Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия для определения структуры амилоида без меток

Краткое содержание

В данной работе описывается, как поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия может быть применена для характеристики локальной организации в безметочных амилоидных суперструктурах-сферулитах. В нем также описывается, как подготовить и измерить образец, собрать необходимую установку и проанализировать данные для получения информации о локальной организации амилоидных фибрилл.

Аннотация

По сравнению со своим однофотонным аналогом, двухфотонное возбуждение выгодно для экспериментов по биовизуализации из-за его меньшей фототоксичности, более глубокого проникновения в ткани, эффективной работы в плотно упакованных системах и уменьшенной угловой фотоселекции флуорофоров. Таким образом, внедрение поляризационного анализа в двухфотонную флуоресцентную микроскопию (2ПФМ) обеспечивает более точное определение молекулярной организации в образце по сравнению со стандартными методами визуализации, основанными на линейно-оптических процессах. В данной работе мы сосредоточимся на поляризационно-чувствительном 2PFM (ps-2PFM) и его применении при определении молекулярного упорядочения в сложных биоструктурах-амилоидных сферулитах. Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или Паркинсона, часто диагностируются путем обнаружения амилоидно-белковых агрегатов, образующихся из-за нарушенного процесса неправильного сворачивания белка. Изучение их структуры приводит к лучшему пониманию пути их создания и, следовательно, к разработке более чувствительных методов диагностики. В данной работе представлен ps-2PFM, адаптированный для определения локального порядка фибрилл внутри сферолитов инсулина крупного рогатого скота и сферических амилоидогенных белковых агрегатов. Более того, мы доказываем, что предложенная методика может разрешить трехмерную организацию фибрилл внутри сферулита.

Введение

За последние десятилетия, несмотря на значительное развитие многочисленных методов флуоресцентной микроскопии для биовизуализации белков и их агрегатов¹, лишь немногие из них были использованы для разрешения их локального упорядочения в образце ^2,3. Методом флуоресцентной пожизненной визуализационной микроскопии⁴ изучена внутренняя структурная гетерогенность амилоидных суперструктур-сферолитов. Кроме того, количественное определение локального упорядочения внутри сложных и плотно упакованных биоструктур, таких как сферолиты, может быть решено с помощью поляризационно-чувствительных методов³. Однако стандартные методы флуоресценции с проникновением в поверхностные ткани ограничены, поскольку использование длин волн УФ-ВИД для возбуждения флуорофоров in vivo приводит к высокому^{рассеянию света} в тканях. Кроме того, такая визуализация часто требует разработки и привязки специфических флуоресцентных зондов к целевой биомолекуле, тем самым увеличивая стоимость и объем работы, необходимой для выполнения визуализации.

Недавно, для решения этих проблем, наша команда адаптировала поляризационно-чувствительную двухфотонную возбужденную флуоресцентную микроскопию (ps-2PFM) для безметочной визуализации биологических структур ^6,7. Ps-2PFM позволяет измерять зависимость интенсивности двухфотонной флуоресценции от направления линейной поляризации пучка возбуждения и анализировать поляризацию излучаемой флуоресценции⁸. Реализация данной методики требует дополнения стандартного тракта возбуждения многофотонной установки микроскопа (рис. 1) полуволновой пластиной для управления плоскостью поляризации света. Затем из сигналов, собранных двумя лавинными фотодами, создаются полярные графики, изображающие зависимость интенсивности двухфотонной возбужденной флуоресценции от поляризации возбуждающего лазерного пучка, собирая таким образом две, взаимно перпендикулярные составляющие поляризации флуоресценции.

Последним этапом является процесс анализа данных с учетом влияния оптических элементов, таких как дихроичные зеркала или объектив с высокой числовой апертурой, на поляризацию. Из-за природы двухфотонного процесса этот метод обеспечивает как уменьшенный угловой фотоотбор, так и повышенное осевое разрешение, так как двухфотонное возбуждение флуорофоров вне фокальной плоскости вероятностно ограничено. Также было доказано, что аналогичные методы могут быть успешно реализованы для визуализации in vivo зондов ближнего инфракрасного диапазона (NIR) для визуализации глубоких тканей⁹. Ранее Ps-2PFM применялся для изображения флуорофоров в клеточных мембранах¹⁰ и ДНК^11,12, а также в качестве нестандартных флуоресцентных маркеров биологических систем, таких как наночастицы золота¹³. Однако во всех этих примерах информация об организации биомолекул была получена опосредованно и требовала заранее определенной взаимной ориентации между флуорофором и биомолекулой.

В одной из наших недавних работ мы показали, что ps-2PFM может быть успешно применен для определения локальной поляризации автофлуоресценции амилоидных суперструктур и флуоресценции тиофлавина Т, амилоид-специфического красителя, связанного с амилоидными фибриллами в сферулитах⁶. Кроме того, в другом исследовании мы доказали, что ps-2PFM может быть использован для определения ориентации амилоидных фибрилл внутри амилоидных сферолитов в субмикронном режиме, что было подтверждено путем корреляции с изображениями просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)⁷. Достижение этого результата стало возможным благодаря i) собственной автофлуоресценции сферолитов-амилоидов при возбуждении одним или двумя фотонами проявлять собственную автофлуоресценцию с максимумами излучения, расположенными в диапазоне от 450 до 500 нм, и сечениями поглощения двух фотонов, сопоставимыми со стандартными флуоресцентными красителями¹⁴, ii) математическими моделями, введенными ранее для описания того, как ps-2PEF красителей, мечущих биологические мембраны и структуры ДНК, могут быть применены для Флуоресценция проявляется сферолитами и связанными с ними красителями ^8,11,15. Таким образом, прежде чем приступить к анализу, мы настоятельно рекомендуем ознакомиться с необходимой теорией, описанной как в основном тексте, так и в вспомогательной информации нашей первой статьи по^{этой теме6}. Здесь мы представляем протокол применения метода ps-2PFM для структурной характеристики амилоида бычьих инсулиновых сферолитов без меток.

Протокол

1. Подготовка предметных стекол микроскопа с полностью выращенными сферулитами

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе. Все растворы готовили на деионизированной воде (18,2 МОм·см при 25 °С), полученной из системы очистки воды.

1. Инкубируют амилоидные сферолиты на основе протокола, описанного Krebs et al¹⁶. с некоторыми модификациями, как описано ниже.
   1. Взвесьте 10 мг инсулинового порошка в пробирке объемом 1,5 мл.
   2. Растворяют порошок 1 мл аликвоты деионизированного раствора H₂O/HCl (рН 1,5).
   3. Заклейте образец лентой и поместите его в термомиксер для инкубации в течение 24 ч при 70 °C (0 об/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения визуализации амилоидов в их нативной (т.е. гидратированной) среде и предотвращения деформации образца из-за обезвоживания необходимо подготовить предметные стекла микроскопа в соответствии со следующим описанием (схема приведена на рисунке 2).
2. Тщательно промойте предметное стекло микроскопа водой.
3. Окуните предметные стекла в метанол и дайте им высохнуть в условиях окружающей среды на беспыльной салфетке.
4. Берут из пробирки с автоматической пипеткой 100 мкл аликвоту раствора сферолита (шаг 1.1.2) и добавляют в лунку, расположенную в центральной области предметного стекла микроскопа.
5. Накройте раствор покровным покрывалом, избегая образования пузырьков воздуха.
6. Нанесите крепление по краям покровного стекла на предметное стекло с помощью автоматической пипетки для запечатывания нативного раствора сферолитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно наносить скользящее крепление как на покровный щиток, так и на поверхности скольжения. Делайте это под дымящимся колпаком из-за токсичности летучего растворителя (ксилола). Смотрите врезку на рисунке 2.
7. Оставьте образец микроскопа при комнатных условиях, чтобы крепление затвердело.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс затвердевания зависит от температуры и влажности, но должен быть завершен в течение 12 часов.
8. Проверьте правильность образования сферолитов инсулина с помощью поляризационного оптического микроскопа (ПОМ) со скрещенными поляризаторами. Просканируйте образец в поисках характерного узора из светлых областей, называемых мальтийским крестом, как показано на рисунке 3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Амилоидные сферолиты можно определить как сферические надструктуры, характеризующиеся гетерогенной морфологией со структурой ядро-оболочка. В частности, они состоят из аморфного ядра и радиально растущих амилоидных фибрилл¹⁶. Из-за анизотропного характера сферолитовых структур они могут отчетливо взаимодействовать с поляризованным светом (например, за счет преломления) и изменять свою фазу, что можно легко наблюдать при ПОМ со скрещенными поляризаторами. Этот метод был использован для изучения только полностью развитых сферолитов, характеризующихся модельным паттерном мальтийского креста. Следовательно, агрегаты или структурно деформированные сферолиты были исключены из дальнейших исследований.

2. Построение и выравнивание системы

ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое изображение поляризационно-чувствительного двухфотонного микроскопа можно найти на рисунке 1.

1. Установить фемтосекундный лазер с перестройкой длины волны на выходе в диапазоне 690-1080 нм, например, работающий на лазере Ti:Sapphire с синхронизацией мод с импульсами ~100 фс и частотой повторения 80 МГц.
2. Добавьте полуволновую пластину, установленную на вращающемся столике, в тракт возбуждения установки для управления поляризацией падающего света в плоскости образца XY-микроскопа.
3. Установите дихроичное зеркало, чтобы отсечь луч возбуждения от детектирующей оптики.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптические характеристики дихроичного зеркала должны позволять отражать пучок возбуждения (к образцу) в ближнем ИК-диапазоне длин волн и быть одновременно прозрачными для диапазона длин волн, соответствующего излучению от образцов.
4. Установите пьезоэлектрический сканирующий столик для растрового сканирования в плоскости XY для выбранной Z.
5. Установите иммерсионный объектив с высоким значением NA, например, апохроматический объектив для погружения в масло 100x/1,4 NA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку вся установка работает в режиме эпифлуоресценции, падающий и излучаемый сигналы проходят мимо одной и той же цели.
6. На пути излучения добавьте поляризационный светоделитель, который расщепляет двухфотонное возбужденное излучение на две ортогонально поляризованные составляющие (I_X и_{I Y})
7. Установите два лавинных фотодиода со счетом фотонов (APD) в конфигурации, позволяющей им собирать свет, передаваемый и отраженный с помощью светоделителя соответственно (рис. 1).
8. Установите на тракте возбуждения и излучения системы правильные фильтры отсечки, зависящие от длины волны, например, длиннопроходный фильтр 800 нм непосредственно в оптическом тракте возбуждения и короткочастотный фильтр 700 в тракте излучения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте спектры излучения сферолита, чтобы исключить любой потенциальный вклад от генерации второй гармоники (ГВГ) или лазерного излучения с помощью правильных эмиссионных фильтров. Стоит также отметить, что эта система также должна позволять измерять чувствительный к поляризации ГВГ, что может быть использовано для определения порядка биомолекул в образцах. Однако анализ данных сигнала ГВГ отличается от флуоресценции, которая более подробно была описана Aït-Belkacem et ^al.17.
9. Выровняйте всю систему (используя режим юстировки, встроенный во многие лазеры) до тех пор, пока не будут собраны сигналы одинаковой интенсивности с помощью обоих фотодиодов.
10. Проверьте, имеет ли луч возбуждения, сфокусированный объективом с высоким значением NA и изображенный на камере, концентрическую круглую форму, как показано на рисунке 4A.
11. Отрегулируйте время сканирования и соответствующую мощность, чтобы свести к минимуму повреждения, вызванные падением лазера на образец. Пример точечного горения представлен на рисунке 4Б. Измерьте номинальную мощность с помощью цифрового портативного измерителя мощности, подключенного к датчику мощности фотодиода, расположенному на входе в корпус микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биологические образцы могут быть легко сожжены из-за лазерной подсветки. В этом случае диапазон мощности 100 -900 мкВт (в фокусной точке объектива) является отличным компромиссом между стабильностью образца и интенсивным излучением.
12. Перед измерением образца проверяют качество юстировки оптики с изотропным эталонным образцом (например, флуоресцеином, воплощенным в аморфном полимере). Чтобы выполнить калибровочную проверку, следуйте процедуре, описанной в разделе 3, используя изотропный эталон вместо амилоидного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При условии, что установка микроскопии идеально приспособлена для образца с изотропными свойствами, обе составляющие излучения 2P (I_X и_{I Y}), обнаруженные с помощью двух APD, должны характеризоваться одинаковой интенсивностью (рис. 4C).

3. Измерение сферолитов бычьего инсулина

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения всех описанных измерений ps-2PF использовалось написанное вручную программное обеспечение, которое контролирует положение пьезоэлектрического столика и полуволновой пластины и собирает сигнал с обоих фотодиодов, позволяя строить графики XY (растровые сканы) из выбранных областей на предметных стеклах микроскопа, а также полярные графики по конкретным координатам образца. В протокол также были добавлены дополнительные примечания, которые позволят пользователям выполнять измерения без него, поскольку и пьезостоликом, и вращательным каскадом, используемым для вращения полуволновой пластины, можно управлять с помощью собственных контроллеров или соответствующего программного обеспечения. Тем не менее, настоятельно рекомендуется написать алгоритм, сочетающий угол поворота полуволновой пластины с интенсивностью 2PEF, собранной обоими фотодиодами, поскольку эта корреляция (полярные графики) имеет решающее значение для правильного анализа данных, приводящих к получению структурной информации.

1. Установите образец со сферолитами на пьезоэлектрический столик (обездвижьте предметное стекло скотчем). Убедитесь, что он установлен таким образом, чтобы тонкая стеклянная сторона (защитное стекло) была обращена к объективу, так как объективы с большим числом характеризуются относительно коротким рабочим расстоянием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании масляной иммерсии перед установкой и фокусировкой образца на объектив следует нанести небольшую каплю минерального масла.
2. Изменяя положения XY и Z с помощью ручек микроскопа, сфокусируйте объектив на одном из сферолитов, найденных в растворе, но имейте в виду, что, поскольку диаметры сферолитов обычно находятся в диапазоне десятков мкм, фокусируйтесь в центральной области всей структуры. Обратите внимание на черные и белые ореолы вокруг конкретного сферолита как признаки недостаточного и верхнего фокуса соответственно. Отрегулируйте ось "Z" так, чтобы она находилась между этими крайностями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно найти изолированный образец без структурных дефектов. Очень маленькие сферолиты могут дрейфовать из-за материального напряжения, создаваемого объективом, в то время как самые большие структуры, вероятно, агрегированы или сильно искажены.
3. Центрируем сферулит в поле зрения наблюдаемой микроскопической плоскости и определяем размер развертки XY, смотря, сколько шагов пьезостадии в направлениях X и Y (отображается на контроллере пьезосцены или в его программном обеспечении) необходимо для покрытия площади всей конструкции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется настраивать систему таким образом, чтобы начало развертки XY находилось возле одного из углов сферолита и совпадало с нулевым положением столика (X и Y = 0)
4. Настройте следующие параметры сканирования:
   1. Отрегулируйте поляризацию пучка возбуждения и поверните полуволновую пластину, чтобы получить поляризацию, соответствующую осям «X» и «Y» плоскости образца микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать, измерив полярные графики изотропной флуоресцентной среды, такой как флуоресцеин. Для таких материалов максимальная интенсивность флуоресценции параллельна поляризации пучка возбуждения; таким образом, вращение полуволновой пластинки регулирует поляризацию с осями X и Y на плоскости наблюдения, также обозначаемыми осями X и Y на полярных графиках, как на рисунке 4C. Полные полярные графики можно измерить, собрав измеренную интенсивность 2PEF на обоих фотодиодах для поворота полуволновой пластины на 180° (вращение поляризации света возбуждения на 360°) и соотнеся интенсивность с углом поляризации света возбуждения. Это можно сделать вручную, измерив интенсивность излучения для каждого угла полуволновой пластины отдельно, а затем собрав его в полярный график в программном обеспечении для анализа данных или автоматически, используя специальное или самописное программное обеспечение.
   2. Настройте параметры пьезостадии: скорость сканирования, шаг и дальность, чтобы охватить площадь всего сферулита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон сканирования должен быть больше, чем диаметр сферолита, чтобы полностью обрамить всю надстройку в растровом сканировании. Низкая скорость и шаг сканирования позволяют пользователям получать изображения высокого качества; Однако это может привести к возгоранию образца. Поэтому необходим компромисс, зависящий от размера сферолита. Эти параметры не могут быть применены повсеместно. Примерные параметры, используемые на рисунке 5A: диапазон сканирования 45 x 45 мкм, шаг сканирования 1 мкм и скорость сканирования 2 мкм/с.
5. Откройте затвор, включите фотодиоды и соберите компоненты излучения 2P для каждого шага выбранной области сканирования — для пучка возбуждения, поляризованного соответственно осям X, а затем и Y. Примеры двухфотонного возбужденного автофлуоресцентного (2PAF) растрового сканирования сферолитов инсулина представлены на рисунке 5А.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение растровых сканов требует сопоставления координат пьезокаскада с собранными компонентами излучения, что может быть сделано вручную, путем измерения интенсивности в каждой отдельной точке выбранной области, а затем сборки ее в 2D-матрицу, или автоматически, с помощью самописного программного обеспечения. Растровое сканирование может быть представлено в виде суммирования и интенсивности компонентов излучения или отдельно для конкретного компонента излучения. Поскольку они сильно зависят от структуры, структурные искажения внутри сферолитов легко видны. Однако из-за движения предметного столика микроскопа некоторые образцы могут уходить из поля зрения. Поэтому изображения необходимо проверять на наличие артефактов. Необходимо проверить положение сферолита до и после сканирования.
6. Чтобы выполнить полный поляризационный анализ из определенной точки на образце, выключите пучок возбуждения.
7. Затем подбирают конкретные координаты пьезостадии, соответствующие выбранному месту на сферолите, где требуется информация об ориентации молекул с разрешением менее мкм.
8. Отрегулируйте пьезоэлектрический столик так, чтобы поле зрения центрировалось в указанной точке (X, Y).
9. Включите луч возбуждения и выполните полный (360°) поляризационный анализ и излучение, включив вращение полуволновой пластины (вращение на 180°). Представьте 2PF Ix и Iy компоненты в виде полярного графа (как показано на рисунке 5B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно повторить в разных местах выборки, чтобы собрать достаточное количество данных.

4. Определение локального порядка фибрилл внутри сферолитов инсулина крупного рогатого скота

ПРИМЕЧАНИЕ: Все численные расчеты, связанные с анализом данных, выполнялись с использованием языка программирования Python и на основе функций, доступных в библиотеках NumPy и SciPy. Для построения графика данных требуется библиотека Matplotlib. Все расчеты основаны на формулах, представленных в сопроводительной информации в одной из работ Obstarczyk et ^al.6.

1. Моделирование интенсивности двухфотонной флуоресценции, возбуждаемой при заданном распределении молекул с выбранным направлением поляризации падающего света (обозначается как α)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Представленные формулы основаны на предположении о параллельных дипольных моментах поглощения и излучения флуорофора. Обсуждение других случаев (например, различные направления дипольных моментов поглощения и излучения, перенос энергии между флуорофорами) см. в статье Le Floc'h et al⁸.
   1. Найдите параметры, учитывающие изменение электрического поля поляризационными эффектами смешения и деполяризации, вызванными дихроичным зеркалом, установленным в установке:
      1. γ представляет собой амплитудный коэффициент между отражательной способностью дихроичного зеркала и поляризованным светом.
      2. δ представляет собой фазовый сдвиг (эллиптизм) между поляризованным и поляризованным светом.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное определение этих двух параметров имеет решающее значение для успешного определения структурных характеристик из-за их сильного влияния на форму измеренных полярных графиков ^11,18. В случае представленной системы оба параметра были определены при эллипсометрических измерениях дихроичного зеркала, применяемого в системе.
   2. Рассчитайте векторы падающего электрического поля, распространяющиеся по осям X и Y каждого угла, измеренного во время измерения ps-TPFM, используя уравнения (1-5).
      (1)
      (2) См.
      (3) См.
      (4) См.
      (5) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ Если интенсивность измеряется на всех 360° с шагом 1°, рассчитайте векторы электрического поля для всех 360°. Все углы должны быть в радианах. ρ параметр связан с оптической частотой ω моделируемого электрического поля (ρ=ω·t) и используется интегрированным от 0 до 2π при расчете векторов падающего электрического поля, распространяющихся по осям X и Y для каждого угла , α измерен при измерении ps-TPFM.
   3. Определим функции для переходных дипольных моментов в направлениях трех осей декартовой системы по уравнениям (6-8):
      (6) См.
      (7)
      (8) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: φ - угол ориентации длинной оси амилоидной фибриллы в рамке образца XY. Углы θ и φ — полярные и азимутальные углы, используемые для определения ориентации переходного дипольного момента флуорофора.
   4. Используйте функции, определенные в шаге 4.1.3. определить функции для J_x (Φ,θ,φ) и J_Y(Φ,θ,φ), которые учитывают вклад фокусировки света с объективом с высокой числовой апертурой в детектирование поляризации флуоресценции в направлениях X и Y с помощью уравнений (9, 10).
      (9) См.
      (10) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Факторы K₁, K₂, K₃ связаны с объективом микроскопа, используемым при измерении ps-TPFM. В этих экспериментах использовался апохроматический масляный иммерсионный объектив 100x/1,4 NA с коэффициентами К1, К2, К3 2,945, 0,069 и 1,016 соответственно.
   5. Определим функцию для f(Ω), которая представляет собой молекулярное угловое распределение, зависящее от половины апертуры конуса флуорофора Ψ с переменной толщиной ΔΨ; Используйте уравнение (11). Графическое представление всех трех углов относительно амилоидной фибриллы представлено на рисунке 6.
      (11) См.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны при написании экспоненты - степень 2 работает с аргументом функции, а не со всей функцией!
   6. Определите все коэффициенты f_WWIJKL , как показано в уравнениях (12-21).
      (12) См.
      (13)
      (14) См.
      (15) См.
      (16)
      (17)
      (18)
      (19)
      (20) См.
      (21) См.
   7. Рассчитайте интенсивности двухфотонной возбужденной флуоресценции и для каждого измеренного угла (аналогично пункту 4.1.2) с помощью уравнений (22, 23).
      = (22)
      = (23)
   8. Проверьте, правильно ли работает моделирование, используя следующие значения переменных (размещены в легенде на рисунке 7) и сравните полученные результаты с рисунком 7A-C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все градусы должны быть записаны в радианах.
2. Подгонка смоделированных интенсивностей в интенсивность автофлуоресценции с двухфотонным возбуждением сферолитов бычьего инсулина, собранных во время измерений ps-2PFM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение структуры сферолита на основе измерений ps-2PFM требует использования уравнений, записанных в протоколе, для моделирования теоретической интенсивности двухфотонной возбужденной флуоресценции и аппроксимации всех параметров, связанных с упорядочением молекулярного флуорофора. Для этого требуется многократное перебор различных значений Φ – угла, описывающего вращение фибриллы в образце XY-микроскопа, и ΔΨ – аберраций конического распределения эмиссионного диполя Ψ из-за вращения молекул в нитях накаливания для фиксированного Ψ до достижения максимально возможного коэффициента^R2 между нормированной интенсивностью двухфотонного сигнала возбужденной флуоресценции, собранной во время измерения, и нормированными интенсивностями, смоделированными в соответствии с Шаг 4.1 протокола.
   1. Определите полуугол Ψ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сферолитов бычьего инсулина она должна быть равна Ψ = 29°⁶.
   2. Рабочий процесс примерки:
      1. Выберите значение Φ от 0° до 180° (на рисунке 8A и 8B Φ = 16° и 127° соответственно).
      2. Выберите значение ΔΨ от 0° до 90° (на рисунке 8A,B, ΔΨ = 24° и 1° соответственно).
      3. Вычислите (уравнение 22) и (уравнение 23) для всего измеренного диапазона углов θ , используя выбранные значения Φ и ΔΨ.
      4. Сравните интенсивности, рассчитанные во время моделирования (обе нормированы до максимального значения
      5. Вычислить ) с нормированными интенсивностями
      6. Рассчитать и (оба нормированы до максимального значения ), измеренные при измерении ps-2PFM.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В представленных экспериментах коэффициенты корреляции произведения и момента Пирсона рассчитывались с помощью функции "corrcoef" из библиотеки NumPy Python.
   3. В конце выбираем значения Φ и ΔΨ , приводящие к наибольшим коэффициентам корреляции и сходимости между моделируемыми интенсивностями и измеренным сигналом, аналогично тому, что показано на рисунке 8.

Результаты

Представленный протокол содержит пошаговое руководство по подготовке амилоидных суперструктур для испытаний с помощью ps-2PFM, построению микроскопической системы и измерениям соответствующего образца. Тем не менее, перед окончательным набором измерений необходимо правильно выровнять APD с изотропным эталоном, что должно привести к сбору симметричного сигнала одинаковой формы и интенсивности на обоих детекторах (рис. 4C). Даже минимальные различия между интенсивностями, измеренными на детект...

Обсуждение

Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия является ценным инструментом для изучения локального упорядочения фибрилл внутри амилоидных суперструктур, требуя лишь небольших модификаций стандартной многофотонной установки. Поскольку он работает с нелинейно-оптическими явлениями, по сравнению с методами однофотонной флуоресцентной микроскопии может быть достигнут меньший угловой фотоотбор и повышенное осевое разрешение. Кроме того, это приводит к меньшему рассеянию света, меньшей фототоксичности и более глубоком...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<>Пробоподготовка
Покровные стекла, 24 x 24 мм	Chemland	04-298.202.04
Крепление DPX для гистологии	Sigma-Aldrich	6522	Крепление для скольжения
Eppendorf Safe-Lock пробирки, 1,5 мл, полипропилен	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer  C	Eppendorf		Используется для инкубации сферулита
HLP 5UV Система очистки воды	Hydrolab		Источник диионизированной воды, используемый при пробоподготовке
Соляная кислота (≥ 37%, APHA ≤ 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Порошок инсулина из поджелудочной железы крупного рогатого скота (≥ 25 единиц/мг (ВЭЖХ))	Sigma-Aldrich	I5500
Метанол (класс ВЭЖХ)	Sigma-Aldrich	270474
Предметные стекла для микроскопа с вогнутой поверхностью, 76 x 26 x 1 мм	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Поляризованный оптический микроскоп	Olympus
Лента с резьбой из ПТФЭ, 12 мм x 12 мм x 0,1 мм, 60 г<суп>2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø 25,0 мм длинночастотный фильтр	Thorlabs
FESH0700 - & Oslash; 25,0 мм Короткопроходной фильтр	Thorlabs
IDQ100 для подсчета фотонов лавинных фотодиодов	ID Quantique
Многофотонный короткочастотный эмиссионный фильтр 720 нм	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 нм	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
Piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Поляризационный светоделитель	Thorlabs
S130C - тонкий датчик мощности фотодиода, Si, 400 - 1100 нм, 500 мВт	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Версия 18.0.1f2
		Matplotlib	Версия 3.3.2
Библиотека			Версия 1.19.2
Библиотека			Версия 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Версия 4.1.5