Экстракция внеклеточной ДНК образцов стекловидного тела и водянистой влаги для диагностики и мониторинга витреоретинальной лимфомы

Краткое содержание

Здесь налажена процедура извлечения внеклеточной ДНК из стекловидного тела и водянистой влаги для проведения молекулярных исследований для диагностики витреоретинальной лимфомы. Метод позволяет одновременно извлекать ДНК из клеточного компонента образца или резервировать ее для вспомогательного тестирования.

Аннотация

Витреоретинальная лимфома (VRL) представляет собой агрессивную лимфому, часто классифицируемую как первичная диффузная В-крупноклеточная лимфома центральной нервной системы. Для диагностики VRL собираются такие образцы, как стекловидное тело и, в последнее время, водянистая влага. Диагностическое тестирование этих образцов на VRL включает цитологию, проточную цитометрию и молекулярное тестирование. Тем не менее, как цитопатология, так и проточная цитометрия, наряду с молекулярным тестированием с использованием клеточной ДНК, требуют неповрежденных цельных клеток. Проблема заключается в том, что стекловидное тело и водянистая влага, как правило, имеют низкую клеточность, и многие клетки разрушаются во время сбора, хранения и обработки. Кроме того, эти образцы представляют дополнительные трудности для молекулярного тестирования из-за высокой вязкости стекловидного тела и малого объема как стекловидного, так и водянистого влаги. В данном исследовании предложен метод извлечения внеклеточной ДНК из стекловидных и водных образцов. Этот подход дополняет выделение клеточной ДНК или позволяет использовать клеточный компонент этих образцов для других методов диагностики, включая цитологию и проточную цитометрию.

Введение

Витреоретинальная лимфома (VRL) – агрессивная лимфома, ассоциированная с первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомой ^1,2,3 в центральной нервной системе. VRL обычно приводит к летальному исходу из-за поражения центральной нервной системы ^1,2. Несмотря на редкость^1,4, VRL часто проявляется симптомами, сходными с задним увеитом и другими витреоретинальными заболеваниями ^4,5. Следовательно, пациентам с симптомами увеита требуется диагноз для подтверждения или исключения VRL.

Недавно были опубликованы консенсусные критерии диагностики VRL, которые включают в себя комбинацию клинического обследования и лабораторных данных⁶. Образцы, обычно используемые для диагностики VRL, включают стекловидное тело и, в последнее время, водянистую влагу⁷. Стекловидное тело получают с помощью хирургической процедуры, называемой витрэктомией pars plana, которая обеспечивает доступ к заднему сегменту глаза⁸.

В представленном протоколе были отобраны образцы водянистой влаги и стекловидного тела для клеточной экстракции и экстракции cfDNA. После обезболивания пациентов и размещения троакаров на расстоянии примерно 4 мм от лимба роговицы с помощью туберкулинового шприца объемом 1 мл в лимбе роговицы был получен образец водянистой влаги объемом около 100-200 мкл. Для псевдофакичных пациентов неразбавленное стекловидное тело получали путем введения в инфузию стерильного воздуха, что позволяло собирать большее количество неразбавленного стекловидного тела (до 3,5 мл). У факичных пациентов перед включением инфузии сбалансированного солевого раствора удаляли примерно от 500 до 1000 мкл неразбавленного стекловидного тела. В некоторых случаях вторично разбавленное стекловидное тело (от 500 до 2000 мкл) собирали путем переключения инфузии на жидкость и помещения витректора в юбку стекловидного тела для получения этого образца. Наиболее разбавленная фракция стекловидного тела была собрана путем сохранения кассетного пакета (дополнительный рисунок 1) в конце операции. После того, как этот мешок попадал в патологоанатомическое отделение, разбавленное стекловидное тело получали путем слива жидкости из этого мешка в конические пробирки для последующей экстракции ДНК.

Цитопатология стекловидного тела часто считается золотым стандартом⁹. Тем не менее, несколько исследований продемонстрировали ограниченную чувствительность из-за обработки и минимальной клеточности^10,11,12. Проточная цитометрия может помочь в идентификации клональных В-клеток, но также может быть ограничена низкой клеточностью и хрупкостью крупных клеток лимфомы^13,14,15. Как цитопатология, так и проточная цитометрия требуют неповрежденных цельных клеток. Многие из этих клеток разрушаются во время сбора, хранения и переработки. Когда молекулярное тестирование проводится с использованием ДНК, извлеченной из интактных клеток (клеточная ДНК), оно страдает от того же ограничения. Кроме того, разделение ограниченного образца стекловидного тела для всех этих тестов уменьшает количество материала, доступного для каждого теста.

Внеклеточная ДНК (cfDNA) представляет собой еще один источник ДНК, который не требует интактных клеток. cfDNA из образцов стекловидного тела была использована для выявления VRL ^16,17, а также увеальной меланомы¹⁸. В этом протоколе клеточная и внеклеточная ДНК извлекается из стекловидного тела и водной жидкости для обнаружения VRL.

Протокол

Настоящий протокол соответствует руководящим принципам по уходу за людьми и одобрен институциональным наблюдательным советом (IRB) Мичиганского университета. На это было получено разрешение IRB об отказе от информированного согласия. Не существует соответствующих критериев включения или исключения пациентов, участвующих в исследовании.

1. Разделение клеточных и бесклеточных компонентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для диагностического исследования VRL можно получить три типа образцов: стекловидное тело (неразбавленное; жидкость от витрэктомии, собранная до начала инфузии), разбавленное стекловидное тело в кассетном пакете (Рисунок 1) и водянистая влага (жидкость из передней камеры глаза).

1. Для неразбавленной стекловидной жидкости, которая очень вязкая, разбавьте 3-5 мл PBS для облегчения пипетирования.
2. Для разбавления стекловидного тела в кассетном пакете (дополнительный рисунок 1) слейте жидкость в конические пробирки объемом 50 мл (одна на каждые 45 мл жидкости).
3. Водянистая влага имеет очень малый объем (<200 мкл). Чтобы обеспечить максимальное извлечение клеток, перенесите образец в пробирку объемом 1,5 мл, промойте исходную микроцентрифужную пробирку объемом 500 мкл, в которую был собран образец, равным объемом PBS и добавьте в пробирку объемом 1,5 мл.
4. Центрифуга стекловидного тела или водной жидкости при 3 000 x g в течение 15 мин при комнатной температуре.
5. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, стараясь не потревожить гранулированные клетки.

2. Выделение ДНК из клеточного компонента

1. Добавьте соответствующее количество раствора для лизиса клеток (300 мкл для маленьких гранул, 1 мл или более для более крупных гранул) (см. таблицу материалов). Перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
2. При полном лизисе добавляют 1/3 общего объема раствора белкового осадка (100 мкл для 300 мкл лизитата) (см. таблицу материалов).
3. Энергично вихрь в течение 20-30 с. Отжим в течение 3 минут при 3 000 x g при комнатной температуре.
4. Пипетка 300 мкл изопропанола в чистую микроцентрифужную пробирку. Осторожно пипеткой выдавите надосадочную жидкость из предыдущего шага в пробирку с изопропанолом.
5. Добавьте 1,5 мкл гликогена 20 мг/мл (для лизиса 300 мкл) (см. таблицу материалов).
6. Хорошо перемешайте путем инверсии, затем поместите образец в морозильную камеру при температуре -20 °C на 1 час или на ночь, чтобы способствовать осаждению ДНК.
7. Центрифугируйте пробирку объемом 1,5 мл в течение 5 минут при 3 000 x g при комнатной температуре. Пипеткой снимите изопропанол.
8. Добавьте 0,5 мл 70% этанола и переверните пробирку, чтобы промыть гранулы.
9. Отжим в течение 1 минуты при 3 000 x g при комнатной температуре и сцедите этанол. Повторите промывку этанолом один раз.
10. Переверните трубку на чистую марлю, чтобы слить раствор и высушить гранулу или декант. Быстро открутите ДНК в микроцентрифуге и пропийте оставшуюся каплю этанола одноразовым наконечником для пипетки с тонким наконечником (как только в пробирке не останется остаточного этанола, ДНК должна быть сухой и готовой к гидратации через 5-10 минут).
11. Добавьте 45 мкл раствора гидратации ДНК (см. таблицу материалов) к высушенной грануле ДНК.
12. Поместите пробирку в нагревательный блок при температуре 50 °C и дайте ей раствориться в течение 1-2 часов. Пропитывайте ДНК вверх и вниз, чтобы ускорить процесс гидратации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте больше раствора для гидратации ДНК, если образец кажется слишком вязким.

3. Внеклеточная экстракция ДНК

1. Количество надосадочной жидкости с шага 1,5 варьируется. Добавьте 70 мкл кондиционирующего буфера (см. Таблицу материалов) на каждый миллилитр надосадочной жидкости.
2. Хорошо перемешайте прозрачные шарики вихревым способом. Добавьте 10 мкл очищающих шариков при обработке <14 мл бесклеточной надосадочной жидкости, 20 мкл при обработке 14-40 мл.
3. Хорошо перемешайте смесь образца и шарика с помощью вихря. Центрифуга при 3 000 x g в течение 15 мин при комнатной температуре.
4. Не повреждая гранулу, пипеткой выдавите надосадочную жидкость, оставив 100 мкл, если используется 10 мкл прозрачных шариков, и 200 мкл, если используется 20 мкл прозрачных шариков.
5. Добавьте равный объем буфера для переваривания гранул мочи (см. Таблицу материалов) к грануле и повторно суспендируйте гранулу путем вихревого или пипетирования.
6. Добавьте протеиназу К (5% (v/v)) к ресуспендированной грануле (например, добавьте 10 мкл протеиназы К в смесь 200 мкл) и хорошо перемешайте путем мягкого вихряния.
7. Инкубируйте пеллетную смесь при температуре 55 °C в течение 30 минут.
8. Добавьте один объем буфера для лизиса генома (см. таблицу материалов) в смесь для переваривания (например, 210 мкл буфера для геномного лизиса к 210 мкл смеси для переваривания) и перемешайте путем вихряния.
9. Перенесите имеющуюся в продаже спиновую колонку (см. Таблицу материалов) в новую сборную пробирку.
10. Добавьте 200 мкл буфера для подготовки ДНК мочи в спиновую колонку, центрифугируйте при ≥16 000 x g в течение 1 мин при комнатной температуре и выбросьте проточную жидкость.
11. Добавьте 700 мкл буфера для промывки ДНК мочи в колонку, центрифугу при ≥16 000 x g в течение 1 мин при комнатной температуре и выбросьте проточный раствор.
12. Повторите этот шаг с 200 мкл буфера для промывки ДНК мочи.
13. Перенесите спиновую колонку в микроцентрифужную пробирку, не содержащую ДНКазы/РНКазы.
14. Добавьте соответствующий объем буфера для элюирования ДНК (на основе молекулярных тестов, которые необходимо выполнить) непосредственно на матрицу колонки и дайте ему постоять 3-5 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В примерах использовали 30 мкл элюирующего буфера. Если требуется дополнительное тестирование, используется дополнительный элюирующий буфер.
15. Центрифугу при ≥16 000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин для получения бесклеточной ДНК.

Результаты

Эти методы экстракции были выполнены в ограниченном числе случаев для обеспечения адекватного выхода и амплифицируемости внеклеточной ДНК по сравнению с клеточной ДНК из стекловидного (четыре) и водного (четыре) образцов. Из этих образцов выход ДНК из бесклеточного компонента этих жидкостей аналогичен выходу клеточного компонента (табл. 1). Клеточная и cfDNA из этих образцов также была оценена с помощью молекулярного тестирования, например, для VRL-ассоциированной мутации MYD88 L265P. Аллель-специфическая ПЦР в реальном времени для MYD88 L265P (рис. 1) иллюстрирует обнаружение этой VRL-ассоциированной мутации как в клеточной ДНК, так и в cfDNA. В этом примере бремя болезни, по-видимому, выше в бесклеточном компоненте, что иллюстрируется более низким порогом цикла (Ct). Эти данные иллюстрируют, что cfDNA, извлеченная из стекловидного тела и водянистой влаги с помощью этого метода, приводит к источнику ДНК, который также может быть применен для диагностического молекулярного тестирования.

Рисунок 1: ПЦР в реальном времени, специфичная для аллеля MYD88 L265P. Репрезентативный график амплификации, показывающий MYD88 L265P аллель-специфичную ПЦР в реальном времени для клеточной и внеклеточной ДНК (каждая реакция ПЦР выполняется в двух экземплярах). Порог порога цикла (Ct) обозначается зеленой линией. Точки, в которых амплификация cfDNA (синие и коричневые следы) и клеточной ДНК (красные и зеленые следы), каждая из которых выполняется в двух экземплярах, достигают порогового значения, помечены. Фоновая флуоресценция присутствует около 1.00e-003. Более высокая мутационная нагрузка присутствует в бесклеточном компоненте, о чем свидетельствует более низкий уровень Ct. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

	Сотовый	Без ячеек
Стекловидное тело 1	130.5	67.5
Стекловидное тело 2	337.5	105
Стекловидное тело 3	150	168
Стекловидное тело 4	1816	654
Водный 1	58.5	40.5
Водный 2	153	225
Водный 3	117	454.5
Водный 4	ТЛ	27

Таблица 1: Клеточная и внеклеточная экстракция ДНК. Выход ДНК (в нг) для четырех неразбавленных стекловидных и четырех водянистых жидкостей (передней камеры) от четырех разных людей на основе флуорометрического количественного определения ДНК. TL = слишком низко для количественной оценки.

Дополнительный рисунок 1: Кассетный пакет для стекловидного тела. Пример кассетного пакета стекловидного тела, содержащего разбавленную стекловидную жидкость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Витреоретинальная лимфома (VRL) представляет собой агрессивную крупноклеточную В-клеточную лимфому ^1,2,3, симптомы которой могут имитировать другие витреоретинальные заболевания ^4,5. Молекулярное тестирование стекловидного тела и, в последнее время, водянистой влаги стало критически важным методом для постановки диагноза VRL или его исключения. Однако эти жидкости имеют очень малый объем и часто имеют низкую клеточность. Многие клетки в этих жидкостях также могут быть повреждены во время сбора, хранения и обработки^13,14,15. В результате выход ДНК из этих образцов часто низкий. Кроме того, клетки из этих жидкостей должны использоваться совместно с другими методами диагностики, включая цитопатологию и проточную цитометрию. Внеклеточная ДНК (cfDNA) в этих жидкостях обеспечивает еще один источник ДНК, который не требует интактных клеток.

Этот протокол разделяет клеточные и бесклеточные компоненты стекловидного тела или водной жидкости. Стекловидное тело разбавляется PBS, чтобы обеспечить возможность пипетирования из-за его вязкости. Водная жидкость обрабатывается таким образом, чтобы обеспечить максимальное извлечение этой жидкости очень малого объема.

Сравнение выходов ДНК этих двух компонентов показывает, что из бесклеточного компонента может быть получена существенная дополнительная нуклеиновая кислота. Молекулярное тестирование cfDNA, такое как MYD88 L265P аллель-специфичная ПЦР в реальном времени, демонстрирует, что VRL может быть обнаружен во внеклеточном компоненте стекловидного тела и водянистой влаги, а также в клеточном компоненте. Во многих случаях относительное количество VRL выше в бесклеточном компоненте, чем в клеточном (рис. 1).

Экстракция бесклеточного компонента стекловидного тела и водной жидкости позволяет провести молекулярную оценку компонента этих жидкостей, который в противном случае был бы отброшен. Поскольку VRL представлен в клеточных и бесклеточных компонентах, клеточная ДНК и cfDNA могут быть объединены, чтобы максимизировать доступную ДНК из этих ограниченных образцов. В качестве альтернативы бесклеточный компонент этих жидкостей может быть использован для молекулярного тестирования, а клеточный компонент может быть использован для тестирования, требующего интактных клеток, т.е. цитопатологии и проточной цитометрии. Такой подход позволит избежать выделения отдельных аликвот этих жидкостей для каждого теста, что может поставить под угрозу чувствительность каждого теста для обнаружения VRL. Учитывая успех этого метода в стекловидном и водном образцах, этот метод также может быть полезен в других ограниченных жидкостях для увеличения количества ДНК, доступной для молекулярного тестирования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-Пропанол (Изопропанол)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Раствор для лизиса клеток	Qiagen	158906
Раствор для гидратации ДНК Gentra Puregene	Qiagen	158916
Раствор для осаждения белка Gentra Puregene	Qiagen	158912
фосфатно-солевой буфер (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Набор для мочи	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; также включает очищающие гранулы, протеиназу К и спиновые колонки
Ultrapure Glycogen, 20 и микро; g/µ L (20 мг/мл)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010