Method Article

Сравнение двух репрезентативных методов дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стромальные клетки

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает и сравнивает два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой. Метод эмбриоидных телец (ЭБ) характеризуется меньшими затратами времени.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) – это взрослые плюрипотентные стволовые клетки, которые широко используются в регенеративной медицине. Поскольку МСК, полученные из соматических тканей, ограничены ограниченным донорством, вариациями качества и биобезопасностью, в последние 10 лет наблюдается значительный рост усилий по получению МСК из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Прошлые и недавние усилия по дифференцировке ИПСК в МСК были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (ЭБ) и (2) использование монослойной культуры. В этом протоколе описаны эти два репрезентативных метода получения МСК из ИПСК. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, включая время, стоимость, способность клеток к пролиферации, экспрессию маркеров МСК и их способность к дифференцировке in vitro. Этот протокол демонстрирует, что оба метода могут извлекать зрелые и функциональные МСК из ИПСК. Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой, в то время как метод EB характеризуется меньшими затратами времени.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) представляют собой взрослые плюрипотентные стволовые клетки, полученные из мезодермы1. МСК присутствуют практически во всех соединительных тканях2. С тех пор, как МСК были впервые обнаружены в 1970-х годах и успешно выделены из костного мозга в 1987 году Friedenstein et al.3,4,5, для выделения МСК использовались различные соматические ткани человека (включая эмбриональные и взрослые), такие как кости, хрящи, сухожилия, мышцы, жировая ткань и поддерживающая кроветворение строма

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поддержание ИПСК

  1. Размораживание ИПСК
    1. Выньте клетки из жидкого азота и быстро разморозьте клетки на водяной бане с температурой 37 °C. Переложите размораживающие ячейки в пробирку объемом 15 мл, приготовленную с 3 мл поддерживающей среды для ИПСК (таблица материалов). Аккуратно перемешайте средство.
    2. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте клетки в 1 мл поддерживающей среды для поддержания ИПСК с 10 мкМ Y-27632 (пипетками вверх и вниз 2-3 раза).
    3. Перенесите клеточную суспензию в 6-луночный планшет для культуры тканей, покрытый гел....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с протоколом (рис. 1А) ИПСК дифференцировали в МСК методами формирования ЭБ и монослойного культивирования. Во время дифференцировки клетки демонстрировали различную репрезентативную морфологию (рис. 1B, C).

Как показано на рисунке 1B, колонии ИПСК демонстрируют типичную компактную морфологию до дифференцировки с четкой границей, состоящей из плотно упакованных клеток. Одно.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном протоколе были рассмотрены два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в МСК 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Оба метода были способны выводить МСК из ИПСК. МСК, полученные из.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Мы благодарны Национальному клиническому исследовательскому центру детского здоровья за огромную поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Набор для окрашивания в красный цвет АлизаринBeyotime  BiotechnologyC0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
Аскорбиновая кислотаSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Шейкер уровня углекислого газаКристаллCO-06UC6
Компенсационные бусиныBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL Technology07959
ДексаметазонBeyotime  БиотехнологияST1254
DMEM/F12  средаServicebioG4610
Фетальная бычья сывороткаHAKATAHS-FBS-500
FGF2Стволовая клетка78003.1
ЖелатинSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
человека контроль изотипа IgG1 APCBioLegend403505
контроль изотипа IgG1 человека FITCBioLegend403507
контроль изотипа IgG1 человека PEBioLegend403503
TGF-&beta человека; 1стволовая клетка78067
TruStain человека FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  БиотехнологияST1398
ИндометацинSolarbioSI9020
ИнсулинBeyotime  БиотехнологияP3376
Среда для поддержания iPSCSTEMCELL Technology85850
ITS Медиа ДобавкаBeyotime  BiotechnologyC0341-10mL
Matrigel, сниженный фактор ростаBD Corning354230
Oli Red O набор для окрашиванияBeyotime  БиотехнологияC0158S
ProlineSolarbioP0011
Пируват натрияThermoFisher11360-070
TGFβ 3NovoproteinCJ44
Набор для окрашивания толуидиновым синимSolarbioG2543
Фермент TrypLE Express (1x) Gibco12604013
Сверхнизкая насадка 6-луночная пластинаCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Стволовая клетка72304
α-MEMГиклонSH30265
&бета;-глицерофосфатSolarbioG8100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsEmbryoid Body FormationMonolayer CultureMSC DifferentiationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationSpindle Shaped MorphologyMSC MarkersRegenerative Medicine

Related Articles