Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение, культивирование и адипогенная индукция преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши

3.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65703

⸱

21 июля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы описываем выделение, культивирование и адипогенную индукцию преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши, что позволяет изучать периваскулярную функцию жировой ткани и ее взаимосвязь с сосудистыми клетками.

Аннотация

Периваскулярная жировая ткань (PVAT) представляет собой депо жировой ткани, которое окружает кровеносные сосуды и проявляет фенотипы белых, бежевых и коричневых адипоцитов. Недавние открытия пролили свет на центральную роль ПВАТ в регуляции сосудистого гомеостаза и участии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Всестороннее понимание свойств и регуляции PVAT имеет большое значение для разработки будущих методов лечения. Первичные культуры периаортальных адипоцитов ценны для изучения функции PVAT и перекрестных помех между периаортальными адипоцитами и сосудистыми клетками. В данной работе представлен экономичный и осуществимый протокол выделения, культивирования и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из периаортальной жировой ткани мыши, который может быть полезен для моделирования адипогенеза или липогенеза in vitro. Протокол описывает обработку тканей и дифференцировку клеток для культивирования периаортальных адипоцитов молодых мышей. Этот протокол станет технологическим краеугольным камнем на стенде для исследования функции PVAT.

Введение

Считается, что периваскулярная жировая ткань (PVAT), периваскулярная структура, состоящая из смеси зрелых адипоцитов и стромально-васкулярной фракции (SVF), взаимодействует со стенкой соседнего сосуда через его секретом паракринально1. Являясь важнейшим регулятором сосудистого гомеостаза, дисфункция PVAT вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний 2,3,4. SVF ткани адипоцитов состоит из нескольких ожидаемых клеточных популяций, включая эндотелиальные клетки, иммунные клетки, клетки мезотелия, нейрональные клетки, а также стволовые и прогениторные клетки жировой ткани (ASPC)5,6. Хорошо известно, что ASPC, находящиеся в SVF жировой ткани, могут давать начало зрелым адипоцитам5. Предполагается, что SVF является критическим источником зрелых адипоцитов в PVAT. Несколько исследований показали, что PVAT-SVF может дифференцироваться в зрелые адипоциты при определенных условиях индукции 6,7,8.

В настоящее время существуют две системы выделения SVF из жировой ткани, одна из которых является ферментативным пищеварением, а другая - неферментативной9. Ферментативные методы, как правило, приводят к более высокому выходу ядросодержащих клеток-предшественников10. На сегодняшний день широко продемонстрированы преимущества SVF в стимулировании регенерации сосудов и неоваскуляризации при заживлении ран, урогенитальных и сердечно-сосудистых заболеваниях11, особенно в дерматологии и пластической хирургии12,13. Тем не менее, перспективы клинического применения SVF, полученного из PVAT, недостаточно изучены, что может быть связано с отсутствием стандартизированного метода выделения SVF из PVAT. Целью данного протокола является установление стандартизированного подхода к выделению, культивированию и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из SVF-полученных из мышиного ПВАТ, окружающих грудную аорту, что позволит в дальнейшем исследовать функцию ПВАТ. Этот протокол оптимизирует методы обработки тканей и дифференцировки клеток для культивирования периаортальных адипоцитов, полученных от молодых мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протоколы содержания животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Шанхайской больнице грудной клетки, связанной с Медицинской школой Шанхайского университета Цзяо Тун (номер утверждения: KS23010) и соответствовали соответствующим этическим нормам. Для этого эксперимента следует отдавать предпочтение самцам и самкам мышей C57BL/6 в возрасте 4-8 недель.

1. Подготовка хирургических инструментов, буферов и питательных сред

  1. Автоклавные хирургические инструменты (например, хирургические ножницы и стандартные щипцы) при 121 °C в течение 30 мин. Продезинфицировать микрохирургические инструменты 75% спиртом.
  2. Приготовьте стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) с добавлением 1% v/v пенициллина-стрептомицина и еще 10 мл PBS с добавлением 10% v/v пенициллина-стрептомицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах, если не указано иное, ПБС относится к обычному стерильному ПБС.
  3. Приготовьте буфер Krebs Ringer HEPES BSA: 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 20 мМ HEPES, растворенный в растворе Krebs Ringer.
  4. Приготовьте свежий раствор для пищеварения: коллагеназу типа 1 (1 мг/мл) и диспазу II (4 мг/мл) растворить в буфере Krebs Ringer HEPES BSA. Простерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
  5. Подготовьте 12-луночную пластину, покрытую коллагеном.
    1. Раствор коллагена (1 мг/мл) разбавить стерильной деионизированной водой до концентрации 40 мкг/мл. Добавьте 1 мл разбавленного раствора коллагена на поверхность каждой лунки до достижения концентрации 6-10 мкг/см2. Выдерживают покрытие в течение 1 ч при комнатной температуре.
    2. Удалите остатки раствора и промойте каждую лунку 2 раза 1 мл PBS. Используйте пластину немедленно или высушите ее на воздухе в ламинарном колпаке класса II и храните пластину с покрытием при температуре 2-8 °C. При хранении пластины с покрытием заклеить парапленкой.
  6. Приготовьте питательную среду: модифицированную среду Eagles с высоким содержанием глюкозы Dulbecco (DMEM), 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 1% v/v пенициллин-стрептомицин. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  7. Приготовьте липогенную индукционную среду: ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% ФБС, 1% в/в пенициллин-стрептомицин, 1 нМ трийодтиронин, 1 мкМ розиглитазон, 1 мкМ инсулина, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) и 1 мкМ дексаметазон. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  8. Приготовьте поддерживающую среду: ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% ФБС, 1% в/в пенициллин-стрептомицин, 1 нМ трийодтиронин, 1 мкМ росиглитазон и 1 мкМ инсулин. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.

2. Рассечение и выделение периваскулярной жировой ткани (PVAT)

  1. Усыпляют мышь вывихом шейки матки под 2% анестезией изофлураном или при передозировке углекислого газа. Спрей с 75% спиртом для дезинфекции кожи.
  2. Поместите мышь в положение лежа на спине (лицом вверх).
  3. Поднимите кожу, сделайте небольшой разрез и тупо отделите кожу и мышцы живота хирургическими ножницами вдоль вентральной средней линии от таза до шеи. Обнажите сердце и легкие, разрезав диафрагму и ребра по обеим сторонам средней линии.
  4. Осторожно удалите печень, селезенку, кишечник и почки. Избегайте порезов стенки кишечника.
  5. Удалить легкие и пищевод.
  6. Аккуратно приподнимите сердце щипцами в одной руке и отделите аорту от позвоночника хирургическими ножницами в другой руке. Затем поместите сердце и аорту в чашку Петри диаметром 60 мм с PBS, содержащей 1% v/v пенициллина-стрептомицина.
  7. Снимите микрохирургические щипцы и микрохирургические ножницы со спирта и промойте в 25 мл PBS, чтобы удалить излишки спирта. Под стереомикроскопом удалите тимус и другие ткани из сердца и аорты, затем удалите сердце, оставив аорту с ПВАТ.
  8. Перенесите аорту с ПВАТ в чистую чашку Петри диаметром 60 мм с ПБС, содержащей 1%/в пенициллина-стрептомицина.
  9. Используйте микрохирургические щипцы для удаления PVAT, при этом одна пара щипцов фиксирует аорту, а другая удаляет жировую ткань. Удалить сосудистую ткань настолько, насколько это возможно, минимизируя повреждение периваскулярной жировой ткани.
  10. Соберите PVAT, окружающий грудную аорту, в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую DMEM с высоким содержанием глюкозы, добавленную 1% v/v пенициллина-стрептомицина, помещенную на лед.

3. Выделение стромально-васкулярной фракции (SVF)

  1. Собранные ткани последовательно промывают PBS, содержащим 10% v/v пенициллина-стрептомицина, и PBS, содержащим 1% v/v пенициллина-стрептомицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, все эксперименты должны проводиться в стерильных условиях в ламинарном колпаке класса II.
  2. Переложите ткани в стерильную чашку Петри диаметром 60 мм, добавьте 200 мкл раствора для пищеварения и измельчите их стерильными ножницами на кусочки размером1 мм3 .
  3. Перелейте смесь в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью пластикового наконечника пипетки, конец которого расширен стерильным надрезом ножниц, и добавьте 6 мл раствора для сбраживания, чтобы начать реакцию сбраживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одной реакции сбраживания (3 мл раствора для разложения) достаточно для депо PVAT от шести мышей.
  4. Инкубируют ткани при 37 °C в инкубаторе с орбитальным шейкером (частота 150 об/мин для эффективного перемешивания) в течение 30-45 мин. Привяжите трубки к решетке, чтобы трубки тряслись горизонтально. Энергично встряхивайте вверх и вниз рукой в течение 10 секунд каждые 5-10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пищеварение может быть прекращено, когда видна однородная желтоватая пищеварительная жидкость без остатков фрагментов ткани.
  5. Процедите переваренные ткани через ситечко с ячейками 70 мкм в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Промойте клеточное ситечко равным объемом питательной среды, чтобы максимизировать выход клеток и остановить пищеварение.
  6. Переложите фильтрат в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при концентрации 1 800 × г в течение 10 мин. Переверните пробирку, чтобы удалить надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулы в 5 мл PBS. Центрифуга при 1 800 × г в течение 5 мин.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пробирку, и повторно суспендируйте гранулы в соответствующем объеме питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы, собранные у каждых шести мышей, ресуспендируют в 1 мл питательной среды и высевают в одну лунку 12-луночного планшета.
  8. Высейте клетки в покрытую коллагеном 12-луночную планшет и инкубируйте при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2 в течение ночи.
  9. На следующий день аспирируют питательную среду, промывают клетки предварительно подогретым (37 °C) PBS, содержащим 1% v/v пенициллина-стрептомицина, для удаления клеточного мусора и эритроцитов, и добавляют обратно по 1 мл свежей питательной среды в каждую лунку.

4. Адипогенная индукция SVF-полученных преадипоцитов из периаортальной жировой ткани

  1. Меняйте питательную среду через день, пока клетки не достигнут слияния ~60-70%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно требуется 3-4 дня, чтобы ячейки достигли 60-70% слияния.
  2. Когда клетки достигнут 60-70% слияния, аспирируют питательную среду и заменяют ее коричневой адипогенной индукционной средой. День индукции адипогенной дифференцировки считать днем 0 дифференцировки.
  3. Через 72 ч (3-й день дифференциации) освежите среду поддерживающей средой. Меняйте поддерживающую среду каждые 2 дня до тех пор, пока клетки не будут использованы для экспериментов.
  4. Проанализируйте адипогенные клетки соответствующим образом, например, окрашивая масляно-красным O14 и вестерн-блоттингом15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя этот протокол, описанный выше, мы тщательно изолировали PVAT, окружающие грудные аорты мышей (рис. 1A-D). После промывки и измельчения ПВАТ на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц (рис. 1E, F) фрагменты тканей переваривали в растворе для пищеварения, содержащем коллагеназу 1-го типа (1 мг/мл) и диспазу II (4 мг/мл), и инкубировали при 37 °C на шейкере в течение 30-45 мин (рис. 1G).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предложен практический и осуществимый подход к выделению и адипогенной индукции SVF-полученных преадипоцитов из периаортальной жировой ткани мыши. Преимущества этого протокола в том, что он прост и экономичен. Достаточное количество мышей имеет решающее значение для успешной изоляции, так как недостаток ткани может привести к низкой плотности SVF и плохому состоянию роста, что в конечном итоге влияет на липогенную эффективность. Кроме того, важным фактором, который следует учитывать, является возраст мышей, поскольку ади...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, финансового или иного, который они могли бы декларировать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82130012 и 81830010) и проектами Nurture по фундаментальным исследованиям Шанхайской больницы грудной клетки (номер гранта: 2022YNJCQ03).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 μ m шприцевые фильтрыPALL4612
12-луночный планшет Labselect11210
15 мл центрифужная пробиркаLabserv310109003
3,3',5-трийодо-L-тиронин (T3)Sigma-AldrichT-28771 нМ
50 мл центрифужная пробиркаLabselectCT-002-50A
антиадипонектинAbcamab225541:1,000 рабочая концентрация
анти-COX IVCST48501:1,000 рабочая концентрация
анти-FABP4CST21201:1,000 рабочая концентрация
анти-PGC1&альфа;Abcamab1918381:1,000 рабочая концентрация
анти-PPARγInvitrogenMA5-148891:1,000 рабочая концентрация
анти-UCP1Abcamab109831:1,000 рабочая концентрация
анти-α-ActininCST 64871:1,000 рабочая концентрация
BSABeyotimeST023-200g1%
C57BL/6 мышей в возрасте 4-8 недель обоих половShanghai Model Organisms Center, Inc.
Сетчатый фильтр 70 & микро; m, нейлонFalcon352350
Коллаген из кожи теленкаSigma-AldrichC8919
Коллагеназа, тип 1WorthingtonLS0041961 мг/мл
ДексаметазонSigma-AldrichD17561 μ M
Dispase IISigma-AldrichD4693-1G4 мг/мл
Фетальная бычья сыворотка Gibco16000-04410%
HEPESSigma-AldrichH4034-25G20 мМ
Высокий уровень глюкозы DMEMHycloneSH30022.01
IBMX Sigma-AldrichI70180,5 мМ
Инкубатор с орбитальным вибростендомShanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.LYZ-103B
Инсулин (крупный рогатый скот) Sigma-Aldrich11070-73-81 μ M
IsofluraneRWDR510-22-10
Krebs-Ringer's solutionPricella PB180347защиты от света 
Микрохирургические щипцыBeyotimeFS233
Микрохирургические ножницыBeyotimeFS217
Масло красное O Sangon Biotech (Shanghai) Co., LtdA600395-0050
PBS (фосфатно-солевой буфер)Sangon Biotech (Shanghai) Co., LtdB548117-0500
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
пероксидазой AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 115-035-1461:5,000 рабочая концентрация
пероксидазы AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 111-035-1441:5,000 рабочая концентрация
РосиглитазонаСигма-ОлдричR24081 μ M
Стандартные щипцыBeyotimeFS225
Хирургические ножницыBeyotimeFS001

Ссылки

  1. Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
  2. Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
  3. Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
  4. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  5. Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
  6. Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
  7. Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  8. Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
  9. Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
  10. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88(2019).
  11. Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
  12. Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933(2019).
  13. Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
  14. Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
  15. Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
  16. Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
  17. Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
  18. Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
  19. Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117(2022).
  20. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  21. Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843(2021).
  22. Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040(2020).
  23. Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
  24. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  25. Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
  26. Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183(2022).
  27. Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
  28. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  29. Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
  30. Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Периваскулярная жировая тканьизоляция преадипоцитовПВЖТ мыширасщепление тканикультура клетокпланшет с коллагеновым покрытиемдифференцировка клетоксосудистый гомеостаз
Выделение, культивирование и адипогенная индукция преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.