Здесь мы предоставляем полный протокол для стандартизации и реализации метода обнаружения вируса SARS-CoV-2 в образцах человека с помощью изотермической амплификации с обратной транскрипцией, опосредованной петлей (RT-LAMP). Этот метод, выполненный в течение 60 минут, может быть адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи по низкой цене и с использованием недорогого оборудования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение вируса SARS-CoV-2 с помощью изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Вирус тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) оказал серьезное воздействие на здоровье человека. Она продолжает оставаться угрозой для современного общества, потому что многие люди умирают в результате инфекции. Заболевание диагностируется с помощью серологических и молекулярных тестов, таких как золотой стандарт полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР). Последний имеет ряд недостатков, поскольку требует специализированной инфраструктуры, дорогостоящего оборудования и обученного персонала. В этой статье мы представляем протокол, в котором изложены шаги, необходимые для обнаружения вируса SARS-CoV-2 с помощью изотермической амплификации, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP) в образцах человека. Протокол включает в себя инструкции по проектированию праймеров in silico, приготовлению реагентов, амплификации и визуализации. После стандартизации этот метод может быть легко внедрен и адаптирован к любой лаборатории или месту оказания медицинской помощи в течение 60 минут по низкой цене и с использованием недорогого оборудования. Он приспосабливается к обнаружению различных патогенов. Таким образом, он потенциально может быть использован в полевых условиях и в медицинских центрах для проведения своевременного эпидемиологического надзора.
Введение
Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) вызывает коронавирусную инфекцию 2019 года (COVID-19). 30 января 2020 г. Всемирная организация здравоохранения объявила чрезвычайную ситуацию в области общественного здравоохранения, имеющую международное значение, а 11 марта 2020 г. – пандемию. На момент написания этой статьи пандемия привела к более чем 760 миллионам случаев заболевания и 6,87 миллионам смертей1.
Воздействие этого вируса высветило необходимость в более совершенных, точных, быстрых и широко доступных инструментах эпиднадзора для улучшения выявления инфекционных заболеваний и борьбы ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Используемые образцы были предоставлены клинической лабораторией университетской больницы Fundación Valle del Lili и соответствовали очищенной РНК пациентов с положительным результатом теста на COVID-19 с использованием метода ОТ-кПЦР. Все пациенты дали информированное согласие на проведение исследования, и это исследование было одобрено биоэтическим комитетом по исследованиям на людях из университетской больницы Fundación Valle del Lili.
1. Проектирование и подготовка грунтовки RT-LAMP
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры LAMP можно использовать с различными платформами, включая New England BioLabs (NEB) LAMP, Pr....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Реализация протокола начинается с разработки набора праймеров для каждого гена-мишени в соответствии с описанным выше протоколом. В июне 2020 года из базы данных NextStrain было получено 5 000 геномов SARS-CoV-2, репрезентативность которых составила 10% от колумбийских геномов. Эти последовательности были выровнены для получения согласованной последовательности, которая использовалась в процессе проектирования грунтовки. В таблице 1 приведен набор праймеров, выбранный для праймеров RdRp/Hel и RdRp. Набор.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Несмотря на то, что RT-LAMP рассматривается как дополнительная методология для выполнения молекулярной диагностики, она также имеет некоторые ограничения и критические шаги, которые необходимо учитывать при стандартизации и внедрении протокола.
В рамках стандартизации LAMP для обнаружения SARS-CoV-2 оценивались следующие параметры и компоненты в основной смеси: (a) концентрация и температура выравнивания праймеров; b) концентрация ферментов; с) концентрация магния; d) время реакции; (e) включе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Наталья Кампильо-Педроза является генеральным директором компании BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа финансировалась Генеральной системой королевских прав (Sistema General de Regalías) из Колумбии, грант номер BPIN 2020000100092, и Universidad Icesi – Convocatoria Interna, грант No CA0413119. MFVT также финансировался из фондов доцентов Андского университета. Финансирующие организации не принимали участия в разработке, выполнении мероприятий, сборе данных, анализе данных и подготовке рукописи. Выражаем благодарность Университетской больнице Fundación Valle del Lili за вирусную РНК из образцов Sars-CoV-2 и доктору Альваро Баррере-Окампо за комментарии к рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 kb Лестница | ДНК SOLIS BIODYNE | 07-12-00050 | Хранить при -20 ° C |
| 50x TAE Буфер для электрофореза | ThermoScientific | B49 | Хранить при комнатной температуре |
| Accuris High Fidelity Polymerase | ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS | PR1000-HF-200 | Его можно использовать в случае, если Q5 High-Fidelity DNA polymerase не может быть куплена. Для фермента сделайте аликвоты соответствующего объема и храните при -20°С; C до использования. |
| Agarose | PanReacAppliChem | A8963,0100 | N/A |
| Bst 3.0 ДНК-полимераза 8000 МЕ/мл | New England BioLabs | M0374S/M0374L | Для фермента сделайте аликвоты соответствующего объема и храните при -20 °°; C до использования. |
| Набор растворов дезоксинуклеотидов (dNTP) | England BioLabs | N0446S | хранить при температуре -20 ° deg; C |
| Диэтилпирокарбонат | Sigma-Aldrich | 159220-25G | С осторожностью обращайтесь с ним под вытяжным шкафом |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, готовый к использованию | ThermoScientific | SM0322 | Хранить при -20 ° C |
| Гидрокси-нафтоловая синяя динатриевая соль | Santa Cruz Biotechnology | sc-215156B | N/A |
| Q5 Высокоточная ДНК-полимераза 2000 МЕ/мл | New England BioLabs | M0491S/M0491L | Для фермента сделайте аликвоты соответствующего объема и храните при -20 °°; C до использования. |
| Обратная транскриптаза WarmStart RTx 15000 МЕ/мл | New England BioLabs | M0380S/M0380L | Для фермента изготовьте аликвоты соответствующего объема и храните при -20°С; C до использования. |
Ссылки
- World Health Organization. Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , https://covid19.who.int/ (2023).
- Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Public Health. 13
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
