Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ митохондриальной функции у PINK1B9-нулевого мутанта Drosophila melanogaster с использованием респирометрии высокого разрешения

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65664

⸱

10 ноября 2023 г.

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол респирометрии высокого разрешения для анализа биоэнергетики у мутантных плодовых мушек PINK1B9-null. В методе используется протокол SUIT (субстрат-разветвитель-ингибитор-титрование).

Аннотация

Нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Паркинсона (БП), и клеточные нарушения, такие как рак, являются одними из расстройств, которые нарушают энергетический метаболизм с нарушением функций митохондрий. Митохондрии — это органеллы, которые контролируют как энергетический обмен, так и клеточные процессы, участвующие в выживании и гибели клеток. По этой причине подходы к оценке функции митохондрий могут дать важную информацию о клеточных состояниях при патологических и физиологических процессах. В связи с этим протоколы респирометрии высокого разрешения (HRR) позволяют оценить всю функцию дыхательной цепи митохондрий или активность специфических митохондриальных комплексов. Кроме того, изучение физиологии митохондрий и биоэнергетики требует генетически и экспериментально управляемых моделей, таких как Drosophila melanogaster.

Эта модель имеет ряд преимуществ, таких как сходство с физиологией человека, быстрый жизненный цикл, простота обслуживания, экономичность, высокая пропускная способность и минимальное количество этических проблем. Эти свойства в совокупности делают его бесценным инструментом для анализа сложных клеточных процессов. В настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию с использованием мутанта Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Ген pink1 отвечает за кодирование PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 посредством процесса, известного как митофагия, который имеет решающее значение для удаления дисфункциональных митохондрий из митохондриальной сети. Мутации в этом гене были связаны с аутосомно-рецессивной ранней семейной формой болезни Паркинсона. Данная модель может быть использована для изучения митохондриальной дисфункции, участвующей в патофизиологии болезни Паркинсона.

Введение

Митохондрии — это клеточные органеллы, которые контролируют важные функции, включая регуляцию апоптоза, гомеостаз кальция и участие в биосинтетических путях. Обладая автономным генетическим материалом, они способны вносить свой вклад в процессы поддержания и восстановления клеток. В их структуре находятся цепь переноса электронов и окислительное фосфорилирование, которые имеют решающее значение для клеточной энергии 1,2,3. В частности, энергетический контроль достигается за счет производства аденозинтрифосфата (АТФ) путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS)2. Нарушение энергетического обмена с нарушением функций митохондрий происходит как при выживаемости, так и при гибели клеток 4,5, часто связанных с широким спектром патологий человека, таких как рак, и нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона (БП)3,6.

Болезнь Паркинсона является хроническим, прогрессирующим и неврологическим расстройством. Основной причиной этого заболевания является гибель клеток головного мозга, особенно черной субстанции, которые отвечают за выработку нейромедиатора дофамина, контролирующего движения 6,7,8. Самое раннее наблюдение, которое связало паркинсонизм с митохондриальной дисфункцией, было сделано в 1988 году в экспериментальных моделях с использованием токсинов, которые ингибируют дыхательную цепь Complex I9.

В настоящее время существует несколько методов оценки митохондриальной дисфункции 10,11,12,1 3; однако, по сравнению с традиционными подходами, респирометрия высокого разрешения (HRR) обладает более высокой чувствительностью и преимуществами13,14. Например, протоколы HRR позволяют оценить всю функцию митохондриальной дыхательной цепи или активность специфических митохондриальных комплексов14,15. Митохондриальные дисфункции могут быть оценены в интактных клетках, изолированных митохондриях или даже ex vivo 10,11,13,14.

Митохондриальные дисфункции тесно связаны со многими патологическими и физиологическими процессами. Поэтому важно изучать митохондриальную физиологию и биоэнергетику с использованием генетически и экспериментально управляемых модельных систем. В этом отношении исследования дрозофилы меланогастер, плодовой мушки, имеют ряд преимуществ. Эта модель разделяет фундаментальные клеточные характеристики и процессы с людьми, включая использование ДНК в качестве генетического материала, общих органелл и консервативных молекулярных путей, участвующих в развитии, иммунитете и клеточной сигнализации. Кроме того, плодовые мушки обладают быстрым жизненным циклом, простотой в уходе, низкой стоимостью, высокой пропускной способностью и меньшим количеством этических проблем, что представляет собой бесценный инструмент для препарирования сложных клеточных процессов 16,17,18,19,20.

Кроме того, гомолог гена PTEN-индуцированной предполагаемой киназы 1 (pink1) экспрессируется у D. melanogaster. Он играет решающую роль в удалении поврежденных митохондрий в процессе митофагии8. У людей мутации в этом гене предрасполагают людей к аутосомно-рецессивной семейной форме болезни Паркинсона, связанной с митохондриальной дисфункцией 8,21,22,23. Следовательно, плодовая мушка является мощной животной моделью для исследований патофизиологии болезни Паркинсона и скрининга кандидатов в лекарственные препараты с акцентом на митохондриальную дисфункцию и биоэнергетику. Таким образом, в настоящей работе объясняется, как анализировать митохондриальную функцию в модели БП от D. melanogaster с использованием метода HRR в OROBOROS с протоколом Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мы использовали штаммы w1118 (белый) и w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (называемый Pink1B9) (идентификатор FlyBase: FBgn0029891) из Блумингтонского центра дрозофилы (идентификационный номер: 34749). В данном исследовании мужские мутанты D. melanogaster PINK1B9-null сравниваются с самцами D. melanogaster из штамма w1118, который используется в качестве контрольной группы (генетический фон). Другие параметры должны быть проанализированы одновременно с экспериментами по респирометрии, чтобы убедиться, что мухи имеют правильный генотип (Pink1B9/Y), такие как деформации грудной клетки и проблемы с локомоцией, которые хорошо описаны для мух-мутантов pink1B9 24,25,26.

1. Животные и жилье

  1. Содержать мух в стеклянных бутылках, содержащих 10 мл стандартного рациона (дрожжи 1,73%, соевая мука 0,9%, кукурузная мука 7,3%, агар 0,5%, кукурузный сироп 7,6% и пропионовая кислота 0,48%) при постоянной температуре и влажности (25 °C и 60% соответственно) с циклом свет/темнота 12 ч:12 ч.
  2. Для каждого эксперимента используют двух мух в возрасте 1-3 дней после эклозии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самки девственных мух PINK1B9-null были скрещены с самцами w1118 для получения самцов F1 с генотипом Pink1B9/Y.

2. Пробоподготовка

  1. Подготовьте буфер MiR05, как описано в таблице 1.
  2. Обезболивайте мух на льду и перекладывайте их в микроцентрифужные пробирки (две мухи в пробирке).
  3. В каждую пробирку добавьте 200 мкл охлажденного буфера MiR05 и гомогенизируйте мух. Гомогенизируйте вручную, слегка надавливая (примерно 4-6 ударов пестика), чтобы предотвратить распад митохондрий.

3. Высокоразрешающая респирометрическая калибровка полярографических датчиков кислорода

ПРИМЕЧАНИЕ: Камеры OROBOROS имеют общий объем около 2 мл. Калибровка необходима для того, чтобы убедиться, что поток кислорода близок к 0 пмоль, чтобы начать анализ.

  1. Начав калибровку, добавьте в камеру 2 мл MiR05. Накройте камеру пробкой, не оставляя пузырьков воздуха; Затем осторожно потяните за пробку, чтобы образовался один пузырь воздуха.
  2. Откройте программу OROBOROS Dat.Lab. Введите температуру 25 °C в поле «Температура блока » и нажмите « Подключиться к Oxygraph-2k » (Рисунок 1A).
  3. Нажмите и выберите папку, в которой должна быть сохранена калибровка, и нажмите «Сохранить».
  4. Когда откроется новое окно, назовите эксперимент и образцы (если вы калибруете, просто введите название calibration) и нажмите « Сохранить».
  5. Перейдите в меню Layout и выберите первый вариант: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp , как показано на рисунке 1B.
  6. Дождитесь перенаправления программы на макет калибровки, подождите, пока красная линия покажет стандартную прямую с точками около 0 пмоль. Затем выберите две точки: одну для камеры А , а другую для камеры В (рис. 1С), когда красная линия будет точно равна нулю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные точки должны иметь поток кислорода (красная линия) около 0.
    1. Чтобы отметить точки обеих камер, выберите концентрациюO2 в правой части экрана, выберите отмеченную точку и скопируйте значения температуры и барометрического давления относительно точки. Вставьте эти значения в поля ниже и нажмите Calibrate and Copy to Clipboard в правом нижнем углу экрана, как показано на рисунке 2.
    2. Проделайте этот процесс для обеих камер (A и B), затем перейдите в меню «Файл » и выберите «Сохранить и отключить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: После процесса калибровки программа перенаправит пользователя на главный экран, чтобы программное обеспечение было готово к запуску теста HRR. Для этого теста мы будем использовать протокол SUIT.

4. Протокол SUIT

  1. Завершив калибровку, снимите пробки и откройте камеры.
  2. Промойте пробки (держа наконечник, который не касается образца) и камеры 100% этанолом, 70% этанолом и дистиллированной водой в указанном порядке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте процесс для каждой смены образца.
  3. Гомогенизируйте мух в 200 мкл буфера, поместите все содержимое образца в камеру с помощью микропипетки и переместите пробку в камеру, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образуются пузырьки воздуха, осторожно снимите пробку и добавьте 100 мкл буфера MIR05.
  4. Щелкните меню Layout и выберите опцию 05 Flow by Corrected Volume , как показано на рисунке 1B.
  5. Подождите, пока вас перенаправят в новое окно. Нажмите кнопку Сохранить , чтобы выбрать папку, в которую нужно сохранить эксперимент.
  6. Подождите, пока откроется еще одно новое окно. Назовите эксперимент в пространстве Экспериментальный код. Затем назовите каждый образец в соответствующей камере A и B в поле Sample и задайте для поля Unit значение unit.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно выбрать другие единицы, например, Миллионы клеток или мг.
  7. Учитывая, что в этом протоколе используются две мухи (2 единицы), а объем камеры составляет 2 мл, в поле «Концентрация » определите 1 на мл (рис. 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь количество выборки было нормировано по количеству мух; однако эта нормализация может быть выполнена по содержанию белка в образце, количественному определению митохондриальной ДНК или активности цитратсинтазы.
  8. Когда сигнал потока кислорода (красная линия) стабилизируется на положительном значении, начинайте протокол HRR с титрования субстратов, ингибиторов и развязывателей (рис. 3). Все последующие реагенты и оборудование приведены в таблице 1.
    1. Добавьте дигитонин (5 мкг/мл) для пермеабилизации митохондриальной мембраны.
    2. Добавьте пируват (5 мМ), малат (2 мМ) и пролин (10 мМ) субстраты и подождите, пока поток кислорода не увеличится и не стабилизируется. Чтобы отметить событие для каждого добавления реагента, нажмите клавишу F4 на клавиатуре и введите название каждого реагента.
    3. Добавьте АДФ (5 мМ), чтобы связать митохондриальную дыхательную цепь, и дождитесь увеличения и стабилизации потока кислорода.
    4. Добавляем сукцинат (10 мМ) и ждем увеличения и стабилизации потока кислорода.
    5. Добавьте олигомицин (2,5 мкМ), чтобы ингибировать АТФ-синтазу и искать снижение потока кислорода.
    6. Подождите, пока красная линия стабилизируется, и разъедините митохондриальный перенос электронов с помощью карбонил-4-(трифторметокси)фенилгидразинцианида (FCCP) с титрами 0,25 мкМ, пока не будет достигнуто максимальное потребление кислорода, о чем свидетельствует подъем красной линии. После стабилизации потока кислорода начинайте добавлять ингибиторы каждого комплекса по одному.
    7. Добавьте ротенон (0,5 мкМ), комплексный ингибитор I. Дождитесь снижения и стабилизации потока кислорода, чтобы добавить следующий ингибитор.
    8. Добавьте малонат (5 мМ), комплексный ингибитор II. Дождитесь снижения и стабилизации потока кислорода, чтобы добавить следующий ингибитор.
    9. Наконец, добавьте антимицин (2,5 мкМ), комплексный ингибитор III. Дождитесь снижения с последующим увеличением и стабилизацией потока кислорода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поток кислорода должен стабилизироваться на положительном значении, но ниже значения последнего ингибирования митохондриальных белковых комплексов.
  9. По окончании анализа удалите все содержимое камер с помощью микропипетки. Хранить при температуре -20 °C для последующего анализа, когда это необходимо.

5. Анализ данных

  1. Используйте соответствующий пакет статистического программного обеспечения для анализа данных.
  2. Выполните t-критерий для оценки различий между двумя группами. В ситуациях, включающих несколько методов лечения, используйте дисперсионный анализ (ANOVA) в качестве статистического критерия 27.
  3. Извлеките значения потокаO2 из графика, сгенерированного программным обеспечением. OXPHOS CI относится к значению потокаO2 после добавления АДФ. OXPHOS CII получается путем вычитания OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII – это значение флюсаO2 , экстрагированного после добавления сукцината. ETS CI&CII — это величина потокаO2 после добавления FCCP. ETS CI = FCCP - Ротенон и ETS CII = Ротенон - Малонат.
  4. Рассчитайте синтез АТФ как разность между OXPHOS (P) и LEAK (L) (P - L)28.
  5. Определите коэффициент контроля дыхания (RCR), рассчитав соотношение OXPHOS/LEAK, где RCR = P/L.11

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы видим, что потокO2 в состояниях OXPHOS CI (P = 0,0341) и OXPHOS CI&II (P = 0,0392) уменьшается у нулевых мух PINK1B9 по сравнению с контрольными мухами (рис. 4). Этот результат также наблюдался в предыдущих результатах нашей группы29,30.

CI и CII являются ключевыми компонентами системы переноса электронов (ETS), в которой CI отвечает за перенос э...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

HRR является мощным методом изучения митохондриального дыхания и энергетического обмена у D. melanogaster и других организмов. Он обеспечивает детальную и количественную оценку митохондриальной функции, позволяя исследователям получить представление о биоэнергетике клеток. Представленный здесь протокол описывает оценку функции дыхательной цепи митохондрий и активности специфических митохондриальных комплексов с использованием протокола SUIT у D. melanogaster. Протокол SUIT включает в себя систематическо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность бразильскому агентству Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) и T.D. (#88887.512883/2020-00) являются получателями исследовательских стипендий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ADPSigma-AldrichA5285Аденозин 5′-дифосфат натрия sal (номер CAS 72696-48-1); ≥ 95%; молекулярная масса = 501,31 г/моль.
´ garKasvK25-1800Для бактериологического применения
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS номер 1397-94-0); молекулярная масса   540 г/моль;
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA7030Бычий сывороточный альбумин (номер CAS 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Программное обеспечение DatlabOroboros Instruments, Инсбрук, Австрия20700Программное обеспечение для сбора и анализа данных
DigitoninSigma-AldrichD 5628CAS номер 11024-24-1
Дистиллированная вода
Drosophila melanogaster штамм w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Получено из Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster штамм  w1118Получено  от Федерального университета Санта-Марии
EGTASigma-AldrichE8145Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (номер CAS 13638-13-3); ≥ 97%; молекулярная масса =468,28 г/моль
FCCPSigma-AldrichC2920Карбонильцианид 4- (трифторметокси)фенилгидразон  (номер CAS 370-86-5); ≥ 98% (TLC), порошок 
Версия GraphPad Prism 8.0.1.Программное обеспечение для сбора и анализа данных
HepesSigma-AldrichH40344-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этанесульфоновая кислота (номер CAS 7365-45-9); 99,5% (титрование), протестировано на клеточной культуре; молекулярная масса = 238,30 г/моль
Респирометр высокого разрешения Oxygraph O2KOroboros Instruments, Инсбрук, Австрия10022-02Startup O2K респирометр
комплект KH2PO4Sigma-AldrichP5379Монокалийфосфат (номер CAS 7778-77-0); Реагент Плюс, молекулярный вес = 136,09 г/моль
KOHSigma-Aldrich211473гидроксид калия (номер CAS 1310-58-3); реагент ACS, ≥ 85%, гранулы
малатаSigma-AldrichM1296Малоновая кислота (номер CAS 141-82-2); 99%, молекулярная масса = 104,06 г/моль). pH раствора регулируется примерно до 7,0.
Яблочная кислотаСигма-ОлдричM1000(S)-(&минус;)-2-Гидроксиянтарная кислота (номер CAS 97-67-6); ≥ 95% ; молекулярная масса = 134,09 г/моль
MESSigma-AldrichM36712-(N-Morpholino)этансульфоновая кислота (номер CAS 4432-31-9); ≥ 99% (титрование); молекулярная масса = 195,24 г/моль
MgCl2Sigma-AldrichM8266Magnesium chloride (номер CAS 7786-30-3); безводный, ≥ 98%, молекулярная масса = 95,21 г/моль
Микроцентрифужные пробиркиEppendorf
O2K-Titration SetOroboros Instruments, Инсбрук, Австрия20820-03Шприцы Hamilton разного объема
ОлигомицинSigma-AldrichO 4876Олигомицин из  Streptomyces diastatochromogenes (номер CAS  1404-19-9); ≥ 90% всего олигомицинов в основе (ВЭЖХ)
Пестик для гомогенизации
Proline Sigma-AldrichP0380L-Proline (номер CAS 147-85-3); порошок; 99%; молекулярная масса = 115,13 г/моль
ПируватSigma-AldrichP2256Пируват натрия (номер CAS 113-24-6), ≥ 99%; молекулярная масса = 110,04 г/моль
RotenoneSigma-AldrichR8875Rotetone (номер CAS 83-79-4); ≥ 95%, молекулярная масса 394,42 г/моль
СукцинатSigma-AldrichS 2378Сукцинат натрия двухосновной гексагидрат (номер CAS 6106-21-4); ≥ 99%
СахарозаMerck107,651,000Сахароза для использования в микробиологии (номер CAS 57-50-1)
ТауринSigma-AldrichT0625CAS номер 107-35-7

Ссылки

  1. Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
  2. Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardiomyopathy. Front Cell Dev Biol. 8, 624216(2021).
  3. Zhunina, O. A., et al. The role of mitochondrial dysfunction in vascular disease, tumorigenesis, and diabetes. Front Mol Biosci. 8, 671908(2021).
  4. Prasun, P. Mitochondrial dysfunction in metabolic syndrome. Biochim Biophys Acta. 1866 (10), 165838(2020).
  5. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A Step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochim Biophys Acta. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  6. Perier, C., Vila, M. Mitochondrial biology and Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (2), 009332(2012).
  7. DeMaagd, G., Philip, A. Parkinson's disease and its management. Pharmacy and Therapeutics. 40 (8), 504-532 (2015).
  8. Miyazaki, N., et al. PINK1-dependent and Parkin-independent mitophagy is involved in reprogramming of glycometabolism in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 625, 167-173 (2022).
  9. Kopin, I. J., Markey, S. P. MPTP toxicity: implications for research in Parkinson's disease. Annual Review of Neuroscience. 11, 81-96 (1988).
  10. Connolly, N. M. C., et al. Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 25 (3), 542-572 (2018).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
  12. Haynes, C. M., Fiorese, C. J., Lin, Y. -F. Evaluating and responding to mitochondrial dysfunction: The UPRmt and beyond. Trends Cell Mol Biol. 23 (7), 311-318 (2013).
  13. Long, Q., Huang, L., Huang, K., Yang, Q. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from mouse heart tissues using oroboros 2k-oxygraph. Methods Mol Biol. 1966, Clifton, N.J. 237-246 (2019).
  14. Scheiber, D., et al. High-resolution respirometry in human endomyocardial biopsies shows reduced ventricular oxidative capacity related to heart failure. Exp Mol Med. 51 (2), 1-10 (2019).
  15. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Chapter nine - use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  16. Demir, E. The potential use of Drosophila as an in vivo model organism for COVID-19-related research: a review. Turk J Biol. 45 (4), 559-569 (2021).
  17. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  18. McBride, S. M. J., Holloway, S. L., Jongens, T. A. Using Drosophila as a tool to identify pharmacological therapies for fragile X syndrome. Drug Discov Today Technol Technologies. 10 (1), e129-e136 (2013).
  19. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods (San Diego, Calif). 68 (1), 105-115 (2014).
  20. Bar, S., Prasad, M., Datta, R. Neuromuscular degeneration and locomotor deficit in a Drosophila model of mucopolysaccharidosis VII is attenuated by treatment with resveratrol). Dis Model Mech. 11 (11), (2018).
  21. Imai, Y. PINK1-Parkin signaling in Parkinson's disease: Lessons from Drosophila. Neurosci Res. 159, 40-46 (2020).
  22. Julienne, H., Buhl, E., Leslie, D. S., Hodge, J. J. L. Drosophila PINK1 and parkin loss-of-function mutants display a range of non-motor Parkinson's disease phenotypes. Neurobiol Dis. 104, 15-23 (2017).
  23. Biswas, S., Bagchi, A. Analysis of the structural dynamics of the mutations in the kinase domain of PINK1 protein associated with Parkinson's disease. Gene. 857, 147183(2023).
  24. Koh, H., Chung, J. PINK1 and Parkin to control mitochondria remodeling. Anat Cell Biol. 43 (3), 179-184 (2010).
  25. Zhu, M., Li, X., Tian, X., Wu, C. Mask loss-of-function rescues mitochondrial impairment and muscle degeneration of Drosophila pink1 and parkin mutants. Hum Mol Genet. 24 (11), 3272-3285 (2015).
  26. Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).
  27. Dytham, C. Choosing and using statistics: a biologist's guide. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. (2011).
  28. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  29. Gonçalves, D. F., et al. Caffeine improves mitochondrial function in PINK1B9-null mutant Drosophila melanogaster. J Bioenerg Biomembr. 55 (1), 1-13 (2023).
  30. Gonçalves, D. F., et al. Mitochondrial function and cellular energy maintenance during aging in a Drosophila melanogaster model of Parkinson disease. Mitochondrion. 65, 166-175 (2022).
  31. Janowska, J. I., et al. Mitochondrial respiratory chain complex I dysfunction induced by N-methyl carbamate ex vivo can be alleviated with a cell-permeable succinate prodrug. Toxicol In Vitro. 65, 104794(2020).
  32. Ngo, D. T. M., et al. Oxidative modifications of mitochondrial complex II are associated with insulin resistance of visceral fat in obesity. Physiol Endocrinol Metab. 316 (2), E168-E177 (2019).
  33. Stroud, D. A., et al. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Nature. 538 (7623), 123-126 (2016).
  34. Senyilmaz, D., et al. Regulation of mitochondrial morphology and function by stearoylation of TFR1. Nature. 525 (7567), 124-128 (2015).
  35. Poddighe, S., et al. Mucuna pruriens (Velvet bean) rescues motor, olfactory, mitochondrial and synaptic impairment in PINK1B9 Drosophila melanogaster genetic model of Parkinson's disease. PloS One. 9 (10), e110802(2014).
  36. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 810, 25-58 (2012).
  37. Winer, L. S. P., Wu, M. Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate. PloS One. 9 (10), e109916(2014).
  38. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  39. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol. Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).
  40. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  41. Bingol, B., Sheng, M. Mechanisms of mitophagy: PINK1, Parkin, USP30 and beyond. Free Radic Biol Med. 100, 210-222 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PINK1
Анализ митохондриальной функции у PINK1B9-нулевого мутанта Drosophila melanogaster с использованием респирометрии высокого разрешения
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.