В данной работе мы описываем выделение, культивирование и адипогенную индукцию преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши, что позволяет изучать периваскулярную функцию жировой ткани и ее взаимосвязь с сосудистыми клетками.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение, культивирование и адипогенная индукция преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Периваскулярная жировая ткань (PVAT) представляет собой депо жировой ткани, которое окружает кровеносные сосуды и проявляет фенотипы белых, бежевых и коричневых адипоцитов. Недавние открытия пролили свет на центральную роль ПВАТ в регуляции сосудистого гомеостаза и участии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Всестороннее понимание свойств и регуляции PVAT имеет большое значение для разработки будущих методов лечения. Первичные культуры периаортальных адипоцитов ценны для изучения функции PVAT и перекрестных помех между периаортальными адипоцитами и сосудистыми клетками. В данной работе представлен экономичный и осуществимый протокол выделения, культивирования и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из периаортальной жировой ткани мыши, который может быть полезен для моделирования адипогенеза или липогенеза in vitro. Протокол описывает обработку тканей и дифференцировку клеток для культивирования периаортальных адипоцитов молодых мышей. Этот протокол станет технологическим краеугольным камнем на стенде для исследования функции PVAT.
Введение
Считается, что периваскулярная жировая ткань (PVAT), периваскулярная структура, состоящая из смеси зрелых адипоцитов и стромально-васкулярной фракции (SVF), взаимодействует со стенкой соседнего сосуда через его секретом паракринально1. Являясь важнейшим регулятором сосудистого гомеостаза, дисфункция PVAT вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний 2,3,4. SVF ткани адипоцитов состоит из нескольких ожидаемых клеточных популяций, включая эндотелиальные клетки, иммунные клетки, клетки мезотелия, нейрональные клетки, а также стволовые и прогенитор....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протоколы содержания животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Шанхайской больнице грудной клетки, связанной с Медицинской школой Шанхайского университета Цзяо Тун (номер утверждения: KS23010) и соответствовали соответствующим этическим нормам. Для этого эксперимента следует отдавать предпочтение самцам и самкам мышей C57BL/6 в возрасте 4-8 недель.
1. Подготовка хирургических инструментов, буферов и питательных сред
- Автоклавные хирургические инструменты (например, хирургические ножницы и стандартные щипцы) при 121 °C в течение 30 мин. Продезинфицировать микрохирургические инструме....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя этот протокол, описанный выше, мы тщательно изолировали PVAT, окружающие грудные аорты мышей (рис. 1A-D). После промывки и измельчения ПВАТ на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц (рис. 1E, F) фрагменты тканей переваривали в растворе для пищеварения, содержащем коллагеназу 1-го типа (1 мг/мл) и диспазу II (4 мг/мл), и инкубировали при 37 °C на шейкере в течение 30-45 мин (рис. 1G).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Предложен практический и осуществимый подход к выделению и адипогенной индукции SVF-полученных преадипоцитов из периаортальной жировой ткани мыши. Преимущества этого протокола в том, что он прост и экономичен. Достаточное количество мышей имеет решающее значение для успешной изоляции, так как недостаток ткани может привести к низкой плотности SVF и плохому состоянию роста, что в конечном итоге влияет на липогенную эффективность. Кроме того, важным фактором, который следует учитывать, является возраст мышей, поскольку ади.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, финансового или иного, который они могли бы декларировать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82130012 и 81830010) и проектами Nurture по фундаментальным исследованиям Шанхайской больницы грудной клетки (номер гранта: 2022YNJCQ03).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m шприцевые фильтры | PALL | 4612 | |
| 12-луночный планшет | Labselect | 11210 | |
| 15 мл центрифужная пробирка | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-трийодо-L-тиронин (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 нМ |
| 50 мл центрифужная пробирка | Labselect | CT-002-50A | |
| антиадипонектин | Abcam | ab22554 | 1:1,000 рабочая концентрация |
| анти-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 рабочая концентрация |
| анти-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 рабочая концентрация |
| анти-PGC1&альфа; | Abcam | ab191838 | 1:1,000 рабочая концентрация |
| анти-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 рабочая концентрация |
| анти-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 рабочая концентрация |
| анти-α-Actinin | CST 6487 | 1:1,000 рабочая концентрация | |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 мышей в возрасте 4-8 недель обоих полов | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Сетчатый фильтр 70 & микро; m, нейлон | Falcon | 352350 | |
| Коллаген из кожи теленка | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Коллагеназа, тип 1 | Worthington | LS004196 | 1 мг/мл |
| Дексаметазон | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μ M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 мг/мл |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 мМ |
| Высокий уровень глюкозы DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0,5 мМ |
| Инкубатор с орбитальным вибростендом | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Инсулин (крупный рогатый скот) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μ M |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's solution | Pricella | PB180347 | защиты от света |
| Микрохирургические щипцы | Beyotime | FS233 | |
| Микрохирургические ножницы | Beyotime | FS217 | |
| Масло красное O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (фосфатно-солевой буфер) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140122 | |
| пероксидазой AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 рабочая концентрация |
| пероксидазы AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 рабочая концентрация |
| Росиглитазона | Сигма-Олдрич | R2408 | 1 μ M |
| Стандартные щипцы | Beyotime | FS225 | |
| Хирургические ножницы | Beyotime | FS001 |
Ссылки
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
