Методическая статья

Определение прокоагулянтной активности внеклеточных везикул (ВВ) с помощью EV-активируемого временем свертывания крови (EV-ACT)

DOI:

10.3791/65661

⸱

4 августа 2023 г.

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, 3Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, 4Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе исследуется использование плазмы, обогащенной внеклеточными везикулами (ВВ), в качестве индикатора коагуляционной способности ВВ. Плазма, обогащенная EV, получают в процессе дифференциального центрифугирования и последующей рекальцификации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Роль внеклеточных везикул (ВВ) при различных заболеваниях привлекает все большее внимание, в частности, в связи с их мощной прокоагулянтной активностью. Тем не менее, существует острая необходимость в проведении прикроватного теста для оценки прокоагулянтной активности ВВ в клинических условиях. В данном исследовании предлагается использовать время активации тромбина в плазме, обогащенной ВВ, в качестве меры прокоагулянтной активности ВВ. Стандартизированные процедуры применялись для получения цельной крови с цитратом натрия с последующим дифференциальным центрифугированием для получения плазмы, обогащенной ЭВ. В тестовый стаканчик добавляли обогащенную EV плазму и хлорид кальция, а изменения вязкоупругости отслеживали в режиме реального времени с помощью анализатора. Определено время естественной коагуляции плазмы, обогащенной ВВ, получившей название EV-ACT. Результаты показали значительное увеличение EV-ACT при удалении EV из плазмы, полученной от здоровых добровольцев, в то время как оно значительно снижалось при обогащении EV. Кроме того, EV-ACT был значительно укорочен в образцах человека с преэклампсией, переломом шейки бедра и раком легких, что указывает на повышенный уровень EV в плазме и способствует гиперкоагуляции крови. Благодаря своей простой и быстрой процедуре, EV-ACT является многообещающим в качестве прикроватного теста для оценки свертывающей функции у пациентов с высоким уровнем EV в плазме.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоз, вызванный гиперкоагуляцией, играет значительную роль при различных заболеваниях, в том числе при черепно-мозговых травмах1, преэклампсии2, опухолях3 и переломаху пациентов 4. Механизм, лежащий в основе гиперкоагуляции, сложен, и в последнее время особое внимание уделяется роли внеклеточных везикул (ВВ) в нарушениях свертываемости крови. ВВ представляют собой везикулоподобные тела с двухслойной структурой, которые отделяются от клеточной мембраны, диаметром от 10 нм до 1000 нм. Они связаны с различными патологическими процессами, в частности с нарушениями свертываемости крови5. Несколько исследований определили ВВ как многообещающий предиктор риска тромбоза 6,7. Прокоагулянтная активность ВВ зависит от экспрессии факторов свертывания крови, в первую очередь тканевого фактора (ТФ) и фосфатидилсерина (ФС). ВВ с выраженной прокоагулянтной активностью значительно повышают каталитическую эффективность теназы и протромбинового комплекса, тем самым способствуя тромбин-опосредованному фибриногенам и местному тромбозу8. Повышенные уровни ВВ и их причинно-следственная связь с гиперкоагуляцией наблюдались при многочисленных заболеваниях9. Следовательно, стандартизация обнаружения ВВ и отчетности об их прокоагулянтной активности является важной областью исследований10.

На сегодняшний день доступно всего несколько коммерческих наборов для обнаружения прокоагулянтной активности электромобилей. Анализ MP-Activity и анализ MP-TF, производимые коммерческой компанией, являются функциональными анализами, используемыми для измерения прокоагулянтной активности EV в плазме11. В этих анализах используется принцип, аналогичный принципу иммуноферментных анализов для обнаружения ФС и ТФ на ВВ. Тем не менее, эти наборы стоят дорого и ограничены несколькими исследовательскими институтами высокого уровня. Этот процесс является сложным и трудоемким, что затрудняет их внедрение в клинических условиях. Кроме того, коммерчески разработанный прокоагулянтный фосфолипидный анализ (PPL) смешивает плазму, свободную от ФС, с тестовой плазмой, измеряя время свертывания крови для количественного определения уровней ФС-положительных EV12. Тем не менее, эти анализы в первую очередь сосредоточены на PS и TF на EV, упуская из виду другие пути свертывания крови, в которых могут быть задействованы циркулирующие EV12.

Система плазменной коагуляции сложна и включает в себя как «невидимые», так и «видимые» компоненты, включая коагулянты, антикоагулянты, фибринолитические системы и взвешенные в плазме ВВ. Физиологически эти компоненты поддерживают динамический баланс. При патологических состояниях значительно повышенное количество ВВ в циркуляции способствует гиперкоагуляции, особенно у пациентов с черепно-мозговыми травмами, преэклампсией, переломами и различными видами рака13. В настоящее время оценка свертывающего статуса в клинических лабораториях в первую очередь включает оценку свертывающей системы, антикоагулянтной системы и фибринолиза 14,15,16,17. Протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время, тромбиновое время и международное нормализованное соотношение обычно используются для оценки уровней фактора свертывания крови в системе свертываниякрови 18. Однако недавние исследования показали, что эти тесты не в полной мере отражают гиперкоагуляцию некоторых заболеваний19. Другие методы анализа, такие как тромбоэластометрия (ТЭГ), ротационная ТЭГ и анализ Соноклотом, измеряют вязкоупругие изменения цельной крови20,21. Поскольку образцы цельной крови содержат большое количество клеток крови и тромбоцитов, эти тесты с большей вероятностью покажут состояние свертываемости образца в целом. Некоторые исследователи сообщают о роли клеток крови и тромбоцитов в прокоагулянтной активности22,23. Недавнее исследование также показало, что предыдущие тесты на коагуляционную функцию сталкиваются с трудностями в обнаружении изменений прокоагулянтной активности микрочастиц24. В связи с этим была выдвинута гипотеза о том, что прокоагулянтная функция ВВ может быть оценена с помощью вязкоупругих измерений времени активированного свертывания (ACT) в плазме, обогащенной ВВ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сбор образцов для людей был одобрен Комитетом по медицинской этике больницы общего профиля Тяньцзиньского медицинского университета. Сбор венозной крови человека проводился в строгом соответствии с рекомендациями Национальной комиссии здравоохранения Китая, а именно WS/T 661-2020 «Руководство по сбору образцов венозной крови». Вкратце, кровь была взята у здоровых лиц с информированного согласия из передней плечевой вены, и образцы были смешаны с использованием 3,2% цитрата натрия антикоагулянта в соотношении 1:9. Когда были собраны только образцы антикоагулянтов цитрата натрия, первый сосуд для сбора был выброшен. Процесс обработки был начат в течение 0,5 ч после отбора пробы. Взрослые здоровые испытуемые были отобраны для сбора образцов после получения информированного согласия. Критериями исключения пациентов были: (1) недавний внутрисосудистый тромбоз, (2) нарушение функции печени и почек, (3) артериальная гипертензия, гиперлипидемия, диабет и другие хронические заболевания, (4) лечение аспирином или антикоагулянтами, (5) менструация и беременность.

1. Изоляция плазмы, обогащенной электромобилями

  1. Центрифугируют образцы при 120 х г в течение 20 мин при комнатной температуре для удаления клеток крови. Надосадочная жидкость представляет собой обогащенную тромбоцитами плазму. Затем переложите верхнюю 1/2 надосадочной жидкости в новую центрифужную пробирку с помощью пипетки.
  2. Центрифугируют обогащенную тромбоцитами плазму при 1500 x g в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы удалить тромбоциты. Надосадочная жидкость представляет собой бедную тромбоцитами плазму. Затем переложите верхнюю 1/2 надосадочной жидкости в новую центрифужную пробирку.
  3. Центрифугируют бедную тромбоцитами плазму при 13000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре для удаления клеточного мусора. Надосадочная жидкость представляет собой плазму, обогащенную ВВ. Затем переложите верхнюю 1/2 надосадочной жидкости в новую центрифужную пробирку для последующего испытания.

2. Определение EV-ACT образца анализатором

  1. Включите анализатор сгустков (см. Таблицу материалов) и нагрейте прибор до 37 °C. Установите одноразовый зонд и тестовый стаканчик, затем запустите процедуру контроля качества машины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда значение сигнала вязкостного сопротивления на экране отображается в виде прямой линии, это означает, что обнаружение не нарушено, и контроль качества состояния анализатора квалифицирован. Процедуру тестирования можно начинать после того, как самотестирование будет квалифицировано.
  2. Введите образец информации в систему. Затем перенесите 200 мкл плазмы, обогащенной ЭВ, в тестовый стаканчик, а затем 20 мМ 170 мкл хлорида кальция. Нажмите кнопку «Пуск». Магнитный стержень для перемешивания в тестовом стакане полностью перемешает образец и хлорид кальция. Закройте крышку, и щуп начнет обнаруживать изменение сопротивления образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения теста анализатор автоматически выдаст сообщение "test completed". Время EV-ACT отображается и записывается системой. Результат выражается в единице времени «секунда». Выбросьте зонд и проверьте чашку.

3. Контроль качества образца плазмы, обогащенного электромобилями, методом проточной цитометрии

  1. Электромобили впервые были идентифицированы по их размеру (0,1-1 мкм). Заранее отрегулируйте параметры проточного цитометра и установите «затвор» ВВ с помощью имеющихся в продаже гранул полистирола (0,5, 0,9 и 3,0 мкм) (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь гранул состоит из флуоресцентных сфер разного диаметра, охватывающих диапазон размеров микровезикул (0,5 и 0,9 мкм) и тромбоцитов (0,9 мкм и 3 мкм).
  2. Отрегулируйте напряжение прямого и бокового рассеяния и убедитесь, что микросферы размером 0,9 мкм попадают в соответствующую область. Область EV может быть нарисована в соответствии с диаметром микросферы.
  3. Перелейте 50 мкл плазмы, обогащенной электронным интеллектом, в проточную трубку, а затем 450 мкл отфильтрованного фосфатного буферного физиологического раствора. Тщательно перемешайте жидкость в проточной трубке. Наконец, выявляют образцы с помощью проточной цитометрии25.
  4. Используйте ультрарадужные флуоресцентные частицы (см. Таблицу материалов) для количественного определения количества EVs.In кратковременных, добавьте 10 мкл частиц в образец перед обнаружением потока и рассчитайте концентрацию EV по следующей формуле после завершения обнаружения образца: 10 120 * EV (#) / (микрогранулы * объем) * коэффициент разбавления26.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Время активации тромбина в плазме, обогащенной ЭВ, измеряли с помощью анализатора вязкоупругого метода для измерения времени коагуляции плазмы. Машина состоит из четырех основных компонентов: электронного преобразователя сигналов, зонда, бака для обнаружения и нагревательного элемента (рис. 1A,B). Датчик использует высокочастотные и низкоамплитудные колебания для обнаружения изменений вязкости плазмы. Ежедневный контроль качества в первую очередь включает в себя контроль кач...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании было описано получение плазмы, обогащенной ЭВ, а рациональность метода была проверена с помощью проточной цитометрии. В дальнейшем рекальцинированные образцы плазмы анализировали на время АКТ с помощью сгусткового анализатора, основанного на принципах вязкоупругости24. Как показано на рисунке 3А, было обнаружено, что концентрация ВВ, полученная с помощью ультрацентрифугирования, сокращает время ЭВ-АКТ, в то время как надосадочная жидкость после у...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявили об отсутствии потенциального конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке грантов Национального фонда естественных наук Китая, грант No 81930031, 81901525. Кроме того, мы благодарим компанию Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. за предоставление нам оборудования и технического руководства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
флуоресцентные частицы AccuCount Ultra Rainbow3,8 мкм; Spherotech, Лейк-Форест, Иллинойс, СШАДля количественного обнаружения
МП хлорида кальцияВерфен (Китай)002000680020 мМ
Анализатор сгустковTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., LtdПринцип заключается в измерении вязкости плазмы вязкоупругим методом
Одноразовый зонд и тестовый стаканчикTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa проточный цитометрBD, СШАИспользуется для обнаружения
полистирольных шариков MP MegamixBiocytex, Марсель, Франция7801Megamix состоит из смеси микрогранул выбранного диаметра: 0,5 &; м, 0,9 и микро; м и 3 &микро;м.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346(2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400(2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505(2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348(2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971(2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666(2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808(2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374(2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282(2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68(2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861(2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404(2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714(2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи