В данной статье мы представляем подробный протокол выделения и культивирования первичных волосковых клеток улитки у мышей. Первоначально орган корти препарировали из неонатальных (в возрасте 3-5 дней) мышиных улиток под микроскопом. Впоследствии клетки ферментативно переваривали в одноклеточную суспензию и идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции через несколько дней в культуре.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и культивирование первичных волосковых клеток улитки у новорожденных мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Волосковые клетки улитки являются сенсорными рецепторами слуховой системы. Эти клетки расположены в кортиевом органе, органе чувств, отвечающем за слух, в костном лабиринте внутреннего уха. Кохлеарные волосковые клетки состоят из двух анатомически и функционально различных типов: наружных и внутренних волосковых клеток. Повреждение любого из них приводит к потере слуха. Примечательно, что внутренние волосковые клетки не могут регенерировать, и их повреждение является необратимым. Следовательно, культивирование первичных волосковых клеток in vitro необходимо для изучения защитных или регенеративных эффектов волосковых клеток улитки. Это исследование было направлено на поиск метода выделения и культивирования волосковых клеток мышей.
После ручного удаления боковой стенки улитки слуховой эпителий тщательно отделяли от кохлеарного модиолы под микроскопом, инкубировали в смеси, состоящей из 0,25% трипсина-ЭДТА, в течение 10 мин при 37 °С и осторожно суспендировали в питательной среде с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр, фильтрат центрифугировали, а клетки культивировали в 24-луночных планшетах. Волосковые клетки были идентифицированы на основе их способности экспрессировать механотрансдукционный комплекс, миозин-VIIa, который участвует в двигательном напряжении, а также путем селективного мечения F-актина с помощью фаллоидина. Клетки достигали >90% слияния через 4 дня в культуре. Этот метод может улучшить наше понимание биологических характеристик культивируемых волосковых клеток in vitro и продемонстрировать эффективность культур кохлеарных волосковых клеток, создавая прочную методологическую основу для дальнейших слуховых исследований.
Введение
Волосковые клетки улитки играют важную роль в обнаружении звука и передаче сигнала к слуховому нерву. Волосковые клетки — это механистические клетки, которые функционируют как первичные сенсорные рецепторы и преобразуют звуковые колебания в электрические сигналы у позвоночных. Сенсорный эпителий внутреннего уха млекопитающих состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток и трех рядов наружных волосковых клеток. В разных основных участках мембраны волосковые клетки воспринимают звуки на разных частотах (от 20 до 2000 Гц)1. Функция наружных волосковых клеток заключается в активном механическом процессе усиления, который помогает тонко настроить внутреннее ухо млекопитающих, обеспечивая высокую чувствительность к звуку. Внутренние волосковые клетки отвечают за распознавание звуков. После ступенчатой деполяризации акустическая информация передается в мозг через слуховые нервные волокна2.
Потеря слуха может быть вызвана генетическими дефектами, старением, шумовой травмой или чрезмерным использованием ототоксических препаратов, которые представляют собой серьезную проблему для здоровья во всем мире 3,4. Потеря слуха в основном возникает в результате необратимого повреждения волосковых клеток5. Что касается потери слуха, вызванной шумом, то, несмотря на то, что исследователи достигли консенсуса по некоторым деталям ее этиологии, отсутствует всестороннее понимание многочисленных механизмов, лежащих в ее основе. Наружные волосковые клетки особенно уязвимы к акустическому передержанию6. Механочувствительные волосковые клетки улитки участвуют в возрастной тугоухости; Однако молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе дегенерации волосковых клеток, остаются неизвестными. Некоторые изменения в молекулярных процессах приводят к старению волосяных клеток, окислительному стрессу, реакции на повреждение ДНК, аутофагии и дисрегуляции экспрессии и транскрипции генов, связанных со специализацией волосяных клеток7.
Поскольку внутреннее ухо заключено в височную кость, глубоко в самой твердой кости тела, оно экспериментально недоступно, что создает проблему для исследований механизмов восстановления и регенерации волосковых клеток. Таким образом, создание культур in vitro для изучения функции волосковых клеток стало идеальным методом для исследования механизмов регенерации и повреждения внутреннего уха. Процедуры приготовления кохлеарных органотипических культур были описаны в более ранних работах 8,9,10. Исследователи по всему миру используют различные методы кохлеарной микродиссекции и подготовки поверхности. Несмотря на сохраняющиеся проблемы, различные системы первичных культивирования волосяных клеток были успешно созданы in vitro. Культуры кохлеарных органов содержат различные типы клеток, включая волосковые клетки, клетки Дейтера, клетки Хенсена, столбчатые клетки и волокна слухового нерва. Глубокое понимание изменений в волосковых клетках на клеточном и молекулярном уровнях после травмы позволит разработать более мощные исследовательские инструменты. Это исследование было направлено на демонстрацию шагов по изоляции кохлеарных органов от новорожденных мышей и ферментативному отделению обильных волосковых клеток для исследований in vitro. Природу культивируемых клеток подтверждали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были одобрены (No 2021-847) Комитетом по использованию животных и уходу за животными Сианьского университета Цзяотун.
1. Стерилизация и подготовка материала
- Стерилизуйте инструменты для препарирования с помощью паровой дезинфекции при высокой температуре и высоком давлении и высушите их в инкубаторе при температуре 50 °C в течение ночи.
- Заранее приготовьте 100 мл питательной среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10 мг/мл пенициллина/стрептомицина (добавьте 10 мл FBS и 10 мкл исходного раствора пенициллина к 90 мл модифицированной орлиной среды (EMEM)) Dulbecco и храните при 4 °C.
2. Рассечение и удаление височной кости для забора слухового эпителия
- Усыпить в общей сложности 10 новорожденных мышей (в возрасте от P3 до P5) путем обезглавливания на льду. При необходимости используйте альтернативную, этически одобренную методологию.
- Удерживая голову на месте, раскройте кожу головы по сагиттальному шву с помощью микроножниц, а затем отделите и зафиксируйте кожу головы с обеих сторон пальцами, как показано на рисунке 1А.
- Удалите мозг с помощью небольшого надкостничного лифта и разделите пополам базальный череп. Разрежьте череп ножницами и переверните вперед, чтобы открыть череп; Кончиком ножниц соскребите мозг и обнажите основание черепа.
- Обратите внимание на двусторонние височные кости у основания черепа (рис. 1С). С помощью ножниц разрежьте основание черепа по средней линии, соскребите кожу и удалите все ненужные кости (рис. 1D, D').
- Сохраните и перенесите височные кости в стерильные чашки Петри диаметром 35 мм, содержащие свежий сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) (Рисунок 1E).
- Используйте два щипца #5, чтобы удалить буллу и окружающие ткани из каменистой части височной кости (Рисунок 1E).
Примечание: На этой стадии костный лабиринт в височной кости мышей не будет полностью кальцинирован и будет легко рассечен с помощью щипцов. - Одной рукой придерживают щипцы, чтобы зафиксировать полукруглую часть височной кости, а другой рукой воткнуть нижнюю ножку щипцов в круглую оконную нишу, чтобы отделить латеральную кость улитки от преддверия. Осторожно удалите каменистую часть височной кости, не касаясь эпителия ОК. Затем осторожно отделяют и удаляют костный лабиринт улитки от базального конца до апикального конца (рис. 1F).
- Тщательно микроизолируют орган сенсорного эпителия Корти от модиолуса с помощью щипцов #5 (рис. 1G).
- Удерживают спиральную связку, осторожно отделяют ее от сосудистых стрий с помощью микрооперационных щипцов и переносят чистый слуховой эпителий в 3-миллиметровую стерильную культуральную чашку, содержащую HBSS, с помощью пипетки на 200 мкл (рис. 1H).
- Соберите 20 образцов у каждого животного и быстро перенесите их в стерильную чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую HBSS, для следующего этапа подготовки (рис. 1).
3. Ферментативная дезагрегация для получения слуховых волосковых клеток
- Переносят слуховой эпителий в 10 мл свежего ДМЭМ, содержащего 0,25% трипсина, и инкубируют при 37 °С в течение 12 мин.
- С помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл аккуратно отделите волосковые клетки от базальной пластинки и другие клетки под операционным микроскопом.
- Добавьте еще 10 мл питательной среды, чтобы ингибировать дезагрегацию.
- Взвешенные клетки в питательной среде фильтруют через фильтр 70 мкм, собирают фильтрат в чистую пробирку объемом 50 мл и центрифугируют при 300 × г в течение 5 мин.
- Ресуспендируйте волосковые клетки не менее чем в 5 мл питательной среды, осторожно пипетируя их вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 1000 мкл. Избегайте появления пузырей.
- Заранее положите покровный стебель на дно шестилуночной тарелки. Подсчитайте клетки и культивируйте их при плотности 106 клеток/мл в шестилуночных планшетах.
- Выращивают адгезивные клетки в 2 мл DMEM (содержащего 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37 °C и 5% CO2. Меняйте питательную среду каждый день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что использование этого протокола не приводит к получению чистых волосковых клеток. Основываясь на этом методе первичного культивирования клеток, мы рекомендуем использовать клетки d2 или d3 для дальнейших исследований, так как волосковые клетки могут составлять примерно 70% клеток в культуре и быть в хорошем состоянии.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Заготавливают культивируемые клетки от d1 до d6 (по одной лунке в день). Аспирируйте питательную среду и промойте клетки 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
- Снимите фиксатор и промойте ячейки в течение 3 x 3 мин с помощью PBS.
- Пермеабилизацию клеток PBS, содержащей 0,2% Triton X-100, в течение 10 мин при RT.
- Инкубируют пермеабилизированные клетки с блокирующим раствором, состоящим из 10% FBS, в PBS в течение 20 мин при RT.
- Окрасьте клетки моноклональным антителом против миозина (разведенным в соотношении 1:200 в PBS) при 4 °C в течение ночи.
- Промывают клетки 3 раза стерильным PBS и инкубируют их со вторичными антителами (Alexa Fluor 594 козий антикроличий MYO7A, разбавленный 1:500 в PBS) и флуоресцеин-меченным фаллоидином (Alexa Fluor 488, для определения клеточной структуры) в течение 2 ч при RT.
- Промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить вторичные антитела.
- Добавьте 1-2 капли монтажной среды с DAPI на предметные стекла, закрепите покровные стекла и поместите их под лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для получения фотографий клеток.
5. Статистический анализ
- Выполните двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом Тьюки post hoc для анализа изменений серых значений миозина-VIIa и фаллоидина с течением времени. Используйте метод буквенной маркировки для обозначения статистических различий.
- Выполните дополнительные односторонние тесты ANOVA с последующим тестированием по методу Тьюки, чтобы сравнить соотношение фаллоидин-положительных клеток между образцами клеток с 1-го по 6-й день и соотношение миозин-VII-положительных клеток в те же дни.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Следуя этому протоколу, мы засеяли изолированные клетки. Первичные семена волосковых клеток улитки считались успешными, если клетки не плавали в питательной среде и распространялись в течение 24 ч. Мы определили количество волосковых клеток после того, как они прилипли и распределились в плоские агрегаты на дне чашки. Через 1 сутки живые волосковые клетки плотно приклеивали ко дну чашки для культивирования, а неприлипшие клетки удаляли путем промывания ПБС. Как правило, количество клеток удваивается через 3 дня культивир...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
По сравнению с клеточной линией HEI-OC1 первичные культуры волосковых клеток более точно воспроизводили физиологическое состояние клеток in vivo. Таким образом, метод первичного культивирования слуховых клеток, основанный на выделении живых клеток из органов улитки и их немедленном культивировании, представляется ценным инструментом для обширных исследований слуховых систем. Определенные методы имеют решающее значение для успешной культуры. Во-первых, минимизация длительности отделения кортиевого органа от височной кости...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (NFSC 82101224 YG)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100 мм Чашка для клеточных культур BioLite | Thermo Fisher Scientific | 130182 | использование для культуры |
| 35 мм Чашка для клеточной культуры Nunc Thermo | Fisher Scientific | 150318 | использование для культуры |
| 6-луночный нёбо | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | использование для культуры |
| 70 & микро; m клеточные фильтры | BD Company | 352350 | использование для фильтра |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | иммунофлуоресцентное окрашивание |
| в день 3-5 неонатальная мышь | предоставлено Сианьским университетом Цзяотун | ||
| Дульбекко s Модифицированный Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | использование для культивирования |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | использование для культивирования |
| Щипцы | Dumont | 5# | использование для вскрытия |
| Leica анатомический микроскоп | Германия | S9i | использование для диссекции |
| Пенициллин/стрептомицин | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | использование для культивирования |
| кролика плилклонального к Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Ножницы | Belevor | 10cm/04.0524.10 | с использованием для вскрытия |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Трипсин | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | использование для культуры |
Ссылки
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385(2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665(2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170(2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342(2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046(2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119(2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
