Высокопроизводительные оптогенетические эксперименты на дрожжах с использованием автоматизированной платформы Lustro

Summary

В этом протоколе описаны шаги по использованию автоматизированной платформы Lustro для выполнения высокопроизводительной характеристики оптогенетических систем в дрожжах.

Abstract

Оптогенетика обеспечивает точный контроль над поведением клеток, используя генетически закодированные светочувствительные белки. Однако оптимизация этих систем для достижения желаемой функциональности часто требует нескольких циклов проектирования-сборки-тестирования, что может быть трудоемким и трудоемким. Чтобы решить эту проблему, мы разработали Lustro, платформу, которая сочетает в себе световую стимуляцию с лабораторной автоматизацией, обеспечивая эффективный высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем.

Lustro использует автоматизированное рабочее место, оснащенное устройством освещения, встряхивающим устройством и считывателем номерных знаков. Используя роботизированную руку, Lustro автоматизирует перемещение микролунки между этими устройствами, позволяя стимулировать оптогенетические штаммы и измерять их реакцию. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по использованию Lustro для характеристики оптогенетических систем для контроля экспрессии генов у почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Протокол охватывает настройку компонентов Lustro, включая интеграцию осветительного устройства с автоматизированным рабочим местом. Он также содержит подробные инструкции по программированию осветительного устройства, считывателя пластин и робота, обеспечивая бесперебойную работу и сбор данных на протяжении всего экспериментального процесса.

Introduction

Оптогенетика является мощным методом, который использует светочувствительные белки для управления поведением клеток с высокой точностью ^1,2,3. Однако прототипирование оптогенетических конструкций и определение оптимальных условий освещения может занимать много времени, что затрудняет оптимизацию оптогенетических систем ^4,5. Высокопроизводительные методы быстрого скрининга и определения характеристик активности оптогенетических систем могут ускорить цикл «проектирование-строительство-тестирование» для прототипирования конструкций и изучения их функций.

Платформа Lustro была разработана как метод автоматизации лаборатории, предназначенный для высокопроизводительного скрининга и характеризации оптогенетических систем. Он объединяет считыватель микропланшетов, устройство освещения и устройство встряхивания с автоматизированной рабочей станцией⁶. Lustro сочетает в себе автоматизированное культивирование и световую стимуляцию клеток в микролуночных планшетах (рис. 1 и дополнительный рис. 1), что позволяет проводить быстрый скрининг и сравнение различных оптогенетических систем. Платформа Lustro обладает широкими возможностями адаптации и может быть универсализирована для работы с другими роботами автоматизации лабораторий, устройствами освещения, считывателями пластин, типами клеток и оптогенетическими системами, в том числе реагирующими на различные длины волн света.

Этот протокол демонстрирует настройку и использование Lustro для характеристики оптогенетической системы. Оптогенетический контроль расщепленных транскрипционных факторов у дрожжей используется в качестве примера системы, чтобы проиллюстрировать функцию и полезность платформы путем исследования взаимосвязи между световыми входами и экспрессией флуоресцентного репортерного гена mScarlet-I⁷. Следуя этому протоколу, исследователи могут оптимизировать оптогенетические системы и ускорить открытие новых стратегий динамического управления биологическими системами.

Protocol

Штаммы дрожжей, использованные в этом исследовании, описаны в таблице материалов. Эти штаммы демонстрируют устойчивый рост в диапазоне температур от 22 °C до 30 °C и могут культивироваться в различных стандартных дрожжевых средах.

1. Настройка автоматизированного рабочего места

1. Оснастите автоматизированную рабочую станцию роботизированным захватом (RGA, см. таблицу материалов), способным перемещать планшеты с микролунками (рис. 1).
2. Установите встряхиватель микропластинчатого нагревателя (см. Таблицу материалов) в автоматизированное рабочее место (Рисунок 1(1)) с механизмом автоматической блокировки пластины, обеспечивающим доступ RGA.
3. Расположите считыватель микропланшетов рядом с автоматизированной рабочей станцией (рис. 1(2)), обеспечив доступ RGA.
4. Установите устройство подсветки на микропластинах (рис. 1(3)), обеспечивающее удобный доступ к RGA. В качестве примера можно привести optoPlate⁸ (используемый в данном исследовании) или LITOS⁹ (см. таблицу материалов).

2. Подготовка осветительного прибора

1. Сконструировать и откалибровать оптопластину (или альтернативное осветительное устройство) в соответствии с установленными методами 8,10,11.
2. Используйте адаптер на устройстве освещения, чтобы разрешить доступ RGA.
3. Запрограммируйте optoPlate с помощью ввода электронной таблицы¹⁰ или графического интерфейса¹². Выполните шаг 3, чтобы выполнить программы световой стимуляции.

3. Разработка программы световой стимуляции

1. Определите желаемые условия освещения для эксперимента.
2. Введите в электронную таблицу желаемые условия освещения, включая интенсивность света, время начала света, длину импульса, количество импульсов и длительность между импульсами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прошейте эту информацию на optoPlate, следуя инструкциям, приведенным в репозитории GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Помните, что планшет с образцом не будет подсвечиваться, пока он находится в считывателе микропланшетов или на шейкере нагревателя. Продолжительность и частота этих событий могут потребовать оптимизации в соответствии с конкретными экспериментальными требованиями.
3. Учитывайте темные условия для каждого штамма, чтобы обеспечить надлежащие фоновые измерения.
4. Для первоначальных экспериментов по определению характеристик для оценки функциональности трансформатора используйте высокую интенсивность света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность света должна быть оптимизирована для более чувствительных экспериментов, так как чрезмерный свет может быть фототоксичным для дрожжей¹³.

4. Подготовка считывателя микропланшетов

1. Настройте считыватель микропланшетов для измерения желаемого количества интересующего вас количества перед проведением экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере считыватель микропланшетов был сконфигурирован для измерения флуоресценции от репортера, выраженной интересующей деформацией. Другие выходы, такие как люминесценция или оптическая плотность, могут быть использованы в зависимости от требований эксперимента.
2. Культивировать интересующий штамм (наряду с нефлуоресцентным контролем) в синтетической полной (SC) среде¹⁴ (или другой среде с низкой флуоресценцией) (см. таблицу материалов) до максимальной плотности клеток, подлежащей измерению. Перенесите культуры в микролунку со стеклянным дном и черными стенками (см. Таблицу материалов) и измерьте их, чтобы определить оптимальные настройки считывателя микропланшетов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте точные показания, правильно введя размеры пластины и измерив пластину снизу.
3. Обратитесь к базе данных флуоресцентных белков (например, fpbase.org), чтобы получить приблизительные спектры поглощения и излучения целевого флуоресцентного белка¹⁵.
4. Определите z-значение (расстояние между планшетом и считывателем), выполнив z-сканирование лунок, содержащих флуоресцентные и нефлуоресцентные деформации. Выберите z-значение, которое дает наибольшее отношение сигнал/шум.
5. Оптимизируйте спектры поглощения и излучения, проводя сканирование поглощения и излучения флуоресцентных и нефлуоресцентных штаммов для определения оптимального соотношения сигнал/шум.
6. Измерьте флуоресцентную деформацию при оптимальном уровне усиления, определив максимальное оптическое усиление, которое можно использовать без ошибки измерения переполнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптическое усиление должно быть установлено вручную в экспериментах с одной и той же деформацией, чтобы обеспечить согласованность результатов.
7. Подготовьте сценарий измерения (см. рис. 2) в программном обеспечении считывателя микропланшетов. Этот скрипт настраивает прибор для измерения оптической плотности культур и спектров флуоресценции любых флуоресцентных белков, подлежащих измерению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряйте оптическую плотность штаммов на длине волны 600 нм, если они не экспрессируют красные флуоресцентные белки. Для штаммов, экспрессирующих красные флуоресцентные белки, измеряют оптическую плотность при длине волны 700 нм, чтобы избежать смещения¹⁶.
8. Настройте сценарий измерения на поддержание внутренней температуры инкубации 30 °C во время измерений.
9. Настройте сценарий измерения для экспорта данных в электронную таблицу или файлы ASCII в соответствии с предпочтениями.

5. Программирование робота

1. Настройте определение рабочего стола в программном обеспечении автоматизированной рабочей станции на основе физического расположения носителей (например, нагревательных шейкеров, платформ для гнездования, осветительных приборов) и лабораторного оборудования (например, 96-луночной пластины) (см. Таблицу материалов). Создайте сценарий в программном обеспечении автоматизированной рабочей станции для выполнения световой индукции и измерений (рис. 3), выполнив следующие действия.
2. Отключите все внутренние источники освещения, чтобы предотвратить фоновую активацию оптогенетических систем.
3. Установите шейкер нагревателя на поддержание температуры 30 °C. Когда пластина не находится на шейкере нагревателя, она будет иметь температуру окружающей среды (22 °C).
4. Используйте циклы, таймер и переменную подсчета циклов, чтобы повторять шаги индуцирования и измерения клеток через равные промежутки времени.
5. Перед записью измерений встряхните планшет с образцом, чтобы обеспечить надлежащую подвеску всех клеток. Встряхивания в течение 60 с при 1000 об/мин с орбиталью 2 мм, как правило, достаточно для ресуспендирования клеток S288C S. cerevisiae и избежания систематической ошибки измерения.
6. Переместите планшет для образца в считыватель микропланшетов с помощью манипулятора робота и снимите крышку (если применимо), чтобы предотвратить смещение при измерении оптической плотности. Управляющее программное обеспечение автоматически снимет и установит крышку в указанное положение, если определение держателя считывателя микропланшетов установлено таким образом, чтобы крышки не допускались.
7. Выполните сценарий измерения считывателя микропланшетов, как описано в шаге 4.
8. Установите крышку на планшет для образца и переместите планшет к устройству освещения с помощью манипулятора робота.
9. Настройте скрипт так, чтобы он ждал, пока таймер не достигнет указанного интервала времени (например, 30 минут, умноженных на переменную подсчета циклов), а затем повторите весь цикл для желаемого количества итераций (например, 48 раз для 24-часового эксперимента).
10. Устраняйте потенциальные ошибки и обеспечьте надлежащее функционирование определений носителя и лабораторного оборудования, а также способность RGA точно поднимать и размещать пластину, многократно пропуская пустую пластину через цикл сценария.
11. Настройте пользовательские оповещения, чтобы уведомлять пользователя о любых изменениях состояния прибора или ошибках, которые могут возникнуть во время выполнения протокола.

6. Настройка планшета для образцов

1. Выращивайте штаммы дрожжей на пластинах с насыщенной средой, например, на агаре YPD¹⁷ (см. Таблицу материалов). Включите нефлуоресцентный (отрицательный) контроль.
2. Выберите колонии из планшетов и засейте их в 3 мл среды SC¹⁴ (или другой среды с низкой флуоресценцией, например, LFM¹⁸) в стеклянные пробирки для культивирования. Инкубируйте культуры в течение ночи при температуре 30 °C на роликовом барабане, держа их в темноте или в условиях невосприимчивого освещения (например, красный свет для систем, реагирующих на синий свет).
3. Измеряют оптическую плотность ночных культур, разбавляя 200 мкл каждой культуры в 1 мл среды SC и регистрируя оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD600) с помощью спектрофотометра или микропланшетного ридера.
4. Разбавляйте каждую ночную культуру до наружного диаметра₆₀₀ 0,1 в стеклянных пробирках для культивирования. Для более высокой производительности испытания деформации выполняйте автоматические разбавления в планшетах с микролунками.
5. Пипетку разбавляют разведенными культурами в 96-луночный планшет. Включите три скважины для каждого условия (т. е. три одинаковые скважины с одинаковой деформацией и состоянием освещенности), чтобы учесть технические различия. Включите лунки с пустыми средами и нефлуоресцентными ячейками в качестве негативного контроля для измерения фоновой флуоресценции и оптической плотности.
6. Перед началом эксперимента по индукции света инкубируйте планшет при температуре 30 °C при встряхивании в течение 5 часов. При необходимости отрегулируйте количество разведения и время инкубации для оптимизации для конкретных штаммов и условий эксперимента.

7. Проведение эксперимента

1. Поместите пластину с образцом на шейкер нагревателя и запустите сценарий автоматизации, как описано в шаге 5.
2. Запустите программу световой стимуляции, как описано в шаге 3, после того, как будет записано первоначальное измерение на считывателе пластин.
3. Если рабочее место автоматики находится не в темном помещении, накройте его плотной шторой, чтобы избежать фонового освещения.

8. Анализ данных

1. Создайте карту электронной таблицы для эксперимента, отражающую компоновку 96-луночного планшета размером 8 x 12. Убедитесь, что карта содержит названия штаммов, измеряемых в одной сетке, и описания условий освещения, используемых в другой сетке.
2. Используйте скрипт Python или другой предпочтительный язык программирования для анализа экспортируемых данных. Импортируйте электронную таблицу карты в массив, связав названия деформаций и состояний с каждой лункой планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пример кода для анализа можно найти по адресу: https://github.com/mccleanlab/Lustro. В качестве альтернативы можно использовать приложение для анализа данных с различных считывателей пластин¹⁹.
3. Считывание данных из экспортированной таблицы эксперимента в другой массив.
4. Постройте графики значений оптической плотности и флуоресценции для каждого штамма и состояния с течением времени, как показано на рисунке 4.
5. Изучите графики оптической плотности, чтобы определить стадии экспоненциального роста или насыщения культур. Эта информация поможет выбрать подходящие моменты времени для сравнения измерений флуоресценции между штаммами или условиями, как показано на рисунке 5.

Results

На рисунке 4А показаны значения флуоресценции с течением времени для оптогенетического штамма, экспрессирующего флуоресцентный репортер, контролируемый светоиндуцируемым расщепленным транскрипционным фактором. Различные условия освещения, используемые в эксперименте, отражаются изменениями в рабочем цикле, который представляет собой процент времени, в течение которого свет включен. Общий уровень флуоресценции пропорционален скважности световой стимуляции. На рисунке 4B

Discussion

Протокол Lustro, представленный здесь, автоматизирует процессы культивирования, освещения и измерения, обеспечивая высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем⁶. Это достигается за счет интеграции осветительного устройства, считывателя микропланшетов и встряхивающего устройства в автоматизированную рабочую станцию. Этот протокол, в частности, демонстрирует полезность Lustro для скрининга различных оптогенетических конструкций, интегрированных в дрожжи S. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-луночная стеклянная нижняя пластина с   #1.5 защитным стеклом	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (нагреватель шейкера)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Рабочая станция	Tecan
LITOS (альтернативное устройство освещения)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (устройство освещения)	Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Роботизированный захватный манипулятор	Tecan
Spark (считыватель пластин)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (приложение для оповещения пользователя)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' гомология Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' гомология  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' гомология Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' гомология  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' гомология Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' гомология  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500