностей в группе 0,8 мм достоверно отличался от всех остальных групп. Частота ошибок в работе ног у мышей в группе 1,1 мм составила 100%, потому что задние конечности не могли поддерживать животное на земле, и значительно отличалась от других групп. В тесте ротарод (рис. 5B) мы зафиксировали время падения латентности в разных группах мышей. Обе группы 0,8 мм и 1,1 мм значительно отличались от других групп, но фиктивная группа имела те же результаты, что и группа 0,5 мм. В тесте на подиуме (рис. 6) мы регистрировали и анализировали индекс регулярности и максимальную площадь контакта сзади в разных группах мышей. Были выявлены существенные различия в индексе регулярности и максимальных зонах контакта между мышами в разных группах, что указывает на существенные различия в функциях ходьбы между мышами с разной глубиной повреждения спинного мозга. Поэтому с помощью разработанного устройства можно создавать модели мышей с разной глубиной поражения спинного мозга и со значительными различиями в функциях задних конечностей.
Наконец, мы резецировали спинной мозг мышей (рис. 7А) и сделали срезы для окрашивания гематоксилином и эозином (ГЭ) (рис. 7В). Были обнаружены различные степени повреждения как на изображениях спинного мозга, так и на участках, окрашенных HE. Таким образом, мы точно разработали различные модели мышей с травмами спинного мозга с использованием предложенного инструмента.

Рисунок 1: Интеллектуальная система лечения травм спинного мозга Университета Гуанчжоу Цзинань (система G smart SCI). Закрепите спинальный иммобилайзер для иммобилизации мыши на столе переноски. Устанавливайте параметры воздействия с помощью сенсорного экрана. Используйте боковой микродрайвер для регулировки боковых положений переноски и используйте сенсорный экран для регулировки фронтальных положений. Лазерный дальномер подтверждает положение удара и измеряет высоту удара, чтобы ударная головка могла точно нанести удар в соответствии с заданным положением и глубиной удара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Рабочий сенсорный экран. (A) На странице параметров можно задать параметры повреждения, включая скорость удара (0,5 -2,0 м/с), глубину удара (0 -3 мм) и время выдержки (500 -2 мс). (B) На движущейся странице можно задать высоту ударной головки и положение спинального фиксатора. (C) На странице подготовки нажатие кнопки «Готово » приведет к автоматической регулировке ударной головки и несущего стола в определенное положение в зависимости от заданных параметров. При нажатии кнопки «Пуск » ударная головка ударит по спинному мозгу в зависимости от заданных параметров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Спинной мозг после травмы. (А) Фиктивная группа. Спинальный иммобилайзер иммобилизовал позвонки Т10, и спинной мозг обнажается после ламинэктомии без повреждений. (В) Группа 0,5 мм. Спинной мозг был слегка поврежден после удара на глубине 0,5 мм, и наблюдался небольшой застой. (С) Группа 0,8 мм. Спинной мозг был поврежден средней степени тяжести и имел явные застойные явления после удара на глубине 0,8 мм. (D) 1,1 мм. Спинной мозг был тяжело поврежден после удара на глубине 1,1 мм, и было много застойных явлений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Баллы BMS. Оценка BMS мышей регистрировалась с первого послеоперационного дня до одного месяца после операции (n =6 /группа). *p< 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 по сравнению с использованием односторонней ANOVA. Дата выражается в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Тест стопы и тест ротарода. (A) Дефекты задней стопы у мышей с различной степенью повреждения спинного мозга (n = 6 /группа). p <0,001 по сравнению с использованием односторонней ANOVA. (B) Латентность падения во время ускоряющегося ротарод сравнивали у мышей с разной степенью повреждений спинного мозга (n = 6 /группа). * p < 0,05, *** p < 0,001 по сравнению с использованием односторонней ANOVA. Дата выражается в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Подиумный тест. (А, В) Показатели регулярности у мышей с разной степенью поражения спинного мозга (n =6 /группа). * p < 0,05, *** p < 0,001 по сравнению с использованием односторонней ANOVA. (Б, Г) С помощью программного обеспечения автоматически анализировались максимальные площади контакта сзади (n =6 /группа). ** p < 0,01, *** p < 0,001 по сравнению с использованием односторонней ANOVA. Дата выражается в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Окрашивание спинного мозга и H&E. (A) Спинной мозг мышей с различной степенью повреждения через 1 месяц после операции. (Б) Увеличенные цифры. (C) Окрашивание H&E участков повреждения спинного мозга у мышей с различной степенью повреждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Травма спинного мозга может привести к сенсорному и двигательному дефициту, что может привести к серьезным физическим и умственным нарушениям. В Китае частота травм спинного мозга в разных провинциях колеблется от 14,6 до 60,6 на миллион18. Рост распространенности ТСМ окажет большее давление на систему здравоохранения. В настоящее время существует ограниченный эффективный вариант лечения повреждений спинного мозга, травм, поскольку его патомеханизмы и процессы восстановления еще не полностью изучены19. Существует необходимость в создании точных и воспроизводимых моделей повреждений спинного мозга на животных для исследования патомеханизмов и процессов восстановления повреждений спинного мозга. С этой целью мы разработали точный, воспроизводимый и простой инструмент для лечения травм спинного мозга.
Для создания контузионных моделей травм спинного мозгаиспользуется множество устройств, в том числе импактор NYU-MASCIS, импактор с бесконечным горизонтом и импактор OSU 8,9,12,13,20. Эти устройства сложны в эксплуатации и могут давать большие ошибки из-за разной квалификации персонала. Более того, в конструкциях этих устройств имеются различные недостатки, которые делают их менее точными и воспроизводимыми6. Конкретная локализация травмы спинного мозга определяет ее тяжесть, поэтому при создании моделей травмы спинного мозга метод позиционирования определяет точность моделирования21. Интеллектуальная система G SCI использует лазерный дальномер для определения местоположения места повреждения спинного мозга и регулирует высоту ударной головки на основе данных дальномера для установки глубины удара. Еще одним перкуссионным устройством, использующим лазерное позиционирование, является ударный аппарат Louisville Injury System (LISA) из Медицинской школы Университета Индианы15. Несмотря на то, что LISA использует лазерное позиционирование, оно требует ручного определения и регулировки высоты ударной головки для достижения контролируемой глубины удара, что увеличивает вмешательство человека. В то же время LISA использует пневматические забастовки и управление ноутбуком, что требует больше места для экспериментов и увеличивает эксплуатационные расходы10. Система G smart SCI снижает количество человеческих ошибок за счет полуавтоматизации рабочего процесса и легко перемещается благодаря своей легкой конструкции.
Исходя из заданных параметров, прибор может точно воздействовать на спинной мозг мышей, тем самым создавая модели с разной степенью травм спинного мозга. В этом исследовании мыши с разной степенью повреждений спинного мозга продемонстрировали значительные различия в функциях задних конечностей. Важно отметить, что анализы воспроизводимы и могут последовательно генерировать модели ТСМ.
В протоколе наиболее важными этапами являются точное выполнение ламинэктомии, стабилизация шипов мышей и использование лазера для точного позиционирования для обеспечения точности и повторяемости эксперимента. В процессе проектирования мы внесли некоторые улучшения в устройство. Мы обнаружили, что после удара арена не может легко вернуться в дальнюю точку, поэтому мы добавили кнопку для возврата в дальнюю точку. Более того, нужные параметры нельзя было быстро настроить, поэтому мы добавили цифровую клавиатуру для ввода. Также был улучшен электромагнитный привод медленной зарядки в первой версии. В настоящее время это устройство ограничено созданием моделей мышей с ушибом грудного отдела спинного мозга. Необходимо провести исследования, подтверждающие использование этого инструмента при создании моделей травм спинного мозга крыс или шейного отдела спинного мозга.
Кроме того, доктор Билген из Медицинской школы Университета Канзаса описал управляемое компьютером ударное устройство, которое может вызывать повреждения центральной нервной системы (ЦНС), включая черепно-мозговую травму (ЧМТ) и травму спинного мозга (ТСМ)22. Подобно нашему устройству, это устройство также использует множество коммерциализированного оборудования и систем, поэтому оно было успешно коммерциализировано и использовалось23. Оборудование, которое мы описываем, обладает характеристиками автоматизации, точности и удобства, и, как ожидается, будет коммерциализировано в будущем и принесет пользу большему количеству исследователей травм спинного мозга.
Таким образом, мы разработали автоматизированный ударный механизм спинного мозга мыши для создания моделей ушиба ТСМ. Устройство повышает точность с помощью лазерного дальномера и снижает количество человеческих ошибок за счет автоматизированного рабочего процесса. Кроме того, система G smart SCI проще в эксплуатации и переноске, чем другие устройства, что обеспечивает удобство исследования травм спинного мозга. Важно отметить, что устройство может точно и воспроизводимо создавать различные классы моделей мышей SCI в зависимости от потребностей эксперимента.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая, No 82102314 (для ZSJ) и 32170977 (для HSL) и Фондом естественных наук провинции Гуандун, No 2022A1515010438 (для ZSJ) и 2022A1515012306 (для HSL). Это исследование было поддержано Программой клинических передовых технологий Первой аффилированной больницы Цзинаньского университета, Китай, No JNU1AF- CFTP- 2022- a01206 (HSL). Это исследование было поддержано Проектом научно-технического плана Гуанчжоу, No 202201020018 (для HSL), 2023A04J1284 (для ZSJ) и 2023A03J1024 (для HSL).
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,01M PBS (порошок, pH7,2-7,4) | Solarbio Life Sciences | P1010 | |
| 2,2,2-трибромэтанол | Macklin | 75-80-9 | |
| 4% параформальдегид фиксатор тканей | Biosharp life science | BL539A | |
| Биомикроскоп | Leica | LCC50 HD | |
| CatWalk | Noldus Информационные технологии | CatWalk XT 9.1 | |
| Защитное стекло | CITOTEST Scientific | 10212432C | |
| Встраиваемая машина | Changzhou Zhongwei Электронный инструмент | BMJ-A Этанол | |
| абсолютный | DAMAO | 64-17-5 | |
| FootFaultScan | Clever Sys Inc. | - | |
| Предметное стекло | CITOTEST Scientific | 80302-2104 | |
| Набор для окрашивания гематоксилином и эозином | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| микрошлифовальный сверло | FEIYUBIO | 19-7010 | |
| Фиксатор позвоночника мыши | RWD Life Science | 68094 | |
| Парафиновый микротом | Thermo | shandon finesse 325 | |
| RotaRod для мышей | Ugo Basile | 47600 | |
| Стереомикроскоп | KUY NICE | SZM-7045 | |
| Трет-амиловый спирт | Macklin | 75-85-4 | |
| Ксилол | Китай Национальная Фармацевтическая Компания | 10023418 |