Методическая статья

Сравнение двух репрезентативных методов дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стромальные клетки

DOI:

10.3791/65729

⸱

20 октября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает и сравнивает два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой. Метод эмбриоидных телец (ЭБ) характеризуется меньшими затратами времени.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) – это взрослые плюрипотентные стволовые клетки, которые широко используются в регенеративной медицине. Поскольку МСК, полученные из соматических тканей, ограничены ограниченным донорством, вариациями качества и биобезопасностью, в последние 10 лет наблюдается значительный рост усилий по получению МСК из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Прошлые и недавние усилия по дифференцировке ИПСК в МСК были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (ЭБ) и (2) использование монослойной культуры. В этом протоколе описаны эти два репрезентативных метода получения МСК из ИПСК. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, включая время, стоимость, способность клеток к пролиферации, экспрессию маркеров МСК и их способность к дифференцировке in vitro. Этот протокол демонстрирует, что оба метода могут извлекать зрелые и функциональные МСК из ИПСК. Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой, в то время как метод EB характеризуется меньшими затратами времени.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) представляют собой взрослые плюрипотентные стволовые клетки, полученные из мезодермы1. МСК присутствуют практически во всех соединительных тканях2. С тех пор, как МСК были впервые обнаружены в 1970-х годах и успешно выделены из костного мозга в 1987 году Friedenstein et al.3,4,5, для выделения МСК использовались различные соматические ткани человека (включая эмбриональные и взрослые), такие как кости, хрящи, сухожилия, мышцы, жировая ткань и поддерживающая кроветворение строма 1,2,6,7 . МСК демонстрируют высокую пролиферативную способность и пластичность дифференцироваться во многие линии соматических клеток и могут мигрировать в поврежденные и воспаленные ткани 2,8,9. Эти свойства делают МСК потенциальным кандидатом для регенеративной медицины10. Тем не менее, МСК, полученные из соматической ткани (st-МСК), ограничены ограниченным донорством, ограниченной способностью клеток к пролиферации, вариациями качества и опасениями по поводу биобезопасности в отношении возможной передачи патогенов, если таковые имеются, от доноров11,12.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) получают из взрослых клеток, перепрограммированных транскрипционными факторами (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc), которые выполняют те же функции, что и эмбриональные стволовые клетки13,14. Они могут самообновляться и обладают потенциалом дифференцировки в любой тип соматических клеток, включая МСК. По сравнению с st-МСК, ИПСК-МСК имеет преимущество неограниченного предложения, более низкой стоимости, более высокой чистоты, удобства в контроле качества, простоты масштабирования производства и модификации генов 15,16,17.

В связи с этими преимуществами ИПСК-МСК сообщалось о различных методах, приводящих к получению МСК из ИПСК. Эти методы дифференциации были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (БЭ) и (2) использование монослойных культур 11,18,19,20. В данной работе был охарактеризован репрезентативный подход для каждой из двух методологий. Кроме того, были проведены сравнения между двумя репрезентативными подходами, основанными на времени, стоимости, пролиферативной способности, экспрессии биомаркеров МСК и способности к дифференцировке in vitro.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поддержание ИПСК

  1. Размораживание ИПСК
    1. Выньте клетки из жидкого азота и быстро разморозьте клетки на водяной бане с температурой 37 °C. Переложите размораживающие ячейки в пробирку объемом 15 мл, приготовленную с 3 мл поддерживающей среды для ИПСК (таблица материалов). Аккуратно перемешайте средство.
    2. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте клетки в 1 мл поддерживающей среды для поддержания ИПСК с 10 мкМ Y-27632 (пипетками вверх и вниз 2-3 раза).
    3. Перенесите клеточную суспензию в 6-луночный планшет для культуры тканей, покрытый гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) и 2 мл поддерживающей среды для ИПСК с заранее добавленным 10 мкМ Y-27632 (примерно 4 x 10,4 клетки/см2).
    4. Культивируйте клетки в течение 5-6 дней (80%-90% конфлюенция) при 37 °C, 5%CO2 с поддерживающей средой для ИПСК меняются каждый день.
  2. Пассаж ИПСК
    1. Извлеките поддерживающую среду iPSC из 6-луночного планшета. Промойте ИПСК один раз с помощью DPBS.
    2. Добавьте 700-800 мкл 0,48 мМ раствора ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре (RT), затем удалите раствор для сбраживания. Продолжайте инкубировать при температуре 37 °C в течение 3-5 мин.
    3. Когда клетки расщепляются на листы (не переваривайте клетки на отдельные клетки), добавьте 1 мл поддерживающей среды iPSC с 10 мкМ Y-27632 для прекращения расщепления. Осторожно пипетируйте ячейки вверх и вниз 2-3 раза.
    4. Перенесите клеточную суспензию в 6-луночный планшет для культуры тканей, покрытый гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) и 2 мл поддерживающей среды для ИПСК с заранее добавленным 10 мкМ Y-27632.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент проходки колеблется от 1:6 до 1:20 (около 4 x 104 клеток/см2), а средний размер агрегации составляет примерно 50-200 мкм.
    5. Культивирование клеток до 80%-90% слияния (5-6 дней) при 37 °C, 5%CO2 при смене поддерживающих сред ИПСК каждый день.

2. Дифференциация МСК от ИПСК через образование БЭ

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод основан на предыдущей литературе 21,22,23,24. Обзор метода показан на рисунке 1. Характеристики метода сведены в таблицу 1.

  1. Приготовление среды
    1. Приготовьте среду для дифференцировки МСК, добавив α-MEM 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 нг/мл FGF2 и 5 нг/мл TGFβ.
    2. Приготовьте поддерживающую среду для МСК, добавив α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS и 1 нг/мл FGF2.
  2. Приготовление ИПСК
    1. Линии культивирования ИПСК (прохождение не менее 2-3 раз после размораживания) в поддерживающей среде ИПСК на 6-луночном планшете для культуры тканей, покрытом гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) при 37 °C, 5%СО2 до слияния 80%-90%.
  3. День 0: Формирование EB
    1. Извлеките поддерживающую среду iPSC из 6-луночного планшета. Промойте ИПСК один раз с помощью DPBS.
    2. Добавьте 700-800 мкл 0,48 мМ раствора ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин при RT, затем удалите раствор для сбраживания. Продолжайте инкубировать при температуре 37 °C в течение 3-5 мин.
    3. Когда клетки расщепляются на листы (не переваривайте клетки на отдельные клетки), добавьте 2 мл поддерживающей среды ИПСК (содержащей ингибитор породы 10 мкМ и гель внеклеточного матрикса 1:100), чтобы прекратить пищеварение.
    4. Перенесите ячейки на 6-луночную пластину с низким креплением. Засевают клетки в соотношении 2 лунки планшета для культуры тканей к 1 лунке низкой пластины для прикрепления. Инкубируют клетки в шейкере (60 об/мин) при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч до образования сферических ЭБ.
  4. День 1-7: дифференциация БЭ
    1. Переложите ЭП в центрифужную пробирку с помощью пипетки Пастера (не разрушая ЭП) и дайте ЭП естественным образом осаждиться в течение 5-10 мин при РТ. Затем удалите надосадочную жидкость.
    2. Перенесите ЭБ на 6-луночную планшет с низким креплением с 2 мл дифференцирующей среды МСК. Культивирование БЭ на шейкере при 37 °C, 5% CO2 в течение 7 дней с однократной сменой среды.
  5. День 8-17: Прививка БЭ
    1. Переложите БЭ в центрифужную пробирку с помощью пипетки Пастера (не разрушая ЭП) и дайте БЭ естественным образом осаждиться в течение 5-10 минут. Затем удалите надосадочную жидкость.
    2. Перенесите ЭБ на 6-луночный планшет, покрытый гелем во внеклеточном матриксе СКФ, с 2 мл поддерживающей среды МСК. Культивирование до 90% слияния (~10 дней) с регулярной сменой сред после адгезии клеток.
  6. День 18-День 27: созревание и расширение МСК
    1. Культуру, полученную из ЭБ, обработать раствором диссоциации при 37 °C в течение 5-10 мин (время расщепления варьируется в зависимости от наличия различных типов клеток).
    2. Когда часть клеток расщепляется в отдельные клетки, добавляют 2 мл поддерживающей среды МСК для прекращения разложения и переносят клеточную суспензию в центрифужную пробирку. Оставшиеся непереваренные клетки один раз промыть DPBS и снова переварить. Повторяйте несколько раз, пока все клетки не переварятся в отдельные клетки. Центрифугируйте клеточную суспензию при 250 x g в течение 5 мин, затем удалите надосадочную жидкость.
    3. Высейте клетки на культуральную пластину, покрытую желатином (примерно 2 x 10,5 клеток/см2). Культивирование до 90% слияния в поддерживающей среде МСК с регулярной сменой среды. Обозначим это поколение ячеек как проход 0 (P0) в этой точке.
    4. Для того, чтобы сделать МСК чистым и зрелым, продолжайте пропускать клетки дважды в соотношении 1:3 примерно через 6 дней. Большинство клеток имеют фибробластоподобную морфологию (веретенообразную).

3. Дифференциация МСК от ИПСК с помощью монослойной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод основан на предыдущей литературе 25,26,27,28. Обзор этого метода проиллюстрирован на рисунке 1. Характеристики метода сведены в таблицу 1.

  1. Приготовление среды
    1. Приготовьте поддерживающую среду для МСК, добавив α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS и 1 нг/мл FGF2.
  2. Приготовление ИПСК
    1. Культивирование линий ИПСК (пассаж не менее 2-3 раз после размораживания) в поддерживающей среде ИПСК на 6-луночном планшете для культуры тканей, покрытом гелем внеклеточного матрикса с пониженным фактором роста (СКФ) (1:100) при 37 °C, 5%СО2 до слияния 50%-60%.
  3. День 0-День 13: Дифференциация по прямым однослойным культурам
    1. Извлеките поддерживающую среду iPSC из 6-луночного планшета.
    2. Непосредственно добавьте 2 мл поддерживающей среды МСК и культивирование в течение 14 дней при 37 °C, 5%CO2, при ежедневной смене среды.
  4. День 14-35: созревание МСК при повторном прохождении
    1. Обрабатывают монослойные культуры раствором диссоциации при температуре 37 °C в течение 5-10 мин (время расщепления варьируется в зависимости от наличия разных типов клеток).
    2. Когда клетки расщепляются на отдельные клетки, добавьте 2 мл поддерживающей среды МСК, чтобы прекратить пищеварение, и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку. Оставшиеся непереваренные клетки один раз промыть DPBS и снова переварить. Повторяйте несколько раз, пока все клетки не переварятся в отдельные клетки. Центрифугируйте клеточную суспензию при 250 x g в течение 5 мин, затем удалите надосадочную жидкость.
    3. Высейте клетки в культуральную чашку, покрытую желатином (примерно 2 x 105 клеток/см2). Культивирование до 90% слияния в поддерживающей среде МСК с регулярной сменой среды. Обозначим это поколение ячеек как проход 0 (P0) в этой точке.
    4. Для того, чтобы сделать МСК чистым и зрелым, продолжайте пассировать клетки 6 раз в соотношении 1:3 примерно через 18 дней. Большинство клеток имеют фибробластоподобную морфологию (веретенообразную).

4. Анализ поверхностных антигенов МСК, индуцирующих МСК, методом проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Подобно поверхностным антигенам МСК, полученных из костного мозга, МСК, индуцирующие МСК, экспрессируют CD105, CD73 и CD90, но не экспрессируют CD45, CD3429. Кроме того, ИПСК могут быть использованы в качестве клеток негативного контроля. Анализ поверхностных антигенов МСК и ИПСК, управляемых ИПСК, методом проточной цитометрии представлен на рисунке 2.

  1. Обрабатывают МСК, приводящие ИПСК, раствором для диссоциации при 37 °C в течение 2-3 мин. Обработайте ИПСК 0,48 мМ диссоциационным реагентом ЭДТА и инкубируйте в течение 1 мин при ЛТ, затем удалите диссоциационный реагент. Продолжайте инкубировать при температуре 37 °C в течение 3-5 мин.
  2. Когда клетки расщепляются в отдельные клетки, добавьте среду (поддерживающую среду МСК к МСК и поддерживающую среду ИПСК к ИПСК), чтобы прекратить пищеварение.
  3. Центрифугируют клеточную суспензию при 350 x g в течение 5 мин, затем удаляют надосадочную жидкость.
  4. Промойте клетки один раз холодной DPBS, центрифугируйте при 350 x g в течение 5 мин, а затем удалите надосадочную жидкость.
  5. Подсчитайте и ресуспендируйте клетки в холодном 10% растворе FBS-DPBS (v/v) в концентрации 10 x 106 клеток/мл и распределите 100 мкл/пробирку клеточной суспензии (1 x 106 клеток/пробирка) в центрифужные пробирки по 1,5 мл.
  6. Добавьте 5 мкл раствора, блокирующего Fc-рецепторы человека, к 100 мкл клеточной суспензии. Инкубируют в течение 5-10 мин при РТ для выполнения неспецифической блокады.
  7. Центрифугу при 350 х г в течение 5 мин и удалить надосадочную жидкость. Промойте клетки дважды холодным 2% раствором FBS-DPBS (v/v).
  8. Повторно суспендировать ячейки в холодном 100 мкл 2% раствора FBS-DPBS (v/v).
  9. Добавьте 5 мкл (1 тест) анти-CD34-FITC и 5 мкл (1 тест) анти-CD45-APC к клетке объемом 100 мкл
    Суспензия. Добавьте 5 мкл (1 тест) анти-CD73-APC, 5 мкл (1 тест) анти-CD90-FITC и 5 мкл (1 тест) анти-CD105-PE в еще одну 100-мкл клеточную суспензионную пробирку. Добавьте 5 мкл FITC для контроля изотипа IgG1 человека, контрольного полиэтиленового полиэтилена для контроля изотипа IgG1 человека и APC для контроля изотипа IgG1 человека в третью суспензионную пробирку на 100 мкл. Выдерживают 15-20 мин на льду в темноте. Тем временем подготовьте одинарные бусины.
  10. Промойте клетки дважды холодным 2% раствором FBS-DPBS (v/v).
  11. Добавьте 300 мкл холодного 2% раствора FBS-DPBS (v/v) для ресуспендирования ячеек и отфильтруйте через сетчатый фильтр 200 меш.
  12. Проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии. Анализируют клеточную суспензию, окрашенную антителами к контролю изотипа, и устанавливают ворота. Затем анализируют клеточную суспензию, окрашенную антителами-мишенями.

5. Остеогенная дифференцировка МСК, индуцирующих ПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: МСК, индуцирующие hiPSC, обладают потенциалом остеогенной дифференцировки (рис. 3A, B). Протокол остеогенной дифференцировки приведен ниже.

  1. Приготовьте остеогенную индукционную среду, добавив α-МЭМ 10% FBS, 100 нМ дексаметазона, 10 мМ бета-глицерофосфата и 100 мкМ аскорбиновой кислоты.
  2. Высейте 1 x 105 МСК в покрытую желатином 48-луночную планшет и культивируйте до тех пор, пока она не станет сливающейся на 60%-70%.
  3. Удалите среду и добавьте 0,3 мл остеогенной индукционной среды. Культивирование клеток в остеогенной индукционной среде в течение 14 дней при 37 °C, 5%CO2, со сменой среды каждые 3 дня.
  4. Удалите средство и промойте DPBS один раз.
  5. Добавьте 0,3 мл 4% PFA и инкубируйте при RT в течение 30 мин.
  6. Удалите PFA. Промыть клетки 0,3 мл ДПБС в течение 10 мин при РТ и повторить 3 раза.
  7. Удалить DPBS, добавить 0,2 мл раствора для окрашивания ализарина красного и инкубировать в течение 30 мин при RT.
  8. Раствор для окрашивания удалить, промыть клетки 0,3 мл DPBS в течение 10 мин при RT и повторить 3 раза.
  9. Наблюдайте за окрашиванием отложений кальция под световым микроскопом.

6. Адипогенная дифференцировка МСК, индуцирующих ПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: МСК, управляемые ИПСК, обладают потенциалом адипогенной дифференцировки (рис. 3C, D). Протокол адипогенной дифференцировки приведен ниже.

  1. Подготовьте адипогенную индукционную среду, добавив α-МЭМ 10% FBS, 1 мкМ дексаметазона, 1 мкМ IBMX, 10 мкг/мл инсулина и 100 мкМ индометацина. Подготовьте адипогенную поддерживающую среду, добавив α-MEM с 10% FBS и инсулином 10 мкг/мл.
  2. Высевают 1 x 10,5 МСК в покрытую желатином 48-луночную планшет и культивируют до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 90%.
  3. Удалите среду и добавьте 0,3 мл адипогенной индукционной среды. Продолжают культивировать клетки в адипогенной индукционной среде в течение 4 дней при 37 °C, 5% CO2.
  4. Удалите среду и добавьте 0,3 мл поддерживающей адипогенной среды. Продолжают культивировать клетки в адипогенной поддерживающей среде в течение 3 дней при 37 °C, 5% CO2.
  5. Повторите шаги 6.3 и 6.4 2-3 раза до дифференцировки и созревания адипоцитов.
  6. Удалите средство и промойте DPBS один раз.
  7. Добавьте 0,3 мл 4% PFA и инкубируйте при RT в течение 10 мин. Удалите PFA и промойте 2 раза DPBS.
  8. Нанесите краситель Oli Red O в соответствии с инструкцией производителя и наблюдайте за липидными каплями под световым микроскопом.

7. Хондрогенная дифференцировка МСК, управляемых ПССК

ПРИМЕЧАНИЕ: МСК, индуцирующие hiPSC, обладают хондрогенным дифференцировочным потенциалом (рис. 3E, F). Протокол хондрогенной дифференцировки приведен ниже.

  1. Приготовьте индукционную среду хондроббластов, добавив α-MEM 10% FBS, 100 нМ дексаметазона, 1% инсулин-трансферрин-селен (ITS), 10 мкМ аскорбиновой кислоты, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкг/мл пролина, 0,02 нМ трансформирующего фактора роста β3 (TGFβ3) и 0,5 мкг/мл костного морфогенетического белка 6 (BMP-6).
  2. Соберите 2,5 x 105 МСК, приводящих ИПСК, и центрифугируйте клетки при 150 x g в течение 5 мин, затем удалите надосадочную жидкость. Суспендируйте клетки в 1 мл α-MEM, а затем центрифугируйте при 150 x g в течение 5 минут.
  3. Удалить надосадочную жидкость и суспендировать клетки в 0,5 мл хондрогенной индукционной среды. Центрифугируйте клетки при 150 x g в течение 5 мин.
  4. Непосредственно отвинтите крышку и культивируйте в течение 21 дня с хондрогенной индукционной средой, меняя каждые 3 дня при 37 °C, 5%CO2. Осторожно щелкайте центрифужной пробиркой, чтобы подвешивать хондрогенные гранулы (не разрушая хондрогенные гранулы) каждый день во время хондрогенной дифференцировки.
  5. Удалите надосадочную жидкость и дважды промойте 0,5 мл PBS.
  6. Добавьте 0,3 мл 4% PFA и зафиксируйте на 24 ч.
  7. Парафин встраивают в хондрогенные гранулы, а затем рассекают их (3 мкм). Окрасьте срезы толуидиновым синим (1%) в течение 30 мин.
  8. Понаблюдайте за внеклеточным матриксом хондроцитов под световым микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с протоколом (рис. 1А) ИПСК дифференцировали в МСК методами формирования ЭБ и монослойного культивирования. Во время дифференцировки клетки демонстрировали различную репрезентативную морфологию (рис. 1B, C).

Как показано на рисунке 1B, колонии ИПСК демонстрируют типичную компактную морфологию до дифференцировки с четкой границей, состоящей из плотно упакованных клеток. Одно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном протоколе были рассмотрены два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в МСК 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Оба метода были способны выводить МСК из ИПСК. МСК, полученные из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Мы благодарны Национальному клиническому исследовательскому центру детского здоровья за огромную поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для окрашивания в красный цвет АлизаринBeyotime  BiotechnologyC0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
Аскорбиновая кислотаSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Шейкер уровня углекислого газаКристаллCO-06UC6
Компенсационные бусиныBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL Technology07959
ДексаметазонBeyotime  БиотехнологияST1254
DMEM/F12  средаServicebioG4610
Фетальная бычья сывороткаHAKATAHS-FBS-500
FGF2Стволовая клетка78003.1
ЖелатинSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
человека контроль изотипа IgG1 APCBioLegend403505
контроль изотипа IgG1 человека FITCBioLegend403507
контроль изотипа IgG1 человека PEBioLegend403503
TGF-&beta человека; 1стволовая клетка78067
TruStain человека FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  БиотехнологияST1398
ИндометацинSolarbioSI9020
ИнсулинBeyotime  БиотехнологияP3376
Среда для поддержания iPSCSTEMCELL Technology85850
ITS Медиа ДобавкаBeyotime  BiotechnologyC0341-10mL
Matrigel, сниженный фактор ростаBD Corning354230
Oli Red O набор для окрашиванияBeyotime  БиотехнологияC0158S
ProlineSolarbioP0011
Пируват натрияThermoFisher11360-070
TGFβ 3NovoproteinCJ44
Набор для окрашивания толуидиновым синимSolarbioG2543
Фермент TrypLE Express (1x) Gibco12604013
Сверхнизкая насадка 6-луночная пластинаCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Стволовая клетка72304
α-MEMГиклонSH30265
&бета;-глицерофосфатSolarbioG8100

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272(2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48(2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884(2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623(2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080(2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778(2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330(2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068(2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49(2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10(2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144(2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи