Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод получения почечных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием условий суспензионного культивирования. Основной акцент в этом исследовании делается на определении начальной плотности клеток и концентрации агонистов WNT, что приносит пользу исследователям, заинтересованным в исследовании органоидов почек.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Получение почечных органоидов в суспензии из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Органоиды почек могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью различных подходов. Эти органоиды имеют большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и потенциального терапевтического применения. В данной статье представлена пошаговая процедура создания почечных органоидов из ИПСК, начиная от задней примитивной полосы (ПС) до промежуточной мезодермы (ИМ). Этот подход основан на среде APEL 2, которая представляет собой определенную среду, не содержащую компонентов животного происхождения. Он дополняется высокой концентрацией агониста WNT (CHIR99021) в течение 4 дней, затем фактором роста фибробластов 9 (FGF9)/гепарином и низкой концентрацией CHIR99021 в течение дополнительных 3 дней. Во время этого процесса особое внимание уделяется выбору оптимальной плотности клеток и концентрации CHIR99021 в начале ИПСК, поскольку эти факторы имеют решающее значение для успешной генерации органоидов почек. Важным аспектом этого протокола является суспензионная культура в низкоадгезивной пластине, позволяющая ИМ постепенно развиваться в нефроновые структуры, охватывающие клубочковые, проксимальные канальцевые и дистальные канальцевые структуры, представленные в визуально понятном формате. В целом, этот подробный протокол предлагает эффективную и специфическую технику получения почечных органоидов из различных ИПСК, обеспечивая успешные и стабильные результаты.
Введение
Почка играет важнейшую роль в поддержании физиологического гомеостаза в зависимости от ее функциональной единицы. Нефроны, которые выводят продукты жизнедеятельности, могут регулировать состав жидкостей организма. Хроническая болезнь почек (ХБП), вызванная наследственными мутациями или другими факторами высокого риска, в конечном итоге прогрессирует до терминальной стадии заболевания почек (ЭСКД)1,2. ЕСКД, по-видимому, обусловлен ограниченной способностью нефронов к регенерации. Таким образом, требуется заместительная почечная терапия. Направленная дифференцировка ИПСК человека позволяет генерировать in vitro специфические для пациента 3D-органоиды почек, которые могут быть использованы для изучения развития почек, моделирования специфических для пациента заболеваний и проведения скрининга нефротоксических препаратов 3,4.
Во время эмбрионального развития почки берут начало из промежуточной мезодермы (ИМ), которая дифференцируется от примитивной полосы (ПВ). Классический сигнальный путь WNT может индуцировать дополнительную дифференцировку ИМ при скоординированном участии FGF (FGF9, FGF20) и BMP (Bmp7 через JNK)5,6,7. Они продуцируют две важные клеточные популяции нефрических клеток-предшественников (NPC): почки мочеточника (UB) и метанефрическую мезенхиму (MM), образуя собирательные протоки и нефрон, соответственно 8,9. Каждый нефрон состоит из клубочковых и трубчатых сегментов, таких как проксимальные и дистальные канальцы, а также петли Генле10,11. Согласно вышеупомянутой теории, опубликованные в настоящее время протоколы имитируют сигнальные каскады и стимуляцию факторов роста для индуцирования почечных органоидов 5,12.
За последние несколько лет было разработано множество протоколов для дифференциации ИПСК человека в почечные органоиды 5,6,7,12. Takasato et al.7 оптимизировали продолжительность лечения CHIR (агонистом WNT) перед заменой на FGF9. Согласно их протоколу, воздействие CHIR в течение 4 дней с последующим введением FGF9 в течение 3 дней является наиболее эффективным способом индуцирования внутримышечного введения из ИПСК. В качестве культурального формата в их процедуре использовались фильтры Transwell; Однако этот способ сложен для новичков. Поэтому Kumar et al.13 попытались изменить формат культуры и решили приостановить ее действие. Они диссоциировали адгезивные клетки на 7-й день для посева в низкие адгезивные пластины, чтобы помочь им собраться в эмбриоидные тела (ЭБ), которые содержат нефроноподобные структуры. Тем не менее, пакетный эффект этих методов был очевиден, особенно в различных ИПСК. Кроме того, в различных литературных источниках сообщалось, что концентрация CHIR варьировала от 7 мкМ до 12 мкМ 5,13,14.
Мы предположили, что концентрация клеточной плотности и CHIR могут влиять на генерацию органоидов в различных ИПСК, и это было проверено много раз в наших экспериментах. Настоящий протокол несколько модифицировал метод исследования Kumar et al.13 и предоставил пользователям пошаговую процедуру. График и схема подхода представлены на рисунке 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ИПСК, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника. Клетки поддерживали средой mTeSR на коммерчески доступных пластинах с матричным покрытием базальной мембраны (см. таблицу материалов). В таблице 1 приведены все составы сред, использованные в исследовании.
1. Покрытие ИПСК для дифференцировки и индуцирования задней примитивной полосы (ПС)
- Промыть ИПСК на 6-луночном планшете с мембранным матричным покрытием 2 мл DPBS. Аспирируйте DPBS с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл коммерчески доступного раствора для отделения клеток (см. таблицу материалов) для отделения ИПСК и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.
- Добавьте 1 мл mTeSR к ИПСК и убедитесь, что клетки оторвались от пластиковой поверхности.
- Центрифугируйте клетки при 400 x g в течение 3 мин при комнатной температуре (RT). Ресуспендируйте клеточную гранулу и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Высевают клетки различной плотности на 24- или 6-луночный планшет, покрытый мембранным матриксом, и культуру с mTeSR, дополненным ингибитором 10 мкМ ро-киназы (Y-27632) (см. таблицу материалов). Культивируйте их в течение ночи в инкубаторе CO2 с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для индуцирования ФС оптимальная концентрация CHIR99021 и подходящая плотность клеток варьируются от разных линий ИПСК. Засейте в диапазоне плотностей (например, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 10,3 одиночные клетки на квадратный сантиметр) и диапазоне концентрации CHIR99021 от 7 мкМ до 12 мкМ. Инициируйте дифференциацию каждой плотности и каждого CHIR в один и тот же день. Найдите оптимальную концентрацию CHIR99021 и подходящую плотность клеток в 24-луночном планшете, а затем разведите культуру в 6-луночном планшете. Здесь мы приводим протокол, основанный на 6-луночном планшете. - На следующий день аспирируйте mTeSR и промойте клетки 2 мл DPBS.
- Добавьте 2 мл среды I стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 8-12 мкМ CHIR99021) (Таблица 1), см. День 0.
- Культивируйте их в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 дней, обновляйте среду I стадии каждые два дня.
2. Индуцирование нефрогенной промежуточной мезодермы (ИМ)
- На 4-й день удалите среднюю стадию I и умойтесь 2 мл DPBS.
- Добавьте в клетки 2 мл среды II стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 200 нг/мл FGF9, 1 мкг/мл гепарина и 1 мкМ CHIR99021) (табл. 1).
- Культивируйте их в инкубаторе при температуре 37 °C и обновляйте среду каждые 2 дня до 7-го дня.
3. Получение почечных органоидов в суспензионной культуре
ПРИМЕЧАНИЕ: В период наблюдения с 0-го по 7-й день состояние клеток критическое. Если клетки демонстрируют успешную экспансию и накапливаются без значительного клеточного мусора, это свидетельствует об успешном образовании промежуточной мезодермы (ИМ), что указывает на готовность перейти к следующему этапу. Однако, если клетки демонстрируют признаки начального апоптоза, за которым следует некроз или поломка, это может свидетельствовать о неподходящей концентрации CHIR99021 или плотности клеток.
- На 7-й день удалите среду II стадии и промойте клетки 2 мл DPBS.
- Добавьте 1 мл раствора для отслоения клеток в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин до преломления клеток при фазовом контрасте.
- Пипеткой 1 мл среды II стадии для клеток, перемешайте и убедитесь, что клетки оторвались от поверхности.
- Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при концентрации 400 x g в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточную гранулу в 2 мл среды III стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 200 нг/мл FGF9, 1 мкг/мл гепарина и 1 мкМ CHIR99021 в 0,1% метилцеллюлозы (MC), 0,1% поливинилового спирта (PVA)) с добавлением ингибитора 10 мкМ ро-киназы (Y-27632) (см. таблицу материалов). Аккуратно перемешайте.
- Смешайте клеточную суспензию и семена в 6-луночную пластину с низкой адгезией в пропорции 1:3. Поместите пластину на орбитальный шейкер (устойчивый к СО2, вращающийся со скоростью 60 об/мин) в инкубатор при температуре 37 °C и 5%СО2.
- Через 24 ч удаляют ингибитор Rho киназы (Y-27632) и добавляют среду III стадии (добавка среды для дифференцировки стволовых клеток с 200 нг/мл FGF9, 1 мкг/мл гепарина, 1 мкМ CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Культура в течение 2 дней. Измените среду в культуре суспензии, выполнив следующие действия:
- Отрежьте кончик пипетки объемом 1 мл асептическими ножницами.
- Осторожно встряхните 6-луночную тарелку, чтобы расположить органоиды в середине тарелки.
- Аспирируйте органоиды подготовленными пипетками в пробирку объемом 15 мл и дайте им постоять 5 минут.
- Отсасывайте надосадочную жидкость и оставьте органоиды на дне пробирки.
- Добавьте свежую среду, чтобы ресуспендировать органоиды, и переложите обратно в 6-луночную пластину с низкой адгезией.
- Продолжайте встряхивать пластину с низкой адгезией при 60 об/мин в инкубаторе. Меняйте среду III стадии каждые два дня до 12-го дня.
- На 12-й день смените среду на среду IV стадии (среда дифференцировки стволовых клеток, содержащая 0,1% MC и 0,1% PVA).
- Меняйте средство каждые два дня до 25-го дня. Органоиды могут постепенно развиваться в зрелые структуры нефрона с 12-го по 25-й день.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов почек
- Соберите органоиды почек в пробирку объемом 15 мл и промойте 2 мл PBS.
- Дав ему застыть в течение 5-10 минут, зафиксируйте почечные органоиды в свежеприготовленном 2% PFA в течение 20 мин при 4 °C.
- Удалить PFA и промыть органоиды 1 мл PBS, содержащим 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST), равномерно встряхнуть на шейкере (со скоростью вращения не более 60 об/мин) в течение 8 мин, дать постоять 5 мин, а затем удалить надосадочную жидкость. Повторите три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды можно хранить в 0,3% PBST при 4°C в течение 2-4 недель. - Инкубируют фиксированные органоиды с 10% ослиной сывороткой в PBST (блокирующий буфер) (см. таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C.
- Первичные антитела (перечисленные в таблице материалов) разводят в блокирующем буфере в соотношении 1:300.
- Инкубируют органоиды с первичными антителами в течение ночи при 4 °C при перемешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клубочки и канальцы могут быть окрашены одновременно на одном органоиде. - Органоиды промыть 1 мл 0,3% ПБСТ, равномерно встряхнуть на шейкере (со скоростью вращения не более 60 об/мин) в течение 8 мин, дать постоять 5 мин, а затем удалить надосадочную жидкость. Повторите три раза.
- Органоиды инкубируют со вторичными антителами (перечисленными в таблице материалов) и DAPI в течение ночи при 4 °C при перемешивании. Затем повторите шаг 4.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как вторичные антитела, так и DAPI разбавляются в блокирующем растворе, вторичные антитела (1:400) и DAPI (1:1000). - После окрашивания обезвоживают органоиды метанолом (25%, 50%, 75% и 100% в течение 5 мин каждый), затем пермеат бензиловым спиртом и бензилбензоатом (БАББ, соотношение 1:2) (см. таблицу материалов) в течение 5 мин.
- Очищенные органоиды выложите на чашку со стеклянным дном (см. Таблицу материалов) и исследуйте их с помощью конфокальной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации выбирайте чашку Петри на дне стеклянной чашки, а при проникновении помещайте BABB непосредственно в чашку Петри, чтобы дно чашки оставалось влажным.
5. Анализ поглощения декстрана in vitro
- На 25-й день инкубируют органоиды со 100 мкг/мл флуоресцентно меченого декстрана (см. таблицу материалов) в течение 4 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
- Через 4 часа переключитесь на свежую среду и сделайте живые изображения клеточных культур с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выработка IM достигается активацией канонической сигнализации WNT с помощью ингибитора GSK3 CHIR99021 с последующим FGF9/гепарином. С 0-го по 4-й день ИПСК быстро расширяются и приобретают ромбовидную или треугольную форму. Слияние достигает 90%-100% и накапливается равномерно до 7-го дня. При суспензионной культуре агрегаты спонтанно образуют нефронные структуры после диссоциации на 7-й день. Почечные органоиды, полученные с помощью суспензионной культуры, имеют трубчатые структуры и легко наблюдаются на ярких полевых и...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Был описан подробный протокол получения почечных органоидов из ИПСК, включающий незначительные модификации базальной среды, исходной плотности клеток и концентрации CHIR99021. В различных экспериментах было установлено, что критическими факторами для успешной генерации почечных органоидов являются начальная дифференцировка промежуточной мезодермы (ИМ) и состояние клеток на 7-е сутки. Кроме того, различные линии ИПСК демонстрировали различия в потенциале пролиферации и дифференцировки клеток, что приводило к различным опт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы сообщили об отсутствии потенциального конфликта интересов.
Благодарности
Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Благодарим Национальный клинический исследовательский центр детского здоровья за большую поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху) и Фонд естественных наук провинции Цзянсу (гранты No 1). BK20210150 Ган Вану).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96 лунок Планшет для культивирования клеток, плоскодонный | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Антитела | |||
| Бензиловый спирт | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Бензилбензоат | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Шкаф биологической безопасности | Haier Cat #HR40  A2 | ||
| Биотин античеловеческий LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Мононуклеарные клетки крови hiPS-B1 (iPSc, женские) | N/A | N/A | |
| Шейкер уровня углекислого газа | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Химические вещества, пептиды и рекомбинантные | |||
| CHIR99021 (активатор пути Wnt) | STEMCELL Технологии | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI раствор для окрашивания | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (без кальция, магния, фенола красного) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Экспериментальные модели: Клеточные линии | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Инкубатор | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Тарелки для культуры со стеклянным дном | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Раствор гепарина (добавка к клеточной культуре) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Человеческий рекомбинантный FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Инвертированный микроскоп | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Метилцеллюлоза | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Микроцентрифуга | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Мышь античеловеческая CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Мышь античеловеческая ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Мышь античеловеческая Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Мышь античеловеческая MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Поливиниловый спирт 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Flyals | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Технология клеточной сигнализации | Cat #5852S | |
| Rabbit против человека LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit против человека WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit против мыши PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Рекомбинантный альбумин сыворотки крови человека (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep античеловеческий NPHS1 (1:300) | R& D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (дигидрохлорид) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Ссылки
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765(2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715(2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361(2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
