Псевдотипированные вирусы (ЛВ) представляют собой вирионы с дефектами репликации, которые используются для изучения взаимодействий между хозяином и вирусом в более безопасных условиях, чем при работе с подлинными вирусами. Здесь представлен подробный протокол, показывающий, как ПВ SARS-CoV-2 можно использовать для проверки нейтрализующей способности сыворотки крови пациентов после вакцинации против COVID-19.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Псевдотипированные вирусы как молекулярный инструмент мониторинга гуморальных иммунных реакций против SARS-CoV-2 с помощью нейтрализационного анализа
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Псевдотипированные вирусы (ЛВ) представляют собой молекулярные инструменты, которые могут быть использованы для изучения взаимодействий между вирусом хозяина и для проверки нейтрализующей способности образцов сыворотки, в дополнение к их более известному использованию в генной терапии для доставки интересующего гена. ФВ являются дефектными для репликации, потому что вирусный геном разделен на различные плазмиды, которые не включены в ФВ. Эта безопасная и универсальная система позволяет использовать фотоэлектрические элементы в лабораториях 2-го уровня биобезопасности. Здесь мы представляем общую методологию получения лентивирусных ВП на основе трех плазмид, упомянутых здесь: (1) основная плазмида, несущая репортерный ген, необходимый для мониторинга инфекции; (2) упаковочная плазмида, несущая гены всех структурных белков, необходимых для генерации PV; (3) плазмида экспрессии гликопротеина на поверхности оболочки, которая определяет тропизм вируса и опосредует проникновение вируса в клетку-хозяина. В этой работе SARS-CoV-2 Spike представляет собой гликопротеин оболочки, используемый для производства нерепликативных псевдотипированных лентивирусов SARS-CoV-2.
Вкратце, упаковочные клетки (HEK293T) были котрансфицированы тремя различными плазмидами с использованием стандартных методов. Через 48 ч надосадочную жидкость, содержащую PV, собирали, фильтровали и хранили при -80 °C. Инфекционность ВВ SARS-CoV-2 проверяли путем изучения экспрессии репортерного гена (люциферазы) в клеточной линии-мишени через 48 ч после заражения. Чем выше значение единиц относительной люминесценции (RLU), тем выше частота заражения/трансдукции. Кроме того, к последовательно разбавленным образцам сыворотки крови добавляли инфекционные ФВ для изучения процесса нейтрализации проникновения псевдовирусов в клетки-мишени, измеряемого как снижение интенсивности РЛУ: более низкие значения, соответствующие высокой нейтрализующей активности.
Введение
Псевдотипированные вирусы (ФВ) — это молекулярные инструменты, используемые в микробиологии для изучения взаимодействий вируса-хозяина и патоген-патоген 1,2,3,4. PV состоят из внутренней части, вирусного ядра, которое защищает вирусный геном, и внешней части, гликопротеинов оболочки на поверхности вируса, которые определяюттропизм. Псевдовирус неспособен к репликации в клетке-мишени, потому что он не содержит всей генетической информации для генерации новых вирусных частиц. Такое сочетание специфических особенностей д....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Настоящий протокол был одобрен и соответствует руководящим принципам Этического комитета Университета Вероны (протокол утверждения No 1538). От людей, участвовавших в исследовании, было получено информированное письменное согласие. Образцы цельной крови были взяты у добровольцев из числа медицинских работников, которые находились в процессе получения вакцин против SARS-CoV-2. Эти образцы собирали в пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянты, для последующего выделения сыворотки15.
Все последующие процессы должны выполняться в биологическом колпаке класса 2, работающем в стерильных условиях. Обращение с вирусами ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В настоящем протоколе описывается производство ПВ SARS-CoV-2 и последующее применение этих ПВ для анализа нейтрализующей активности сыворотки/плазмы у субъектов, получающих вакцинацию против COVID-1917. Кроме того, этот протокол может быть применен для получения псевдотипов каждого вызывающего озабоченность варианта SARS-CoV-2 (ВВО) для проверки эволюции нейтрализующего ответа. Несмотря на то, что этот протокол облегчает изучение гуморального иммунного ответа после вакцинации против COVID-19, он м.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на то, что использование вируса дикого типа имитирует реальную инфекцию, лентивирусные ФВ являются более безопасным вариантом для изучения механизмов, связанных с проникновением вируса и инфекцией, без строгих требований безопасности, необходимых для работы с патогенными вирусами 4,20,21. ФВ состоят из вирусного ядра с дефектом репликации, окруженного гликопротеином поверхностной оболочки патогенного вируса, что и являе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Мы выражаем признательность волонтерам из числа медицинских работников. Этот проект был поддержан Департаментом передового опыта 2023/2027, MUR, Италия. AR и DZ были поддержаны PRIN2022 (финансирование ЕС; NextGenerationEU)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,45 мкм; m фильтр | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-луночный планшет | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-луночный планшет | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Центробежные фильтрующие блоки | Merck | 10403892 | |
| черным непрозрачным 96-луночным микропланшетом | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500 мл | |
| фосфатно-солевого буфера Дульбекко (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | В рукописи мы заменяем коммерческое название на 'программа анализа данных'HEK293T |
| клетки | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 клетки | ATCC | CRL-3216 | HEK293T был трансдуцирован для сверхэкспрессии ACE2 с помощью лентивирусного вектора. |
| L-глютамин | Люминометр AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| - Виктор3 Перкин | Элмер | HH35000500 | В рукописи мы заменяем коммерческое название на 'люминометр' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | В рукописи мы заменяем коммерческое название на «восстановленная сывороточная среда». |
| p8.91 упаковка плазмиды | Di Genova et al., 2021 | Добрый подарок от профессора Найджела Темпертона (ссылка 16.) | |
| Репортер pCSFLW Плазмида | Ди Дженова и др., 2021 | Добрый подарок от профессора Найджела Темпертона (ссылка 16.) | |
| Пенициллин/стрептомицин | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Полиэтилениленимин, разветвленный (PEI) (25 кДа) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | Эта плазмида была использована для получения HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike плазмиды экспрессии | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | В рукописи мы заменили коммерческое название на «реактив для чтения люциферазы» |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Ссылки
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
