Методическая статья

Выделение, экстракорпоральная экспансия и характеристика мезенхимальных стволовых клеток из эпидидимальной жировой ткани яичка мыши

DOI:

10.3791/65722

⸱

12 января 2024 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жировая ткань является отличным источником мезенхимальных стволовых клеток. В этой статье мы рассмотрим пошаговую экстракцию, культивирование и характеристику стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC), полученных из придатков яичка швейцарских мышей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) широко изучаются в качестве нового терапевтического подхода, в основном для остановки обострения воспаления из-за их способности модулировать иммунный ответ. МСК являются иммунопривилегированными клетками, способными выживать у иммунологически несовместимых аллогенных реципиентов трансплантата на основе низкой экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и при использовании клеточной терапии для аллогенной трансплантации. Эти клетки могут быть выделены из нескольких тканей, наиболее часто используемыми являются костный мозг и жировые ткани. Мы предоставляем простой протокол для выделения, культивирования и характеристики МСК из придатковой жировой ткани мышей. Жировая ткань придатка яичка хирургическим путем иссекается, физически фрагментируется и переваривается 0,15% раствором коллагеназы II типа. Затем первичные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSCs), культивируют и размножают in vitro, а фенотипическую характеристику выполняют с помощью проточной цитометрии. Мы также предлагаем шаги по дифференцировке ADSC на остеогенные, адипогенные и хондрогенные клетки с последующей функциональной характеристикой каждой клеточной линии. Представленный здесь протокол может быть использован для экспериментов in vivo и ex vivo , а в качестве альтернативы стволовые клетки, полученные из жировой ткани, могут быть использованы для создания МСК-подобных иммортализованных клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой взрослые мультипотенциальные клетки, дифференцирующие в такие клетки, как остеобласт, хондробласт и адипоцит 1,2. Эти клетки находятся в нескольких органах, и благодаря этому они могут быть извлечены из тканей взрослого человека, таких как костный мозг, мышцы, жир, волосяной фолликул, корень зуба, плацента, дерма, надхрящница, пуповина, легкие, печень и селезенка 3,4.

Сообщалось о влиянии МСК на физиологию и иммунную систему 5,6. Эти клетки оказались перспективными для лечения ряда заболеваний, как в медицине человека, так и в ветеринарии. МСК могут контролировать воспаление и способствовать ангиогенезу и тканевому гомеостазу с помощью различных механизмов, таких как межклеточный контакт, растворимые факторы и небольшие внеклеточные везикулы 7,8,9,10. Кроме того, МСК являются иммунопривилегированными клетками, способными выживать у иммунологически несовместимых аллогенных реципиентов трансплантатов, поскольку эти клетки демонстрируют низкую экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и используются в клеточной терапии для аллогенной трансплантации11,12. Низкая иммуногенность в сочетании с регенеративным потенциалом делает МСК идеальными кандидатами для клеточной терапии, такой как реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ)13, системная красная волчанка (СКВ)14 и рассеянный склероз15, средипрочих 16,17.

Несмотря на то, что МСК находятся в нескольких тканях взрослого человека, жировая ткань имеет преимущества перед другими источниками, такие как доступность для забора, при минимальном хирургическом вмешательстве; большое количество доступных ячеек с высокой скоростью расширения; и простое расширение in vitro с использованием простого в исполнении протокола без необходимости использования специального оборудования и недорогих материалов 18,19,20. После извлечения стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), должны быть охарактеризованы как установленные Международным обществом клеточной терапии (ISCT)21. Таким образом, МСК должны демонстрировать морфологическую фибробластоподобность, адгезию к пластической культуре, экспрессию высокого процента (≥95%) мезенхимальных маркеров, таких как эндоглин (CD105), экто-5'-нуклеотидаза (CD73) и Thy-1 (CD90), и низкий процент (≤2%) гемопоэтических маркеров, таких как общий антиген лейкоцитов (CD45), трансмембранный фосфогликопротеин (CD34), гликолипид-заякоренный мембранный гликопротеин (CD14), интегрин альфа-М (CD11b), альфа-цепь, ассоциированный с рецептором антигена В-клеток (CD79α) или В-лимфоцитарный поверхностный антиген B4 (CD19) и человеческий лейкоцитарный антиген II класса (HLA-II). Кроме того, требуется функциональная характеристика, и клетки должны быть способны дифференцироваться в остеобластные, хондробластные или адиобластные клетки21.

Здесь мы показываем, как получить МСК из жировой ткани придатка яичка с помощью механической диссоциации и ферментативного расщепления для исследований in vitro и морфологической характеристики, предварительно полученной с помощью МСКТ.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с международными рекомендациями по этике животных и были одобрены институциональными комитетами по уходу и использованию Государственного университета Санта-Крус под номером 021/22. Швейцарские самцы мышей (6-8 недель) были приобретены в Лаборатории разведения, содержания и экспериментов животных Исследовательского центра Государственного университета Санта-Круз (LaBIO-UESC) в специальных условиях, свободных от патогенов, получая воду и пищу в неограниченном количестве с 12-часовыми циклами света/темноты.

ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другую линию мышей; Мы рекомендуем использовать взрослым мышам (6-8 недель), так как у них более развита жировая ткань и клетки с высокой пролиферативной активностью.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем продолжить, приготовьте следующие реагенты, описанные ниже. Информацию о реагентах и поставщиках материалов см. в Таблице материалов . Во всех практических процедурах необходимо носить средства индивидуальной защиты, такие как маски, шапки, лабораторные халаты и перчатки.

  1. Экстракция эпидидимальной жировой ткани
    1. Запасите материалы для операции: три комплекта стерильных пинцетов и ножниц, пять игл и стакан, содержащий 200 мл 70% этанола.
    2. Приготовьте терминальный анестетик, смешав кетамин (100 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг).
  2. Культура ADSC
    1. Базальная среда: Приготовьте модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.
    2. Раствор для разложения: Приготовьте 0,15% коллагеназы II типа в PBS, стерилизованных в фильтре 0,25 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости использовать четыре антибиотика, описанные в базальной среде. Это будет зависеть от условий культивирования клеток в лаборатории, где это выполняется.
  3. Фенотипическая характеристика ADSC
    1. Приготовьте 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в PBS.
    2. Разбавьте антитела против мыши, как указано в таблице 1.
    3. Приготовьте 2% формальдегид в PBS.
  4. Остеогенная дифференцировка ADSCs
    1. Остеогенная среда для дифференцировки: Приготовьте DMEM с добавлением 5,67 М аскорбиновой кислоты, 10 нМ дексаметазона, 0,02 М β-глицерофосфата, 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
    2. Для окрашивания по Фон Коссе приготовьте следующие растворы: 70% этанола в воде, 5% нитрата серебра в воде, дистиллированной воде, 5% тиосульфата натрия в воде и 1% эозина B в воде.
  5. Адипогенная дифференцировка:
    1. Среда для адипогенной дифференцировки: Приготовьте DMEM с добавлением 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина, 200 мкМ индометацина, 1 мкМ дексаметазона, 10 мкМ инсулина, 10% FBS и 1 % пенициллина/стрептомицина.
    2. Для окрашивания Oil-red приготовьте следующие растворы: 10% формалин в деионизированной воде, 60% изопропанол в деионизированной воде, лизохром (жирорастворимый краситель), диазокраситель (раствор Oil-Red O) в 60% изопропаноле, и 1% гематоксилин в деионизированной воде.
  6. Хондрогенная дифференцировка:
    1. Среда для хондрогенной дифференцировки: Приготовьте хондрогенную среду с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
    2. Приготовьте 10% формальдегид в PBS.
    3. Для окрашивания протеогликанами и гликозаминогликанами готовят следующие растворы: краситель гетерогликан (Alcian Blue 1%) в уксусной кислоте, pH 2,5, парафин, гематоксилин, разведение этанолевого ряда в воде (100%, 96%, 80%, 70%).

Антитела/флуорофорыРазбавлениеКлонКонечная концентрация (мкг/мл)Функция и ячейка, в которой она экспрессируется
КД34- ПЭ1:100Оперативная память342Фактор адгезии клеток. Гемопоэтические стволовые клетки.
CD45- БТР1:10030-F112Ассистирование в активации лейкоцитов. Выражается в лейкоцитах.
CD71-FITC1:100С25Контролирует поглощение железа во время пролиферации клеток. Пролиферирующие клетки, ретикулоциты и клетки-предшественники.
CD29-FITC1:100Ха2/55Адгезия и активация, эмбриогенез, лейкоциты, дендритные клетки, тромбоциты, тучные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки.
CD90- ПерХПФ1:100ОКС-72Сигнализация, сцепление. Т-лимфоциты, NK, моноциты, гемопоэтические стволовые клетки, нейроны и фибробласты.

Таблица 1: Антитела, используемые для фенотипической характеристики ADSC с помощью проточного цитометра. Список антител с соответствующими флуорохромами, разведениями, клоном и конечной концентрацией, а также их функцией в экспрессируемой клетке.

2. Методы

ПРИМЕЧАНИЕ: Жировая ткань распределяется по всему телу в подкожном или внутрибрюшном расположении. У мышей наиболее распространенными жировыми тканями, используемыми для экспериментов, являются подкожная эпидидимальная, брыжеечная и забрюшинная22. Здесь показаны этапы получения жировой ткани придатка яичка (рисунок 1).

figure-protocol-1
Рисунок 1: План эксперимента по получению стволовых клеток, полученных из жировой ткани швейцарских мышей. (A) С помощью игл поместите животное на пробковую или пенопластовую доску; (Б) Подтяните кожу с помощью пинцета, сделайте надрез в центре брюшной области и отделите кожу от брюшины; (В) определить белую жировую ткань над придатком яичка; (D) перенести ткань в среду DMEM с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков, тщательно промыть придатковую жировую ткань PBS и перевести ткань в раствор для переваривания; Е) фрагментировать ткань и F) инкубировать при 37°С в течение 1 ч, энергично встряхивая каждые 10 мин; (G) после подсчета клеток поместить в 6-луночные планшеты и наблюдать за морфологией клеток под перевернутым микроскопом. (F) Морфология клеток изменится с круглой на фибробластоподобную. Масштабная линейка = 22,22 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Экстракция придатка яичка и яичка жировой ткани
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что все процедуры должны проводиться в стерильных условиях в ламинарном шкафу, чтобы обеспечить чистую и свободную от загрязнения культуру клеток.
    1. Усыпляют животных с использованием раствора кетамина и ксилазина (100 и 10 мг/кг, как описано в шаге 1.1.2) внутрибрюшинным путем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать и другие методы эвтаназии23. Убедитесь в том, что животное мертво, подтвердив отсутствие сердцебиения.
    2. Поместите животное брюшной стороной вверх на пробковую или пенопластовую доску, покрытую алюминиевой фольгой, и зафиксируйте его с помощью стерильных игл (рисунок 1А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнения распылите 70% спирт в область живота. В качестве альтернативы можно сбрить волосы с помощью скальпеля.
    3. Подтяните кожу с помощью пинцета в центре брюшной области и сделайте надрез стерильными ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнения необходимы два комплекта стерильных пинцетов и ножниц. Первый используется для вскрытия животного, разрезания кожи и брюшинного слоя; Второй используется для забора жировой ткани придатка яичка. Кроме того, оставьте 150 мл 70% спирта в стакане для очистки ножниц и пинцета между шагами.
    4. Введите ножницы под кожу животного и откройте его, чтобы отделить от брюшины (рисунок 1B). Поднимите брюшинный слой с помощью пинцета и разрежьте стерильными ножницами.
    5. Используйте еще один набор стерильных пинцетов и ножниц и определите придаток яичек над яичками и белую жировую ткань над придатком яичка. Вытяните всю жировую ткань придатка яичка с помощью стерильного пинцета, размером примерно 2 см, и разрежьте очень близко к придатку яичка (рисунок 1В).
    6. Поместите жир в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл с базальной средой и положите ее на лед (Рисунок 1D). В капюшоне перейдите к следующим шагам, как описано ниже.
  2. Выделение стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте образцы в капюшоне с ламинарным потоком класса II по биологическому признаку, персонал должен быть одет в лабораторный халат, перчатки и хирургическую маску.
    1. Тщательно промойте жировую ткань придатка яичка с помощью PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для удаления крови и других частиц из образца. Кровь может ингибировать фермент коллагеназу II типа и поставить под угрозу эксперимент.
    2. С помощью стерильного пинцета перенесите жировую ткань придатка яичка в пробирку объемом 50 мл, содержащую 15-20 мл раствора для расщепления, приготовленного на шаге 1.2.2. Фрагментируйте ткань с помощью стерильных ножниц и инкубируйте ткань при температуре 37 °C в течение 1 ч (рис. 1E, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно использовать водяную баню или инкубатор при температуре 37 °C. Каждые 10 минут суспензию необходимо энергично встряхивать, чтобы облегчить пищеварение. Не продлевайте время инкубации на 1 час.
    3. Инактивируйте коллагеназу, разбавив образец в соотношении 1:1 в базальной среде, и центрифугируйте суспензию при 250 х г в течение 10 мин при 4 °С для получения сосудистой фракции стромы. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл базальной среды.
    4. Проверьте жизнеспособность и подсчитайте клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя в камере Нойбауэра с использованием разведения 1:10 или 1:100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход составляет около 0,5-1 миллиона клеток/г переработанной жировой ткани и жизнеспособность 80%.
    5. Выделенные клетки (0,3-0,5 млн) наносят в 3 мл базальной среды в одну лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C с 5 % CO2.
    6. На следующий день: Достаньте среду из лунки и промойте клетки PBS. Добавьте 3 мл базальной среды. Повторяйте этот процесс каждые 2 дня до тех пор, пока клетки не станут сливаться на 90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда наблюдайте за морфологией клеток под инвертированным микроскопом, меняющейся от круглой до фибробластоподобной (Рисунок 1H).
  3. Экспансия стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только клетки вырастут на ~90% сливающимися, приступайте к субкультуре, как описано ниже.
    1. Достаньте среду из лунки и промойте ячейки PBS. Добавьте 0,5 мл/лунку трипсина/ЭДТА (0,05 % трипсина; 200 мг/л ЭДТА) и инкубируйте планшет в течение 3-5 минут при 37 °C для отделения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не принимайте трипсин/ЭДТА более 5 минут. Полная отслойка клеток должна быть проверена под инвертированным микроскопом. Процесс можно ускорить, осторожно пипетируя вверх и вниз или постукивая по боковой стороне планшета.
    2. Инактивировать фермент путем разведения образца в соотношении 1:1 в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков.
    3. Разделите клеточную суспензию на 2 лунки и добавьте 3 мл базальной среды (DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % антибиотиков). Инкубировать в течение ночи при 37 °C с 5%CO2.
    4. Меняйте среду на следующий день, затем каждые 2 дня до 90% слияния.
    5. Повторяйте процесс до третьего прохода и приступайте к фенотипизации и функциональной характеристике.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда наблюдайте за морфологией клеток под инвертированным микроскопом, меняющейся от круглой до фибробластоподобной.
  4. Характеристика стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC)
    1. Фенотипическая характеристика методом проточной цитометрии
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА, как описано в шагах с 2.3.1 по 2.3.2.
      2. Соберите клетки в коническую пробирку (50 мл) и центрифугируйте при температуре 250 x g в течение 10 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS.
      3. Подсчитайте клетки, как описано на шаге 2.2.4, и затравите 0,5-1 x 106 клеток в 100 мкл PBS в 96-луночный планшет.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество лунок будет зависеть от цвета конъюгата флуорохрома и фильтров/лазеров цитометра.
      4. Добавьте антитела (табл. 1), разведенные в 1% BSA в PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости использовать Fc-блок, чтобы избежать неспецифического связывания, потому что мы уже используем BSA для разбавления антител. Резервируйте образец клеток без получения антител, которые будут использоваться в качестве контроля окрашивания. Антитела могут быть объединены в одной лунке в соответствии с флуорохромовым красителем и цитометром, доступными в лаборатории. Все антитела, описанные в таблице 1 , могут быть добавлены в одну и ту же лунку, за исключением CD71 FITC и CD29 FITC, которые должны находиться в разных лунках из-за одного и того же флуорохрома.
      5. Выдержать тарелку в течение 30 минут при температуре 4 °C в темноте.
      6. Промойте ячейки, затем заполните объем до 200 μL с помощью PBS, центрифугируйте планшет при 252 x g в течение 10 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг еще раз.
      7. Закрепите ячейки, добавив 200 мкл 200 мкл 2% формальдегида в PBS на лунку. Храните клетки в темноте при температуре 4 °C до анализа в проточном цитометре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов как можно скорее получите клетки на проточном цитометре. Яркость флуоресценции маркеров значительно снижается через 48 ч для большинства флуорохров. Так, не превышайте 48 ч для считывания показаний на табличке. Рекомендуется приобрести 30 000 мероприятий.
      8. Используйте стратегию стробирования, представленную на рисунке 2B , для выбора популяции ASC.
    2. Функциональная характеристика: остеогенная дифференцировка
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА (как описано в шагах 2.3.1 - 2.3.2), соберите и центрифугируйте клетки (как описано в шагах 2.4.1.2 и 2.4.1.2) и подсчитайте их (как описано в шагах 2.2.4).
      2. Планшет, в трех экземплярах, 2 x 105 клеток на лунку в 6-луночных планшетах в базальном медиальном диапазоне (DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % антибиотиков); инкубировать при 37 °C с 5%CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуются два 6-луночных планшета, по одному на каждое время дифференцировки (14 и 21 день).
      3. На следующий день смените среду на остеогенную среду (шаг 1.4.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: резервировать 3 лунки при культивировании только базальной средой, которая будет являться контролем для дифференциации.
      4. Культивируют клетки в течение 14 и 21 суток в остеогенных средах и контрольных клетках, меняя среды каждые 3 суток. Приступайте к окрашиванию по методу фон Косса (шаг 1.4.2) для оценки минерализованных конкреций в конце каждого периода культивирования.
      5. Отсадите среду из каждой лунки и дважды промойте клетки PBS. Зафиксируйте ячейки 2 мл 70% этанола на ночь при комнатной температуре (RT). Тщательно промойте клетки в проточной воде.
      6. Добавьте 2 мл 5% раствора нитрата серебра и инкубируйте планшет в ультрафиолете в течение 1 ч. Промойте клетки дистиллированной водой. Добавьте 2 мл 5% тиосульфата натрия и выдерживайте 5 минут. Умываем дистиллированной водой.
      7. Контрокрашивание 2 мл эозина в течение 40 с. Промойте дистиллированной водой до тех пор, пока раствор для окрашивания не будет удален, и визуализируйте окрашивание с помощью оптического микроскопа.
    3. Функциональная характеристика: Адипогенная дифференцировка
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА (как описано в шагах 2.3.1 - 2.3.2), соберите и центрифугируйте клетки (как описано в шагах 2.4.1.2 и 2.4.1.2) и подсчитайте их (как описано в шагах 2.2.4).
      2. Планшет 2 х 10по 5 клеток в лунку в 6-луночных планшетах в базальном медиальном диапазоне (DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % антибиотиков); инкубировать при 37 °C с 5%CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуются два 6-луночных планшета, по одному на каждое время дифференцировки (14 и 21 день).
      3. На следующий день смените среду на адипогенную среду (шаг 2.5.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Резервировать 3 лунки, культивируя только базальную среду в качестве контроля.
      4. Культивируют клетки в течение 14 и 21 суток в адипогенной среде, меняя среды каждые 3 суток. В конце каждого периода культивирования приступают к окрашиванию Oil-Red O (шаги 2.4.3.5-2.4.3.7), индикатору внутриклеточного накопления липидов.
      5. Отсасывайте среду из каждой лунки. Дважды промойте клетки PBS. Зафиксируйте клетки в 2 мл 10% формалина на 1 ч. Умойтесь один раз PBS, а затем один раз водой.
      6. Окрашивать 2 мл раствора Oil-Red O в 60% изопропаноле в течение 5 минут. Один раз промыть дистиллированной водой.
      7. Противокрасить 2 мл 1% гематоксилина, разведенного в соотношении 1:2 в дистиллированной воде в течение 1 мин. Промойте дистиллированной водой до тех пор, пока раствор для окрашивания не будет удален, и визуализируйте окрашенные образцы с помощью оптического микроскопа.
    4. Функциональная характеристика: хондрогенная дифференцировка
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА (как описано в шагах 2.3.1 - 2.3.2), соберите и центрифугируйте клетки (как описано в шагах 2.4.1.2 и 2.4.1.2) и подсчитайте их (как описано в шагах 2.2.4).
      2. Поместите 5 x 105 ADSC в четыре полипропиленовые конические пробирки и центрифугируйте при 450 x g в течение 5 минут для получения гранулы. Выбросьте надосадочную жидкость.
      3. Гранулы культивируют в конической трубке в хондрогенной среде (стадия 1.6.1) или только в базальной среде (контроль дифференцировки) в течение 14 и 21 суток при 37 °С в 5%СО2. Меняйте среду каждые 3 дня и избегайте удаления гранул.
        Примечание: Каждая клеточная гранула относится к каждому времени культивирования, а также к их соответствующему контролю, выращенному только с базальной средой.
      4. В конце каждого этапа культивирования соберите гранулы с помощью пинцета с тонким наконечником и поместите их в 24-луночный планшет. Приступают к гистологическому срезу и окрашиванию протеогликанов и гликозаминогликанов (этапы 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая гранула обрабатывается в отдельной лунке.
      5. Зафиксировать гранулы в 2 мл 10% буферизованного формальдегида на 30 мин. Выбросьте раствор формальдегида и добавьте 2 мл 70% этанола. Извлеките гранулу из конической трубки с помощью наконечника и заделайте гранулы в парафин.
      6. С помощью вращающегося парафинового микротома делают гистологические срезы размером 5 мкм. Инкубируйте секции в течение 15 минут при температуре 60 °C и дважды погрузите их в ксилол (на 5 и 15 минут).
      7. Регидратация образцов путем погружения гистологических срезов в спиртовые ванны при убывающих концентрациях (100%, 96%, 80% и 70%) на 2 мин каждая, затем промывание деионизированной водой в течение 5 мин.
      8. Приступайте к окрашиванию образцов альцианским синим 1% в уксусной кислоте, pH 2,5, в течение 30 минут.
      9. Закрасьте гематоксилином в течение 1 минуты, и промойте дистиллированной водой. Монтируйте с помощью DPX (монтант для гистологии) или другого решения для монтирования и визуализируйте образцы с помощью оптического микроскопа.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки, выделенные из жировой ткани в соответствии с представленным здесь протоколом, показали морфологию, соответствующую минимальным критериям для МСК, предложенным ISCT. Обзор протокола показан на рисунке 1. Фенотипически ADSC продемонстрировали приверженность к пластической и фибробластоподобной морфологии в первые дни культивирования клеток (рисунок 2A). Кроме того, они однородно росли и образовывали колонии. Кроме того, ADSC показали низкую экспрессию CD34 (2,12%) и CD45 (1,81%), обоих гемопоэтических маркеров, и высокую экспрессию CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) и CD90 (55,1%), все маркеры мезенхимальных клеток (рис. 2B).

figure-results-1
Рисунок 2: Фенотипическая характеристика клеток, полученных из жировой ткани. (A) Морфология ADSC изменяется от круглой до фибробластоподобной на 2, 4 и 8 день культивирования; масштабная линейка = 22,22 мкм. (B) Гистограммы для маркеров, экспрессируемых (CD71, CD29 и CD90) или не экспрессирующих (CD34 и CD45) с помощью ASC. Этот рисунок был воспроизведен с разрешения Miranda et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Функционально ADSC продемонстрировали мультипотенцию для дифференцировки в остеобласт, адипобласт и хондропласт при культивировании в кондиционированной среде для каждой линии в течение 14 или 21 дня (рис. 3). Окрашивание по методу фон Косса выявило минерализованные узелки во внеклеточном матриксе, характерные для процесса остеогенеза (рис. 3). Окрашивание Oil-red O показало наличие липидных вакуолей в цитоплазме ADSC, а окрашивание Alcian Blue подтвердило присутствие гликозаминогликана во внеклеточном матриксе (Рисунок 3). В совокупности фенотипические и функциональные характеристики подтвердили популяцию клеток, выделенных из жировой ткани придатка яичка в виде МСК.

figure-results-2
Рисунок 3: Функциональная характеристика клеток, полученных из жировой ткани. Остеогенный, адипогенный и хондрогенный мультилинейный потенциал ADSC после 14 и 21 дня культивирования. Масштабная линейка = 50 мкм (верхняя панель), 100 мкм (средняя и нижняя панели). Этот рисунок был воспроизведен с разрешения Miranda et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

МСК могут быть извлечены из различных тканей. Несмотря на то, что костный мозг является общим источником МСК как у мышей, так и у человека25,26, мы решили работать с жировой тканью в этом исследовании из-за ее богатства МСК, распределения в организме и легкости доступа к ней. В качестве альтернативы, стволовые клетки, полученные из жировой ткани, могут быть использованы для получения МСК-подобных иммортализованных клеток27.

Некоторые моменты извлечения заслуживают особого внимания в связи с успехом протоколов, которыми здесь поделились. Во-первых, мы выделяем тщательность сбора ткани, которую необходимо проводить в асептических условиях. Поэтому убедитесь, что мыши должным образом продезинфицированы 70% спиртом перед началом операции. Еще один важный момент – не использовать один и тот же набор пинцетов и ножниц для забора придатковой жировой ткани, тем самым избегая любого источника загрязнения.

Вторая проблема – это обработка тканей. Фрагменты в конической трубке необходимо правильно и энергично встряхнуть в течение 10 минут инкубации при температуре 37 °C. Очень важно менять среду на следующий день и далее каждые 2-3 дня. Рекомендуется ежедневно наблюдать за культурой, проверяя цвет среды, форму клеток, а также наличие каких-либо помех в окружающей среде культуры.

Третья проблема связана с лучшим временем/прохождением для характеристики MSC. Здесь мы рекомендуем делать это при третьем прохождении ячеек, но это не является обязательным. Это зависит от цели исследования. В третьем отрывке мы имеем около 80% клеток, характеризуемых как МСК, что, например, достаточно для целей этого исследования. Фенотипическую характеристику проводят путем анализа экспрессии гемопоэтических маркеров (например, CD34 и CD45) и мезенхимальных маркеров (например, CD29, CD73, CD90 и CD105). Кроме того, Международное общество клеточной и генной терапии (ISCT)21 подчеркивает, что ADSC должны иметь фибробластоподобную морфологию и прилипать к пластику платформы для культивирования. Морфологию можно наблюдать под микроскопом во время выращивания культуры. Функциональная характеристика выполнена путем анализа способности ADSC дифференцироваться в клетки остеобластов, адипобластов и хондропластов. При фенотипической характеристике процентное содержание мезенхимальных и гемопоэтических маркеров может варьироваться в зависимости от вида животного и источника клеток, не полностью удовлетворяя количеству, рекомендованному МСКТ. Например, МСКТ рекомендует для МСК человека ≥95% CD105, CD73, CD90 и ≤2% CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79a или CD19, антиген лейкоцитов человека - изотип DR (HLA-DR)21. Кроме того, важно провести функциональную характеристику и подтвердить мультипотентность клеток, дифференцирующихся в остеобласты, хондроциты и линии адипоцитов. По крайней мере, две из этих линий рекомендуются для доказательства мультипотентности.

В дополнение к этим выделенным моментам, некоторые предложенные здесь анализы могут быть заменены, например, Ализарин красный S вместо окрашивания фон Косса, Периодический кислотный шифф вместо Алкийского синего и полимеразная цепная реакция (ПЦР) вместо проточной цитометрии.

Среди трех типов жировой ткани, описанных у человека (белый, коричневый и бежевый), белая жировая ткань имеет самый высокий источникMSCs 28. Эта ткань может быть получена из подкожной, абдоминальной и паховой областей, таких как жир над придатком яичка, о котором здесь сообщается. Физическая фрагментация и ферментативное расщепление коллагеназой, используемые в представленном здесь протоколе, приводят к получению стромальной васкулярной фракции (SVF), состоящей из многих типов клеток, за исключением адипоцитов, которые истощаются во время обработки.

В заключение следует отметить, что к основным преимуществам использования жировой ткани в качестве источника МСК можно отнести их обилие и простоту методов выделения клеток, что связано с терапевтическим потенциалом МСК в качестве противовоспалительных и регенеративных свойств.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование поддержано грантом Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) и Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Это исследование было частично профинансировано PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG и URS благодаря стипендии, предоставленной Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) соответственно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
140 ° C Высокотемпературная стерилизация CO2Инкубатор RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, КитайC180
3-изобутил-1-метилксантинSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАI7018
Уксусная кислота ледниковаяSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США PHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАA9186Биореагент, подходит для обнаружения гликопротеинов. 1% в уксусной кислоте, pH 2,5
Спирт 70%Sigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США65350-M70% в воде
Амфотерицин BSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США PHR1662
Антитела против мыши anti-CD29 FITC (Клон Ha2/5)BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США555005Функции в клетке: Адгезия и активация, эмбриогенез, лейкоциты, ДК, тромбоциты, тучные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки
Антитела против мышей anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США 551387Функции в клетке: Фактор клеточной адгезии. Гемопоэтические стволовые клетки
Антитела против мышиного анти-CD45 APC (Клон 30-F11)BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США559864 Функции в клетке: Способствует активации лейкоцитов
Антитела против мышей анти-CD71 FITC (клон C2)BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США553266Функции в клетке: Контролирует поглощение железа во время пролиферации клеток. Пролиферирующие клетки, ретикулоциты и предшественники
Антитела против мыши anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США557266Функции в клетке: Сигнализация, адгезия. Т-лимфоциты, NK, моноциты, ГСК, нейроны, фибробласты
Аскорбиновая кислотаSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАPHR1008
Автоматические пипеткиThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP)
Наборы стакановНе применимо1 единица
бычьего сывороточного альбуминаSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАA7906
Планшеты для клеточных культур (6-луночные)Merck, Дармштадт, ГерманияZ70775907 единиц стерильные. Планшеты для культивирования тканей ТТП Планшеты
культивирования клеток (96-лунка. Круглое или V-образное дно)Merck, Дармштадт, ГерманияCLS35307701 единица стерильная. Скважины, 96, обработанная тканевой культурой (ТК) поверхность, круглое дно прозрачных лунок, стерильная
хондрогенная средаСтвол Про Хондрогенез Дифференциация– Life TechnologiesA1007101TGF-β 2, TGF-β 3, дексаметазон, инсулин, трансферрин, ITS, натрий-1 - аскорбат, пируват натрия, аскорбат-2-фосфат
Коллагеназа типа IILife Technologies, Калифорния, США 17101015
пробковой или пенополистирольной плиты, покрытой алюминиемНе применимо1 единица
хлопкаНе применимо50 г
ДексаметазонаSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАD4902
Ножницы для препарированияНе применимо03 шт. стерильный
DPX Монтант для гистологииSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США6522
Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда (DMEM)Sigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАD5523С глюкозой 1000 мг/л и L-глутамином, без бикарбоната натрия, порошок, подходит для клеточной культуры
Eosin BSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США 861006
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАF4135
ФормальдегидSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США47608
ФормалинСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАHT501128
ГентамицинСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАG1397
ГематоксилинСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАH3136
(0,3 мм x 13 мм)Неприменимо5 единиц
ИндометацинСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАI0200000
ИнсулинСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАI3536
ИзопропанолСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, США 56393570% в H2O
растворе кетамина-D4 гидрохлоридаСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАK-0061,0 мг/мл в метаноле (в качестве свободного основания), сертифицированный эталонный материал, Cerilliant®
Камера НойбауэраSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАBR718620счетная камера BRAND BLAUBRAND шаблон Нойбауэра. С зажимами,
наконечники для пипеток Nichiryo с двойной линейкой (0,1– 10 μ L)Merck, Дармштадт, ГерманияZ645540Диапазон объема 0.1– 10 μ L, удлиненная, насыпная упаковка. Стерильные
наконечники для пипеток Nichiryo (1– 10 мл)Merck, Дармштадт, ГерманияZ717401Диапазон объема 1– 10 мл, универсальный, насыпная упаковка. Стерильные
наконечники для пипеток Nichiryo (200 μ L)Merck, Дармштадт, ГерманияZ645516Максимальный объем 200 μ L, градуированный, министек. Стерильное
масло - красный O растворSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАO13910,5% в изопропаноле
ПарафинSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США107,15146– 48, в блочной форме
Пенициллин/стрептомицинSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАРаствор P4333стабилизированный, с 10 000 единиц пенициллина и 10 мг стрептомицина/мл, 0,1 мкм; m фильтрованный, БиоРеагент, подходит для клеточной культуры
Фосфатно-солевой буферный раствор 1х (PBS).Sigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАP3813Порошок, pH 7,4, для приготовления растворов объемом 1 л. Сбалансированные и стерильные
полипропиленовые конические пробирки (15 мл)Falcon, Fisher Scientific14-959-53AСтерильные
полипропиленовые конические пробирки (50 мл)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 шт. стерильный
скальпель (опционально)Не применимо1 шт.
Нитрат серебраSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США85228
Тиосульфат натрияSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, США72049
Хирургический пинцет (15 см)Не применимо3 единицы стерильных
швейцарских самцов мышей (6– 8 недель)Bioterium, Государственный университет Санта-Крус021/22
шприц (1 мл)Не применимо1 единица
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАT81540,4%, жидкий, стерильно-фильтрованный, подходит для клеточной культуры
Трипсин/ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)Sigma-Aldrich, Сан-Луис, Миссури, СШАT3924
КсилазинСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАPHR3263
&бета;-глицерофосфат динатриевой соли гидратСигма-Олдрич, Сан-Луис, Миссури, СШАG9422BioUltra, подходит для клеточной культуры, подходит для растительных клеточных культур, ≥ 99% (титрование)
для Игла для подкожных инъекций

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Stem Cell IsolationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationAdipogenic DifferentiationChondrogenic DifferentiationCollagenase DigestionMouse Epididymal Tissue

Похожие статьи