Идентификация, диагностика и классификация злокачественных опухолей оболочки периферических нервов на генетически модифицированных мышиных моделях

Summary

Мы разработали методику оценки того, точно ли новообразования нервной системы у генетически модифицированных мышей повторяют патологию своих собратьев человека. Здесь мы применяем эти гистологические методы, определяемые патологические критерии и методологии культивирования к нейрофибромам и злокачественным опухолям оболочки периферических нервов, возникающим на мышиной модели P 0-GGFβ3.

Abstract

У пациентов с синдромом предрасположенности к аутосомно-доминантной опухоли нейрофиброматозом 1 типа (НФ1) обычно развиваются плексиформные нейрофибромы (ПН), которые впоследствии трансформируются в высокоагрессивные злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ). Понимание процесса, с помощью которого ПП трансформируется в МПНСТ, будет облегчено наличием генетически модифицированных мышиных моделей (GEM), которые точно воспроизводят прогрессию ПН-МПНСТ, наблюдаемую у людей с НФ1. К сожалению, модели GEM с абляцией Nf1 не полностью повторяют этот процесс. Это привело нас к разработке мышей P 0-GGFβ3, модели GEM, в которой гиперэкспрессия митогена нейрегулина-1 шванновских клеток (NRG1) в шванновских клетках приводит к развитию ПН, которые с высокой частотой превращаются в MPNST. Однако, чтобы определить, точно ли опухолегенез и опухолевая прогрессия у мышей P 0-GGFβ3 моделируют процессы, наблюдаемые у пациентов с NF1, мы должны были сначала доказать, что патология опухолей оболочки периферических нервов P_0-GGFβ3 повторяет патологию их человеческих аналогов.

В данной статье мы описываем специализированные методики, используемые для точной диагностики и классификации новообразований периферической нервной системы в моделях GEM, с использованием P 0-GGFβ3 и P_0-GGFβ3; В качестве примера можно привести мышей Trp53^+/-. Описаны гистологические, иммуногистохимические и гистохимические методы, применяемые для диагностики ПН и МПНСТ, как отличить эти новообразования от других типов опухолей, имитирующих их патологию, и как классифицировать эти новообразования. Мы обсуждаем создание ранних пассажных культур из GEM MPNST, как характеризовать эти культуры с помощью иммуноцитохимии и как проверить их опухолегенность путем создания аллотрансплантатов. В совокупности эти методы характеризуют патологию ПН и МПНСТ, возникающих в моделях GEM, и критически сравнивают патологию этих мышиных опухолей с их человеческими аналогами.

Introduction

За последние три десятилетия многочисленные лаборатории пытались создать мышиные модели рака человека, вводя в геном мыши мутации, связанные с раком, или чрезмерно экспрессируя генный продукт, который чрезмерно экспрессируется в раковых опухолях человека. Полученные генетически модифицированные модели мышей (GEM) могут быть использованы для различных целей, таких как установление того, что вновь введенная геномная модификация инициирует опухолегенез, выявление других впоследствии происходящих генетических или эпигенетических изменений, которые способствуют прогрессированию опухоли, и определение ключевых сигнальных путей, которые управляют инициацией и прогрессированием опухоли. В отличие от ортотопических ксенотрансплантатов, которые основаны на использовании мышей с иммунодефицитом, модели рака GEM имеют полностью функциональную иммунную систему и, таким образом, более точно моделируют реакцию на потенциальные терапевтические агенты. Тем не менее, при использовании GEM-моделей рака для подобных целей важно, чтобы исследователи подтвердили, что наблюдения, сделанные с новообразованиями GEM, имеют отношение к их человеческим аналогам. Эта валидация должна включать в себя тщательную оценку патологии новообразований ГЭМ и определение того, повторяют ли патологические особенности новообразований ГЭМ патологию соответствующего типа опухоли человека.

Синдром предрасположенности к опухолям нейрофиброматоз 1 типа (НФ1) является наиболее распространенным генетическим заболеванием, поражающим нервную систему человека, встречающимся примерно у 1 из каждых 3000-3500 живорожденных ^1,2,3. У людей, страдающих НФ1, развиваются множественные доброкачественные опухоли оболочки периферических нервов, известные как нейрофибромы, на коже (дермальные нейрофибромы) и в крупных нервах и нервных сплетениях (плексиформные нейрофибромы). В то время как как кожные и плексиформные нейрофибромы ухудшают качество жизни пациента, вызывая физические, поведенческие и/или социальные нарушения, плексиформные нейрофибромы (ПН) особенно опасны ^4,5. Это связано с тем, что ПП часто трансформируются в злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ), которые являются агрессивными веретеноклеточными новообразованиями с исключительно низкой выживаемостью ^1,2. В значительной степени такая низкая выживаемость объясняется тем, что радио- и химиотерапевтические схемы, которые в настоящее время используются для лечения МПНСТ, неэффективны. Тем не менее, разработка новых, более эффективных методов лечения является сложной задачей. Это связано с тем, что, несмотря на то, что MPNST часто встречаются у пациентов с НФ1, они все еще являются редкими новообразованиями. В результате очень трудно получить большое количество опухолей человека для изучения; Кроме того, сложно набрать достаточное количество пациентов с МПНСТ для клинических испытаний. Для преодоления этих ограничений было создано несколько моделей GEM с целью получения более глубокого представления об аномалиях, лежащих в основе патогенеза нейрофибромы и прогрессирования PN-MPNST, а также для содействия доклиническим испытаниям потенциальных терапевтических агентов.

У пациентов с НФ1 наблюдаются инактивирующие мутации в одной копии гена НФ1. Патогенез нейрофибромы запускается, когда в клетке шванновской клеточной линии происходит инактивирующая мутация в оставшемся функциональном гене NF1. Удивительно, однако, что когда у мышей были получены мутации Nf1, инактивирующие зародышевую линию, у них не развились нейрофибромы ^6,7. Последующая демонстрация того, что мыши с Nf1-нулевыми шванновскими клетками и гаплонедостаточностью Nf1 во всех других типах клеток (Krox20-Cre;У мышей Nf1^flox/- развились плексиформные нейрофибромы, что позволило предположить, что для патогенеза нейрофибромы требуется снижение дозы гена Nf1 в дополнительных типах клеток⁸. Даже в этом случае плексиформные нейрофибромы в Krox20-Cre; Мыши Nf1^flox/- не прогрессировали, чтобы стать MPNST, и поэтому лишь частично имитировали биологию своих человеческих собратьев. Патогенез MPNST действительно возникал, когда мутации Nf1 сочетались с мутациями в дополнительных генах-супрессорах опухолей, таких как Trp53⁹ или Cdkn2a¹⁰, но MPNST в этих моделях GEM развивались de novo или из атипичных нейрофиброматозных новообразований с неопределенным биологическим потенциалом (ANNUBPs)^11,12, а не из ранее существовавших доброкачественных плексиформных нейрофибром (см.^13,14 за отличные обзоры этих моделей, а также других моделей, вводящих дополнительные мутации с потерей функции MPNST, связанные с потерей функции в генах, таких как Suz12 и Pten¹⁵).

Эти мышиные модели были неоценимы для установления роли таких генов, как NF1, TP53 и CDKN2A, в патогенезе NF1-ассоциированных новообразований периферической нервной системы, а также для доклинических испытаний потенциальных терапевтических агентов. Тем не менее, у нас все еще есть неполное понимание процесса, посредством которого плексиформные нейрофибромы прогрессируют, превращаясь в атипичные нейрофиброматозные новообразования с неопределенным биологическим потенциалом (^{ANNUBPs 16}), а затем в MPNST. Недавно был достигнут некоторый прогресс в понимании этого процесса, в связи с недавним сообщением о том, что у мышей с делециями в Nf1 и Arf развиваются ANNUBP, которые прогрессируют, чтобы стать MPNST¹¹. Тем не менее, мышиных моделей, основанных на мутации Nf1, которые полностью повторяют процесс прогрессирования плексиформной нейрофибромы-MPNST, наблюдаемого у людей, пока не существует. Кроме того, неясно, существует ли несколько различных путей, которые приводят к развитию MPNST. Учитывая это, вполне возможно, что описанные выше ГЭМ моделируют только подмножество нескольких различных путей, которые приводят к прогрессированию нейрофибромы-МПНСТ и патогенезу МПНСТ. Этот момент подчеркивается тем фактом, что MPNST также встречаются спорадически и что некоторые спорадические MPNST, по-видимому, не имеют мутаций NF1 ^17,18.

Несмотря на то, что последнее утверждение было оспорено недавним предположением Magollon-Lorenz et al. о том, что, по крайней мере, некоторые спорадические MPNST, лишенные мутаций NF1 , являются меланомами или другим типом саркомы¹⁹, мы недавно сообщили о спорадическом MPNST и клеточной линии, полученной из этой опухоли (клетки 2XSB), которая была NF1 дикого типа²⁰. При характеристике родительской опухоли и клеточной линии 2XSB мы систематически исключали альтернативные диагностические возможности, включая меланому и множество других типов саркомы, которые обычно рассматриваются в дифференциальной диагностике спорадической злокачественной опухоли оболочки периферических нервов²⁰. Кроме того, мы отмечаем, что Magollon-Lorenz et al. признали, что их результаты в трех спорадических клеточных линиях MPNST, которые они изучали, не могут быть обобщены, чтобы указать, что все опухоли, идентифицированные как спорадические MPNST, не являются MPNST.

Для построения модели GEM, в которой патогенез нейрофибромы и MPNST не обязательно зависел от специфических мутаций генов-супрессоров опухолей, мы создали трансгенных мышей, у которых гиперэкспрессия мощного митогенного нейрегулина-1 (NRG1) из шванновских клеток была обусловлена промотором шванновского клеточного миелинового белка ноль (_P0) (мыши P 0-GGFβ3)²¹. Ранее мы показали, что нейрофибромы человека, MPNST и клеточные линии MPNST экспрессируют несколько изоформ NRG1 вместе с тирозинкиназами рецептора erbB (erbB2, erbB3 и erbB4), которые опосредуют передачу сигналов NRG1, и что эти рецепторы erbB конститутивно активированы²². Мы также продемонстрировали, что фармакологические ингибиторы киназ erbB мощно ингибируют пролиферацию MPNST²², выживаемость²³ и миграцию²⁴. В соответствии с нашими наблюдениями на людях, у мышей с P 0-GGFβ3 развиваются плексиформные нейрофибромы²⁵, которые прогрессируют в MPNST с высокой частотой^21,25. _{Мы показали}, что P0-GGFβ3 MPNST, как и их человеческие аналоги, обычно развивают мутации Trp53 и Cdkn2a, а также множество других геномных аномалий, которые потенциально способствуют опухолегенезу²⁵. MPNST, возникающие у мышей P 0-GGFβ3, не имеют инактивирующих мутаций Nf1. Однако, используя генетическую комплементацию, мы показали, что NRG1 способствует опухолегенезу у мышей P 0-GGFβ3 преимущественно через те же сигнальные каскады, которые изменяются при потере Nf1 ²⁶; Этот вывод основан на нашем выводе о том, что замена гиперэкспрессии NRG1 на потерю Nf1 в присутствии гаплонедостаточности Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- мышей) продуцирует животных, у которых MPNST развиваются de novo, как это наблюдается у цис-Nf1^+/-; Trp53^+/- мыши²⁷.

Для получения этой и другой информации, демонстрирующей, что мыши с P 0-GGFβ3 точно моделируют процессы патогенеза нейрофибромы и прогрессирования нейрофибромы-MPNST, наблюдаемые у людей с НФ1, нами были разработаны специализированные методики обработки тканей этих животных, точной диагностики их опухолей, классификации МПНСТ, возникающих у этих мышей, установления и характеристики раннего пассажа P_0-GGFβ3 и P_0-GGFβ3; Культуры Trp53^+/- MPNST и критическое сравнение патологии P0-GGFβ3 PNs и MPNST и P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST к их человеческим аналогам. Многие из этих методологий могут быть обобщены на другие модели неоплазии нервной системы GEM. Кроме того, некоторые из этих методологий более широко применимы к моделям GEM, в которых новообразования возникают в других органах. Следовательно, здесь мы приводим подробное описание этих методологий.

Protocol

Процедуры, описанные здесь, были одобрены IACUC Медицинского университета Южной Каролины и выполнялись надлежащим образом обученным персоналом в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациями MUSC по уходу за животными.

1. Определение пенетрантности и выживаемости опухоли у мышей P 0-GGFβ3 и идентификация опухолей у этих животных для дальнейшей характеристики

1. Создать когорту мышей, которые будут оцениваться на предмет онкогенеза. Необходимое количество мышей зависит от пенетрантности фенотипа опухоли. Чтобы компенсировать такие потери, начните с когорты, которая на 10-15% превышает желаемое конечное количество животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы определили пенетрантность опухоли у мышей P 0-GGFβ3 эмпирически в исходной когорте из 50 мышей (шесть из которых были потеряны по причинам, не связанным с неоплазией (например, борьба)⁾²⁵.
2. Оценивайте состояние здоровья животных три раза в неделю и записывайте показатели упитанности, включая вес, и изменения в поведении при каждом осмотре. Уничтожать мышей с опухолью или умирающими мышами (см. примечание ниже) с помощью эвтаназии углекислым газом с последующим вывихом шейки матки. Рекордный возраст на момент смерти в днях. Если опухоль видна снаружи, запишите размеры опухоли (длину, ширину и высоту).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы животным не разрешалось выходить за пределы максимально допустимого размера опухоли и/или гуманной конечной точки, одобренной IACUC.
3. Используя возраст на момент смерти, постройте кривую выживаемости Каплана-Мейера, чтобы определить средний возраст на момент смерти и диапазон выживаемости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Средний возраст мышей P 0-GGFβ3 на момент смерти составил 261,5 дня с диапазоном 74-533 дня; У 91% нашей когорты были множественные нейрофибромы и у 71% были МПНСТ²¹.
4. Определите, присутствуют ли грубо видимые опухоли, и, если они есть, препарируют их в стерильных условиях, чтобы установить, связана ли опухоль с периферическим нервом, а затем иссекают опухоль. В P 0-GGFβ3 и P_0-GGFβ3; У мышей Trp53^+/- опухоли оболочки периферических нервов чаще всего обнаруживаются в тройничном и седалищном нервах. Даже если не видно видимых опухолей в связи с этими нервами, зафиксируйте и внедрите эти нервы, как описано ниже, чтобы их можно было исследовать на наличие микроопухолей. Микроопухоли обычно возникают в ганглиях, связанных с этими нервами.
5. Грубо видимые опухоли разрезать на три части (рис. 1А). Используйте часть 1 для гистологии (парафиновые срезы, иммуногистохимия и гистохимия). Используйте деталь 2 для создания культур раннего пассажа. Моментально-заморозить деталь 3 (с использованием жидкого азота) для возможных будущих экспериментов (например, иммуноблоты, выделение РНК и ДНК).
6. Зафиксируйте кусочек 1 в 4% параформальдегиде в фосфатно-солевом буфере (PBS) на ночь при 4 ^°C. Зафиксируйте оставшуюся часть тела животного, погрузив в 4% параформальдегид на ночь при 4 °C.

2. Парафиноизование грубо видимых опухолей и подготовка окрашенных гематоксилином и эозином срезов для первичной диагностической оценки

1. Парафиновое внедрение грубо заметных опухолей
   1. После фиксации 1 части опухоли на ночь в 4% параформальдегиде промыть ткань, поместив ее в объем PBS, по крайней мере, в 10 раз превышающий объем ткани, на 15 мин; Используйте один и тот же объем для всех последующих полосканий. Повторите еще два 15-минутных полоскания PBS, используя свежий объем PBS для каждого полоскания.
   2. Перенесите опухоль кусочка 1 на 70% этанол. Выдержите ткань в 70% этаноле в течение 24 ч при 4 °C. При желании ткань можно хранить в этих условиях длительное время.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги с 2.1.1 по 2.1.7 предназначены для исследователей, у которых нет доступа к коммерческому оборудованию для обработки тканей. Если у исследователя есть доступ к тканевому процессору, ткань будет обработана с помощью дифференцированных этанолов и ксилолов в соответствии с запрограммированным протоколом прибора.
   3. Перенесите кусочек опухоли 1 на 80% этанол в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторите инкубацию еще 30 мин в свежем объеме 80% этилового спирта.
   4. Перенесите кусочек опухоли 1 в 95% этанол на 75 мин при комнатной температуре. Повторите инкубацию еще дважды, каждый раз в течение дополнительных 75 мин в свежем объеме 95% этилового спирта.
   5. Переложите опухоль из кусочка 1 в 100% этанол и инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре. Повторите 60-минутную инкубацию еще дважды, каждый раз используя свежий объем 100% этанола.
   6. Опухоль 1 переносят в растворитель на основе d-лимонена и инкубируют 30-60 мин при комнатной температуре. Опухоль 1 переложить в свежий объем растворителя на основе d-лимонена и инкубировать еще 30-60 мин при комнатной температуре.
   7. Переложите опухоль 1 в растворитель на основе парафина/d-лимонена в соотношении 1:1 в течение 1 ч при 60 ^°С. Выбросьте растворитель на основе парафина/d-лимонена 1:1 и перенесите опухолевый кусочек 1 в парафин 60 ^°С и инкубируйте в течение 20 мин при 60 ^°С. Повторите инкубацию в свежем объеме парафина 60 ^°С еще раз в течение 20 мин. Инкубируйте опухоль 1 шт. в парафине в течение ночи при 60 ^оС.
   8. Налейте базовый слой парафина в стальную гистологическую форму и дайте ему застыть. Перенесите опухоль 1 на поверхность базового парафина и сразу после позиционирования покройте ткань парафином 60 ^oC и поместите тканевую кассету поверх расплавленного парафина и соприкасайтесь с ним. Перенесите форму на холодную сторону станции закладки и дайте ей затвердеть в течение 10-15 минут.
   9. Извлеките парафиновый блок с прикрепленной кассетой для ткани из формы. Используйте прилагаемую кассету для ткани, чтобы зажать блок в микротоме во время секционирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновый блок теперь можно хранить неограниченное время при комнатной температуре.
2. Подготавливают окрашенные гематоксилином и эозином срезы грубо видимых опухолей.
   1. С помощью микротома вырезать срезы опухолевой ткани размером 4-5 мкм и закрепить их на положительно заряженных предметных стеклах.
   2. Для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) депарафинизируют срезы тканей путем инкубации предметных стекол в растворителе на основе d-лимонена в течение 10 мин при комнатной температуре. Инкубацию повторяют в свежем объеме растворителя на основе d-лимонена в течение 10 мин.
   3. Переложите предметные стекла в 100% этанол и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Переложите предметные стекла в свежий объем 100% этилового спирта и инкубируйте еще 5 минут при комнатной температуре.
   4. Переведите предметные стекла в 95% этиловый спирт и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Переложите предметные стекла в свежий объем 95% этилового спирта и инкубируйте еще 5 минут при комнатной температуре.
   5. Переведите предметные стекла в 70% этиловый спирт и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Затем переложить в 50% этиловый спирт и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
   6. Переложите предметные стекла в дистиллированную воду и выдержите 5 минут при комнатной температуре.
   7. Окрасьте предметные стекла, погрузив их в гематоксилин на 5 минут при комнатной температуре. Промыть проточной водой из-под крана в течение 1-2 минут. Дифференциация путем погружения предметных стекол 2-5 раз в 0,5% соляной кислоты в 70% этаноле. Смойте на проточной водяной бане в течение 1-2 минут. Поместите предметные стекла в 95% этанол с 0,5% уксусной кислотой на 10 с.
   8. Окрасьте предметные стекла эозином-Y в течение 30 с при комнатной температуре, а затем перенесите предметные стекла в 100% этанол на 5 мин. Очистите образцы в растворителе на основе d-лимонена в течение 5 мин.
   9. Монтируйте покровные стекла с помощью монтажной среды на основе ксилола, пока предметное стекло еще влажно растворителем на основе d-лимонена. Дайте монтажному материалу застыть в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте монтажную среду на водной основе.
3. Подготовка тканей без грубо видимых опухолей для выявления плексиформных нейрофибром и микро-МПНСТ. Закапывают ткани в парафин, подготавливают гистологические срезы и окрашивают эти срезы гематоксилином и эозином.
   1. Удалите внутренние органы и поместите репрезентативные части каждого органа в парафин, чтобы подготовить окрашенные H&E-срезы, которые будут исследованы на наличие микроскопических признаков опухолей (рис. 1B). Удалите голову, передние конечности, задние конечности и хвост (рисунок 1C). Для обследования спинного мозга и нервных корешков in situ на наличие опухолей нервных корешков проводят декальцинацию позвоночного столба и связанных с ним ребер и мягких тканей путем погружения в 0,3 М ЭДТА/4% параформальдеги (рН 8,0) в течение 48-72 ч при 4 ^оС; затем промойте образцы 1x PBS. В конце декальцинации убедитесь, что декальцинация завершена, попытавшись проколоть позвоночный столб иглой. Декальцинация проходит успешно, если игла легко проникает в кость, не хрустя.
   2. Разрежьте декальцинированный позвоночный столб и связанные с ним структуры на блоки, которые поместятся в тканевую кассету. Обезвоживание с помощью дифференцированного этанола с последующим использованием растворителя на основе d-лимонена, как описано в шагах 2.1.2-2.1.7. Вставьте парафин и подготовьте срезы размером 4-5 мкм, как описано в шагах 2.1.7-2.2.1. Выполните окрашивание H&E, как описано в шагах 2.2.2-2.2.9; Дайте монтажному материалу застыть в течение ночи.

3. Выявить потенциальные плексиформные нейрофибромы и выполнить специальные окрашивания для подтверждения диагноза

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем привлекать опытного человека или ветеринарного патологоанатома к оценке H&E и специальных красителей срезов опухоли GEM.

1. Изучите окрашенные H&E-стекла, подготовленные, как описано выше, с помощью светлопольной микроскопии для выявления потенциальных опухолей оболочки периферических нервов. Поскольку нейрофибромы и МПНСТ возникают в периферических нервах, важно определить, связаны ли микроскопические опухоли с периферическим нервом. Идентификация блокад с потенциальными опухолями оболочки периферических нервов, чтобы можно было выполнить иммуноокрашивание и другие специальные окрашивания для подтверждения или опровержения диагноза.
2. Дифференцировать потенциальные ПН от МПНСТ/других новообразований высокой степени злокачественности на основе гистологических признаков, наблюдаемых при исследовании светлопольных срезов, окрашенных H&E. ПП человека представляют собой слабо гиперклеточные новообразования, преимущественно состоящие из клеток с удлиненными, часто волнистыми ядрами. Во многих областях клетки неплотно упакованы и могут быть разделены миксоидным внеклеточным материалом; ПН у мышей P 0-GGFβ3 имеют сходный внешний вид. Митозы, как правило, отсутствуют; если это так, и опухоль умеренно или сильно гиперклеточная, опухоль является МПНСТ или другим типом высокодифференцированного новообразования (см. ниже).
3. ПН состоят из смеси опухолевых шванновских клеток и других неопухолевых типов клеток, таких как тучные клетки. Для подтверждения идентичности ПП проводят иммуноокрашивание на шванновские клеточные маркеры S100β и Sox10 и маркер тучных клеток CD117 (c-Kit) на срезах блоков, содержащих потенциальные ПН, выявленные при обследовании H&E (альтернативные варианты окрашивания тучными клетками см. раздел 3.4). Выполните иммуноокрашивание Ki67 для подтверждения низкой скорости пролиферации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 перечислены антигенные маркеры, используемые для рутинной идентификации плексиформных нейрофибром GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), диагностики MPNST и для полной оценки других типов клеток, присутствующих в нейрофибромах; мы окрашиваем эти последние антигены только при первом описании новой модели GEM. Обратитесь к техническому описанию производителя антител для получения информации о рекомендуемых условиях. Обратите внимание, рекомендует ли вкладыш производителя антитела извлечение антигена; Не все антигены требуют извлечения для обнаружения.
   1. Из отобранных парафиновых блоков подготовьте срезы 4-5 мкм и закрепите их на положительно заряженных предметных стеклах. Депарафинизируйте секции, как описано в шагах 2.2.2-2.2.6.
   2. Промойте участки 1x PBS в течение 3-5 минут.
   3. Если производитель антител рекомендует забор антигена, приготовьте цитратный буфер. Соедините 9 мл раствора лимонной кислоты (10,5 г лимонной кислоты на 500 мл дистиллированной воды) и 41 мл раствора цитрата натрия (14,7 г цитрата натрия на 500 мл дистиллированной воды).
   4. Выполните извлечение антигена, поместив предметные стекла в цитратный буфер на 20 минут в нагретую рисоварку.
   5. Перенесите предметные стекла в 3% перекись водорода/1x PBS на 10 мин для устранения активности пероксидазы в тканях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз делайте этот раствор свежим и не используйте стоковый раствор перекиси водорода, если он старше 3-4 месяцев.
   6. Промойте участки в 1x PBS.
   7. Блокируйте секции с помощью блокирующего буфера (2% BSA, 0,1% Triton X-100 в 1x PBS) в течение 1 ч. Кратковременно промойте слайды в 1x PBS.
   8. Добавьте первичные антитела в срезы тканей. Первичные антитела готовят в разбавленном блокирующем буфере. Инкубируют предметные стекла в течение 2 ч при 37 ^°С или в течение ночи при 4 ^°С.
   9. Промыть предметные стекла в 1 PBS в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
   10. Инкубируют ткань с биотинилированными вторичными антителами в течение 1-2 ч.
   11. Приготовьте раствор диаминобензидина (DAB) в соответствии с протоколом производителя и погрузите предметные стекла в раствор на 2-10 мин. Промойте горки в воде в течение 5 минут.
   12. Контрокрасьте участки, погрузив их в гематоксилин на 10-15 мин. Подвергайте воздействию проточной воды, пока она не станет прозрачной. Быстро окуните предметные стекла в спирт и промойте их в воде.
   13. Обезвоживайте предметные стекла в сортированных этанолах путем быстрого погружения предметных стекол, 4-5 раз на раствор, в 70% этаноле, 95% этаноле, а затем в 100% этаноле. Инкубируйте предметные стекла в растворителе на основе d-лимонена в течение 2 мин. Инкубируют предметные стекла во второй партии растворителя на основе d-лимонена в течение 2 мин.
   14. Крепление направляющих с помощью монтажного носителя на основе ксилола.
   15. Исследуйте предметные стекла с помощью светлопольной микроскопии.
   16. Для иммунофлюоресценции опустите шаги 3.3.10-3.3.15. Вместо этого инкубируют ткань с видоспецифичными вторичными антителами, разведенными в блокирующем буфере, в течение 1-2 ч.
   17. Промывайте предметные стекла в 1x PBS в течение 5 мин. Повторите 3 раза.
   18. Монтируйте слайды с помощью 1x PBS/глицерина.
   19. Исследуйте предметные стекла с помощью флуоресцентной микроскопии.
4. Альтернативный метод окрашивания тучных клеток: окрашивание толуидиновым синим
   1. Приготовьте исходный раствор толуидина синего, растворив 1 г толуидина синего О в 100 мл 70% этилового спирта.
   2. Приготовьте 1% раствор хлорида натрия (NaCl), растворив 0,5 г NaCl в 50 мл дистиллированной воды. Перемешать до полного растворения. Отрегулируйте рН примерно до 2,0-2,5 с помощью HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор NaCl необходимо делать свежим каждый раз, когда выполняется окрашивание.
   3. Приготовьте рабочий раствор толуидина синего, добавив 5 мл исходного раствора толуидина синего к 45 мл 1% раствора NaCl. Хорошо перемешайте и убедитесь, что pH составляет примерно 2,3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: pH выше 2,5 приведет к окрашиванию с меньшей метахромазией. Делайте этот раствор свежим каждый раз, когда выполняется окрашивание.
   4. Депарафинизируйте секции размером 4-5 мкм, установленные на положительно заряженных предметных стеклах, как описано в шагах 2.2.2-2.2.6. Депарафинизированные срезы промыть в проточной воде в течение 2 минут.
   5. Окрашивают срезы в рабочем растворе толуидинового синего в течение 2-3 мин. Промыть в дистиллированной воде 2 мин.
   6. Обезвоживайте срезы, погружая 10-кратное погружение в 95% этанол. Окуните горки в 100% этанол 10x. Окуните горки в свежий 100% этанол еще 10 раз.
   7. Инкубируйте предметные стекла в растворителе на основе d-лимонена в течение 2 мин. Инкубируют предметные стекла во второй партии растворителя на основе d-лимонена в течение 2 мин.
   8. Монтаж покровных стекол осуществляется с помощью монтажной среды на основе ксилола, пока предметное стекло еще влажно с растворителем на основе d-лимонена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте монтажную среду на водной основе.
   9. Исследуйте предметные стекла с помощью светлопольной микроскопии. Идентификацию тучных клеток можно по наличию темно-фиолетовых гранул в их цитоплазме. Другие типы клеток окрашены в светло-голубой цвет.

4. Специальные красители для диагностики МПНСТ и исключения альтернативных диагнозов

1. Гистологический вид МПНСТ человека очень вариабелен, и несколько различных типов опухолей имеют внешний вид, сходный с МПНСТ²⁸. Поскольку MPNST происходят из линии шванновских клеток, определите, возникает ли опухоль из периферического нерва или в пределах существующей доброкачественной ПН, путем грубого исследования или светлопольного микроскопического исследования срезов, окрашенных H&E. Несмотря на то, что МПНСТ иногда обнаруживаются не в связи с периферическим нервом или ПП (обычно из-за непреднамеренного отделения от нерва во время диссекции, разрушения ранее существовавшей ПП из-за чрезмерного роста МПНСТ или из-за метастатического поражения), ищите связь опухоли с нервом или ПП, поскольку диагноз менее вероятен, если опухоль не связана с нервом или ПП.
2. Подготовьте секции размером 4-5 мкм из парафиновых блоков, содержащих потенциальные MPNST, и установите их на положительно заряженные предметные стекла, как описано в шаге 2.2.1. Депарафинизируйте секции, как описано в шагах 2.2.2-2.2.6.
3. Проведите иммуногистохимическое исследование с помощью панели антител, указанной в таблице 2 , как описано в шагах 3.3.1-3.3.15.
4. Исследуйте иммуноокрашивание с помощью светлопольной микроскопии. Поскольку MPNST демонстрируют шваннианскую дифференцировку, ищите однородную или неоднородную иммунореактивность для S100β, нестина и Sox10. Если опухоли не являются положительными по этим трем маркерам, обратитесь к таблице 2 для установления диагноза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: MPNST человека и мыши могут демонстрировать дивергентную дифференциацию. Например, некоторые МПНСТ человека демонстрируют фокальную рабдомиобластическую дифференцировку (эти варианты известны как злокачественные опухоли Тритона); Хотя эти новообразования будут окрашиваться по шваннианским маркерам, они также экспрессируют мышечные маркеры, такие как десмин, MyoD1 и миогенин. Иммунореактивность к этим последним маркерам не должна отпугивать исследователей от постановки диагноза опухоли как МПНСТ. Несмотря на то, что было установлено несколько мышиных моделей, условно экспрессирующих ген слияния SS18-SSX, для моделирования патогенеза синовиальной саркомы²⁹, насколько нам известно, модели синовиальной саркомы, которые спонтанно генерируют эквивалентный транскрипт слияния, неизвестны. Следовательно, мы не ищем транскрипты слияния SS18-SSX в опухолях GEM, а полагаемся на иммуногистохимические профили.

5. Классификация МПНСТ

1. Определите, присутствует ли некроз опухоли, отличительный признак МПНСТ IV степени по классификации ВОЗ. Для MPNST IV степени следует обратить внимание на выраженную гиперцеллюлярность, быструю митотическую активность (≥4 митозов на 10 полей высокой мощности (40x)) и цитологическую атипию.
   1. Если некроз отсутствует, оцените опухоль, чтобы определить, присутствует ли гиперцеллюлярность, быстрая митотическая активность и цитологическая атипия. Если все эти признаки присутствуют при отсутствии некроза, опухоль классифицируется как МПНСТ III степени по классификации ВОЗ.
   2. Опухоли II степени по классификации ВОЗ характеризуются повышенной клеточностью, но в меньшей степени, чем опухоли III и IV степени по классификации ВОЗ. Ядра опухолевых клеток при МПНСТ II степени по классификации ВОЗ демонстрируют увеличение размеров (более чем в 3 раза больше размера ядер опухолевых клеток при нейрофибромах) и гиперхромазию. Повышенная митотическая активность (<4 митозов на 10 полей высокой мощности) связана с опухолями II степени тяжести, но не является их обязательным требованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку опухоли более высокой степени злокачественности, как правило, прогрессируют из опухолей более низкой степени злокачественности, низкодифференцированные и высокодифференцированные области могут присутствовать в одном и том же MPNST. В этом случае степень опухоли определяется по наличию области с самой высокой степенью злокачественности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среди патологоанатомов существуют разногласия относительно того, является ли описанная выше система классификации ВОЗ прогностической для исходов пациентов, и некоторые из этих патологоанатомов предпочитают вместо этого просто классифицировать MPNST как низкодифференцированные или высокодифференцированные. В соответствии с этой схемой, высокодифференцированные MPNST имеют выраженную цитологическую атипию, оживленную митотическую активность (>5 митозов на 10 полей высокой мощности) и выраженную гиперцеллюлярность с некрозом или без него. Низкодифференцированные МПНСТ не обладают некрозом, но демонстрируют митотическую активность, цитологическую атипию и клеточность, которые являются промежуточными между МПНСТ высокой степени злокачественности и атипичным нейрофиброматозным новообразованием с неизвестным биологическим потенциалом (ANNUBP). Мы предпочитаем систему, описанную выше, потому что различение между ANNUBP и MPNST низкого качества может быть сложной задачей для исследователей, которые не имеют большого опыта работы с этими сущностями.

6. Подготовка культур клеток раннего пассажа P 0-GGFβ3 MPNST

1. Культивирование опухолевых клеток раннего пассажа P 0-GGFβ3 из свежего куска опухоли 2 (шаг 1.5, рис. 1A). С этого момента поддерживайте стерильные условия.
   1. Диссоциируют опухоль, разрезая ее на мелкие (2-4 мм) кусочки и измельчая в DMEM10 (минимальная эссенциальная среда Dulbecco), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мкмоль/л форсколин и 10 нмоль/л нейрегулина 1β (NRG1β) в 100-миллиметровых чашках для культивирования тканей.
   2. Дайте клеткам вырасти из измельченных фрагментов тканей при 37 ^°C в 5%_CO2 до слияния пластин. Меняйте носитель каждые 3-4 дня.
   3. Расщепить клеточную культуру. Удалите фильтрующий материал из 100-миллиметровой чашки и промойте ячейки с помощью PBS; Достаньте и выбросьте измельченную ткань. Удалите PBS и добавьте 1 мл 0,25% трипсина в течение 2-5 минут при комнатной температуре. Чтобы способствовать отслоению клеток, осторожно постучите по пластине и проверьте наличие отслоения с помощью светового микроскопа; При необходимости продлевайте инкубацию трипсина.
   4. Нейтрализуйте трипсин, добавив 2 мл DMEM10. Переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и грануляторы при 500 × г в течение 5 мин. Удалите фильтрующий материал и добавьте 5 мл свежего DMEM10 в гранулу.
   5. Распределите клеточную суспензию по двумя-четырем чашкам диаметром 100 мм, содержащим DMEM10. Не разделяйте клетки более чем на пять проходов (шаги 6.1.3 и 6.1.4) и поддерживайте их в DMEM без форсколина и NRG1β. Не забудьте заморозить ячейки в проходе 2 для дальнейшего использования.

7. Проверка идентичности клеток раннего пассажа МПНСТ методом иммуноцитохимии

1. Поместите стерильные стеклянные покровные стекла 18 мм #1,5 в лунки 6-луночных стерильных чашек для культивирования тканей.
   1. Раствор поли-L-лизина/ламинина помещают в лунки в объеме, достаточном для покрытия покровного стекла. Закройте пластину полиэтиленовой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение. Выдерживают при температуре 4 °C в течение ночи. На следующее утро промойте покровные стекла 3 раза стерильным ПБС.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы попытались нанести клетки MPNST с ранним пассажем на непокрытые покровные стекла и обнаружили, что клетки плохо прилипают к поли-L-лизину/ламининовому покрытию.
   2. Нанесите 10 000 клеток на покровное стекло, осторожно добавив 2 мл клеточной суспензии в питательной среде в каждую лунку, содержащую покровное стекло. Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C с 5%_CO2 в инкубаторе для тканевых культур.
   3. На следующее утро промойте покровные стекла в течение 2 x 5 минут PBS.
   4. Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в PBS в течение 18 мин при комнатной температуре.
   5. Промывайте покровные стекла 3 x 5 мин с помощью PBS. При желании запечатайте пластину полиэтиленовой пленкой и храните ее при температуре 4 °C.
   6. Приготовьте свежий 50 мМ NH₄Cl в PBS. Гасят альдегиды инкубацией покровных стекол в 50 мМ NH₄Cl в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
   7. Пермеабилизацию клеток путем инкубации покровных стекол в 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Постирайте покровные стекла в течение 3 x 5 минут с помощью PBS.
   8. Блокируют неспецифическое связывание путем инкубации покровных стекол в блокирующем буфере (1x PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,2% обезжиренного сухого молока и 0,3% Triton X-100) в течение 1 ч при комнатной температуре.
   9. Удалите блокирующий буфер и добавьте первичные антитела, распознающие маркеры MPNST, присутствующие в родительской опухоли (обычно S100β, Nestin и Sox10), разбавленные до заданного оптимального разведения в блокирующем буфере. Оберните планшет полиэтиленовой пленкой и выдержите при температуре 4 °C в течение ночи в увлажненной камере.
   10. Промывайте 3 x 5 мин PBS для удаления несвязанных первичных антител. Добавляют флуоресцентно меченные вторичные антитела, разведенные в блокирующем буфере, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Беречь от света.
   11. Стирайте 3 x 5 мин с помощью PBS. Инкубируют покровные стекла в 1-5 мкг красителя Hoechst в течение 10 мин. Продолжайте защищать от света.
   12. Промыть покровные листы с помощью PBS в течение 5 минут. Монтируйте слайды с помощью 1:1 1x PBS/глицерина. Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа.

8. Аллотрансплантат опухолевых клеток раннего пассажа для демонстрации опухолегенности

1. Выращивание клеток P 0-GGFβ3 MPNST с ранним пассажем в DMEM10 до 80% слияния. Промойте клетки один раз сбалансированным солевым раствором Хэнкса комнатной температуры (HBSS). Обрабатывают клетки в течение 30 с - 1 мин раствором для неферментативной диссоциации клеток, чтобы удалить их из субстрата. Добавьте 5 мл DMEM10 на 1 мл неферментативного реагента для диссоциации клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная диссоциация может занять гораздо больше времени, до 10-20 минут. Пожалуйста, обратитесь к протоколу производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не выращивайте клетки до слияния, так как это снизит эффективность трансплантата.
   1. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Отжим клетки при 5 × г в течение 5 мин и ресуспендировать их в концентрации 1-2 × 10⁶ клеток на 100 мкл DMEM10. Держите клетки на льду до тех пор, пока они не будут готовы к инъекции.
   2. Обезболить мышей NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) в индукционной камере испарителя изофлурана. Положите животное на живот и простерилизуйте место инъекции 70% этанолом. Дайте этому месту высохнуть на воздухе перед инъекцией. Перед инъекцией дайте клеткам нагреться до комнатной температуры.
   3. Вводят 1-2 x 10⁶ клеток подкожно в правый бок. Поместите мышь одну в клетку без подстилки и дайте ей восстановиться. Следите за тем, чтобы на грелке находилась только часть клетки, чтобы не допустить переохлаждения. Это обеспечивает зону, в которую мышь может переместиться в случае перегрева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы прививаем минимум трех мышей с каждой культурой раннего пассажа, так как некоторые трансплантаты могут не прижиться.
   4. Дайте привою порасти в течение 15-60 дней; Оценивайте состояние здоровья животных 3 раза в неделю и записывайте показатели упитанности, включая вес, и изменения в поведении при каждом осмотре. Мышей, достигших максимально допустимого размера трансплантата, или умирающих мышей с помощью эвтаназии углекислым газом с последующим вывихом шейки матки. Рекордный возраст на момент смерти в днях. По мере того, как опухоли становятся видимыми снаружи, записывайте размеры опухоли (длину, ширину и высоту).
      ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, различные культуры раннего пассажа MPNST прививаются с разной эффективностью и различаются по времени, необходимому для роста прививки. Животным не должно быть позволено выходить за пределы максимально допустимого размера опухоли и/или гуманной конечной точки, одобренной IACUC.
2. Соберите опухоль, зафиксируйте ее в 4% параформальдегиде, поместите в парафин и выполните окрашивание H&E, как описано в разделах 2.1-2.2.9, чтобы убедиться, что аллотрансплантат является опухолью, а не реактивной тканью. При необходимости проводят иммуноокраску трансплантата на маркеры, которые присутствовали в родительской опухоли.

Results

На рисунке 2 показаны примеры ярко выраженных новообразований, возникающих у мышей P 0-GGFβ3. Опухоли, которые легко идентифицировать невооруженным глазом, могут быть видны как образования, расширяющие области тела, как показано на рисунке 2А (стрелка). При определении того, является ли новообразование потенциально опухолью оболочки периферического нерва, важно установить, что опухоль связана с периферическим нервом. В этом случае МРТ (рис. 2B) показывает, что опухоль связана с седалищным нервом (стреловидным наконечником); Эта связь была подтверждена после эвтаназии мыши и вскрытия опухоли. Следует отметить, что большой размер не обязательно свидетельствует о том, что опухоль злокачественная. В данном случае гистологическое исследование опухоли (рис. 2С) показало, что это нейрофиброма. Однако чаще всего очевидно опухоли не выявляются до тех пор, пока не будет проведено вскрытие мыши. На рисунке 2D показан крупный, мясистый MPNST, возникший в плечевом сплетении этого животного.

На рисунке 3 показаны репрезентативные примеры MPNST и нейрофибром у мышей P 0-GGFβ3, полученные в соответствии с процедурами, описанными в разделе 1 протокола. На рисунке 3A-J показаны десять примеров независимо возникающих MPNST из нашей колонии мышей P_0-GGFβ3. Обратите внимание, что гистологический вид MPNST может сильно варьировать, даже между MPNST, возникающими независимо друг от друга у одного и того же животного. Эта гистологическая вариабельность иллюстрирует, почему мы обычно подтверждаем диагноз P 0-GGFβ3 MPNST с помощью иммуногистохимического окрашивания. Мы также хотели бы отметить, что другие, по-видимому, не связанные между собой типы опухолей встречаются спорадически с низкой частотой в некоторых инбредных линиях мышей (например, мы несколько раз сталкивались с лимфомами у мышей P 0-GGFβ3, несущих трансген на фоне C57BL/6J), что еще раз подчеркивает важность использования иммуногистохимии для подтверждения диагноза опухоли. Несмотря на вариабельность гистологического вида, все десять опухолей, изображенных на рисунке 3A-J, были иммунореактивными к S100β и нестину и отрицательными к маркерам других типов опухолей. На рисунке 3K показано репрезентативное изображение правильно декальцинированного позвоночного столба и связанных с ним тканей. Обратите внимание, что спинной мозг, нервные корешки, тело позвонка и скелетные мышцы сохраняют свои правильные анатомические отношения друг с другом. На рисунке 3L показано более мощное изображение тела позвонка и вышележащего спинного мозга. Поскольку эта ткань должным образом декальцинирована, кость легко разрезается, не измельчаясь и не сворачиваясь, а костный мозг легко идентифицируется в костномозговых пространствах. Если бы ткань не была декальцинирована должным образом, она зацепилась бы за лезвие микротома и была бы вырвана из среза, нанеся значительный ущерб соседним тканям (спинному мозгу, корешкам спинномозговых нервов и скелетным мышцам). На рисунке 3М представлено репрезентативное изображение нейрофибромы, возникающей в корешке дорсального нерва у мыши P 0-GGFβ3. Обратите внимание, что эта опухоль является менее клеточной, чем MPNST, показанные на рисунке 3A-J. Ключевая диагностика нейрофибром заключается в том, что они состоят из сложной смеси опухолевых шванновских клеток и неопухолевых тучных клеток, макрофагов, фибробластов и периневральноподобных элементов, которые проникают в нерв и раздвигают аксоны.

На рисунке 4 показаны примеры красителей, которые наиболее полезны для первоначальной идентификации плексиформной нейрофибромы и различения плексиформной нейрофибромы и МПНСТ. На рисунке 4A показана иммунореактивность S100β при плексиформной нейрофиброме P 0-GGFβ3. Следует отметить, что иммунореактивность S100β проявляется только в субпопуляции клеток, что согласуется с тем фактом, что нейрофибромы состоят из смеси опухолевых шванновских клеток и других неопухолевых элементов (фибробласты, тучные клетки, макрофаги, периневральноподобные клетки, плохо выраженная CD34-иммунореактивная клеточная популяция и сосуды). К сожалению, неоднородное окрашивание S100β не позволяет отличить плексиформные нейрофибромы от МПНСТ, поскольку окрашивание S100β может быть неоднородным в МПНТ (окрашивание H&E полезно для этой цели, однако, поскольку МПНСТ, как правило, более клеточные, чем плексиформные нейрофибромы [см. Рисунок 3]). Опухолевые шванновские клетки также иммунореактивны по отношению к промежуточному филаментному гнездину, как показано в P 0-GGFβ3 MPNST, представленном на рисунке 4B. Опухолевые шванновские клетки также часто демонстрируют ядерную иммунореактивность к транскрипционному фактору Sox10, как показано в MPNST на рисунке 4C. Признаками, полезными для дифференциации плексиформных нейрофибром и МПНСТ, являются наличие тучных клеток и выраженная иммунореактивность к маркеру пролиферации Ki67. На рисунке 4D показано окрашивание по методу Унна, выполненное на плексиформной нейрофиброме P 0-GGFβ3, чтобы подчеркнуть наличие тучных клеток, которые легко идентифицировать по выраженному метахроматическому фиолетовому окрашиванию их цитоплазматических гранул. Тучные клетки отсутствуют в MPNST. Напротив, иммунореактивность Ki67 практически отсутствует при плексиформных нейрофибромах, как это видно в опухоли P 0-GGFβ3, показанной на рисунке 4E. Ядерное мечение Ki67, как правило, присутствует в очень высокой доле опухолевых клеток, как это видно в микроскопическом MPNST, возникающем в тройничном ганглии мыши P 0-GGFβ3 (рис. 4F).

На рисунке 5 показаны примеры окрашивания, которые мы выполняем для полной характеристики клеточного состава нейрофибром в недавно разработанной модели GEM. Хотя красители, показанные на этом рисунке, были получены при дермальных нейрофибромах человека, они идентичны по внешнему виду тому, что мы видели в опухолях GEM. Иммунореактивность CD117 (c-Kit) присутствует в тучных клетках нейрофибромы и, таким образом, имеет распределение, очень похожее на то, что наблюдается при окрашивании Unna (см. рисунок 3A). Макрофаги также присутствуют разбросанными по всему нейрофиброму, как это видно на примере маркера пан-макрофагов Iba1 (см. рис. 5D); сюда входят подклассы макрофагов, которые иммунореактивны к CD163 и CD86 (см. рисунок 5B и рисунок 5C, соответственно). Фракция шваннианского элемента в нейрофибромах также демонстрирует ядерную иммунореактивность к Sox10. Фибробласты можно выделить по их иммунореактивности к TCF4. На рисунке 5G CD31 мечет сосудистые элементы в нейрофиброме, в то время как CD34, показанный на рисунке 5H, помечает загадочную дендритную популяцию клеток, которые, как предполагается, являются либо субпопуляцией резидентных тканевых макрофагов³⁰ , либо новой популяцией клеток нервной оболочки, которые не являются ни шванновскими клетками, ни фибробластами³¹.

Рисунок 6 включен для того, чтобы можно было сравнить плексиформные нейрофибромы человека и MPNST с опухолями, наблюдаемыми у мышей P 0-GGFβ3, и предоставить репрезентативные примеры некоторых типов опухолей человека, которые можно спутать с MPNST. На рисунке 6А показана плексиформная нейрофиброма, возникшая в плечевом сплетении пациента с НФ1. в то время как на рисунке 6B представлена МПНСТ IV степени ВОЗ, возникшая в пределах той же плексиформной нейрофибромы. На рисунке 6B показаны некоторые характерные признаки IV степени MPNST по классификации ВОЗ, включая выраженную гиперцеллюлярность и клеточную атипию, оживленную митотическую активность и некроз опухоли. Для сравнения, на рисунке 6C показан МПНСТ II степени по классификации ВОЗ, который имеет значительную клеточную атипию, но является менее гиперклеточным, чем МПНСТ IV степени, и, несмотря на наличие митозов, демонстрирует меньшую митотическую активность. На рисунке 6D показана фибросаркома с характерным «елочком» рисунком переплетения оболочек опухолевых клеток. Однако этот паттерн не обязательно отличает фибросаркому от МПНСТ, потому что некоторые МПНСТ будут иметь схожую картину. Кроме того, более мощное представление, представленное на рисунке 6E, показывает морфологию клеток, аналогичную той, которая наблюдается у ВОЗ MPNST IV степени, представленной на рисунке 6B. На рисунке 6F показана лейомиосаркома. В отличие от большинства МПНСТ, лейомиосаркомы иммунореактивны к мышечным маркерам, таким как гладкомышечный актин и десмин. Тем не менее, иммунореактивность гладкомышечного актина может варьироваться от опухоли к опухоли, при этом некоторые опухоли демонстрируют интенсивную однородную иммунореактивность (Рисунок 6G), а другие демонстрируют иммунореактивность, которая показывает клеточную изменчивость в опухоли (Рисунок 6H). Иммунореактивность десмина также может быть неоднородной при лейомиосаркомах (рис. 6I). Меланомы очень вариабельны по морфологии, при этом некоторые опухоли состоят из полигональных клеток (рис. 6J), а другие — из веретенообразных клеток, которые могут имитировать морфологию клеток MPNST. Меланомы можно отличить от МПНСТ по иммунореактивности к меланосомным маркерам, таким как MART1 (рис. 6K). Тем не менее, меланомы, такие как MPNST, часто являются положительными на S100β и Sox10 (рис. 6L).

На рисунке 7 показаны патологические особенности МПНТ II, III и IV степени ВОЗ, выделенных у мышей линии P0-GGFβ3. На рисунке 8 представлены репрезентативные изображения клеток P 0-GGFβ3 MPNST с ранним пассажем при низкой (рис. 7A) и высокой (рис. 7B) мощности. Опухолегенность этих клеток демонстрируется как их способностью образовывать колонии при суспензии в мягком агаре (рис. 7В), так и образовывать трансплантаты при подкожной аллотрансплантации у мышей с иммунодефицитом (рис. 7D).

Рисунок 1: Рабочий процесс, используемый для обработки опухолей и других тканей мышей P 0-GGFβ3. (А) Хорошо видимые опухоли собирают и сегментируют на три части для 1) фиксации в 4% параформальдегиде с последующей иммуногистохимией и гистохимией, 2) установления культуры опухолевых клеток на ранних стадиях и/или геномного анализа, и 3) мгновенного замораживания с использованием жидкого азота для выделения белка, ДНК или РНК. (Б) После иссечения опухоли тело мыши фиксируют в 4% параформальдегиде и удаляют внутренние органы. Эти органы отбираются для гистологического исследования с целью выявления микроскопических признаков новообразований и других патологических процессов. В) После удаления внутренних органов с туши удаляют конечности (голову, конечности, хвост) и кожу. Позвоночный столб, прилегающие ребра и прилегающие скелетные мышцы декальцинируются с помощью 0,3 М ЭДТА/4% параформальдегида (рН 8,0). Затем декальцинированные ткани закапывают парафином, а срезы тканей подготавливают для иммуногистохимического и гистохимического исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения грубо выраженных нейрофибром и MPNST у мышей P 0-GGFβ3. (A) Мышь P 0-GGFβ3 с большой грубо выраженной опухолью на правом боку (стрелка). (B) МРТ этой мыши показывает, что опухоль связана с седалищным нервом (наконечником стрелы) и что она проросла через вышележащую фасцию и расширилась в подкожной клетчатке (стрелка, объемная опухолевая масса). (C) Микроскопическое исследование этой опухоли показывает, что, несмотря на ее большие размеры, опухоль является нейрофибромой. (D) Крупный мясистый MPNST, возникший в плечевом сплетении мыши P 0-GGFβ3. Масштабная линейка = 100 мкм. (C). Сокращения: MPNST = злокачественные опухоли оболочки периферических нервов; МРТ = магнитно-резонансная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные изображения МПНСТ, декальцинированного позвоночного столба и нейрофибром, подготовленные в соответствии с разделом 1 протокола. (А-Я) Иссеченные и окрашенные H&E-P 0-GGFβ3 MPNST демонстрируют гистологическую вариабельность. Все образы являются независимо возникающими МПНСТ. Несмотря на эту гистологическую вариабельность, все эти опухоли имели соответствующую маркировку маркеров MPNST, указанных в таблице 1. Масштабные линейки = 200 мкм. (K) Репрезентативное изображение поперечного сечения декальцинированного позвоночного столба, окрашенного H&E. На этом изображении легко визуализируются следующие структуры: спинной мозг; позвоночная кость; ганглии дорсального корешка на дорсальном корешке спинномозгового нерва; и паравертебральные скелетные мышцы. Увеличение в 4 раза. (L) Изображение спинного мозга и позвонков с более высокой мощностью, показанное на рисунке K, демонстрирует надлежащий внешний вид кости после декальцинации с помощью этой методики. Увеличение 10x. (M) Репрезентативное изображение нейрофибромы спинного нервного корешка у мыши P 0-GGFβ3. Увеличение 40x. Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: MPNST = злокачественные опухоли оболочки периферических нервов; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Диагностическое окрашивание, используемое для первичной идентификации плексиформных нейрофибром и их отличия от МПНСТ. (A) Иммуноокрашивание на S100β при плексиформной нейрофиброме P 0-GGFβ3. Обратите внимание, что интенсивное коричневое окрашивание этого антигена присутствует только в подмножестве клеток этой опухоли, что согласуется с тем фактом, что нейрофибромы состоят из опухолевых шванновских клеток и множества других неопухолевых типов клеток. (B) Иммунофлуоресцентное_{изображение} P0-GGFβ3 MPNST, окрашенного для промежуточной нити накаливания нестина (красный) и окрашенного бисбензимидом (синий, ядерный окраситель). (C) MPNST, окрашенный на транскрипционный фактор Sox10. Интенсивная иммунореактивность (коричневая) проявляется в ядрах подмножества опухолевых клеток. (D) Мощный вид плексиформной нейрофибромы P 0-GGFβ3 после окрашивания по методу Унна. Этот краситель производит метахроматическое (фиолетовое) окрашивание гранул в тучных клетках. Плексиформные нейрофибромы можно отличить от МПНСТ, потому что в последних отсутствуют тучные клетки. (Д,Ж) Иммуногистохимический анализ Ki67 в (E) a P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroma и (F) a P_0-GGFβ3 MPNST. Оба участка были окрашены гематоксилином (синее ядерное окрашивание), при этом иммунореактивность Ki67 проявляется в виде коричневого ядерного окрашивания в этих иммунопероксидазных красителях. Обратите внимание, что при плексиформной нейрофиброме не наблюдается коричневого ядерного окрашивания, в то время как большинство ядер опухолевых клеток являются положительными при МПНСТ. Масштабные линейки = 100 мкм. Аббревиатура: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Репрезентативные изображения иммунокрасителей, используемых для идентификации субпопуляций клеток, составляющих нейрофибромы. Эти иммунофлуоресцентные изображения дермальной нейрофибромы человека были окрашены на (A) CD117 (c-Kit; маркер тучных клеток), (B) CD163 (макрофаги M2), (C) CD86 (макрофаги M1), (D) Iba1 (маркер панмакрофагов), (E) Sox10 (маркер шванновских клеток), (F) TCF4 (маркер фибробластов), (G) CD31 (маркер сосудистой сети) и (H) CD34 (обозначает отдельную, плохо изученную субпопуляцию клеток в нейрофибромах). Увеличение 60x, масштабные линейки = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Репрезентативные изображения плексиформных нейрофибром, МПНТ и некоторых других типов опухолей человека, которые учитываются в дифференциальной диагностике МПНСТ. (А) Плексиформная нейрофиброма, возникающая в плечевом сплетении пациента с НФ1, демонстрирующая общую более низкую клеточность и доброкачественный вид этого новообразования. Несмотря на то, что это не так легко визуализировать на срезах, окрашенных H&E, сложная смесь типов клеток присутствует. Митозов не видно. Увеличение: 40x. (B) МПНСТ IV степени по классификации ВОЗ, возникшая из плексиформной нейрофибромы, проиллюстрированной на рисунке А. Обратите внимание на гораздо более высокую степень ячеистости. Стрелка указывает на митотическую фигуру, а звездочка обозначает область некроза опухоли в верхней правой части этого микроскопического поля. Увеличение: 40x. (C) A ВОЗ II класс MPNST. Эта опухоль имеет более низкую степень клеточности, чем IV степень MPNST, проиллюстрированная ВОЗ на рисунке B. Тем не менее, ядерная атипия и гиперхромазия встречаются чаще, чем при плексиформной нейрофиброме, проиллюстрированной на рисунке А. Стрелка указывает на одну из случайных митотических фигур, которые встречались в этом новообразовании. Увеличение: 63x. (D) Маломощный снимок фибросаркомы взрослого типа, иллюстрирующий рисунок «елочки» (переплетающиеся оболочки опухолевых клеток), обычно наблюдаемый при этом типе опухоли. К сожалению, архитектура «елочка» также встречается у некоторых МПНСТ человека и поэтому не может быть использована для различения фибросарком и МПНСТ. Увеличение: 20x. (E) Более мощный взгляд на фибросаркому, проиллюстрированный в D. Обратите внимание на сходство между клеточной морфологией при этой фибросаркоме и клеточной морфологией, наблюдаемой при МПНСТ IV степени ВОЗ, показанной в B. Увеличение: 40x. (F) Мощное изображение лейомиосаркомы, демонстрирующее клеточную морфологию, которая находится в пределах диапазона вариаций, наблюдаемых у MPNST. Увеличение: 40x. (G) Иммуноокрашивание гладкомышечного актина при лейомиосаркоме, проиллюстрированное на рисунке F. Следует отметить, что опухолевые клетки демонстрируют равномерную интенсивную иммунореактивность к этому антигену. Увеличение: 40x. (H) Иммуноокрашивание гладкомышечного актина при другой лейомиосаркоме. При этой опухоли наблюдается большая вариабельность степени иммунореактивности, при этом некоторые клетки окрашиваются более интенсивно, чем другие. Нередки случаи, когда иммунореактивность одного и того же антигена равномерно присутствует в одной опухоли и присутствует только в подмножестве опухолевых клеток в другом новообразовании. Увеличение: 40x. (I) Иммуноокраска десмина при третьей лейомиосаркоме. В этой опухоли только подмножество опухолевых клеток обладает интенсивной иммунореактивностью к этому антигену. (J) Метастатическая меланома. Меланомы печально известны тем, что имеют очень вариабельную морфологию, которая может варьироваться от кубовидной до веретенообразной; опухоли с последней морфологией, скорее всего, будут спутаны с MPNST, особенно с учетом того, что как меланомы, так и MPNST могут демонстрировать иммунореактивность S100β и Sox10. Увеличение: 40x. (K) Иммунореактивность маркера меланомы MART1 в опухоли, проиллюстрированной в J. Увеличение: 40x. (L) Ядерная иммунореактивность к транскрипционному фактору Sox10 в меланоме, показанной в J. Увеличение: 40x, масштабные линейки = 100 мкм. Аббревиатура: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Репрезентативные изображения МПНТС ВОЗ II-IV степени P 0-GGFβ3 MPNST. (А) Микрофотографии малой и (Б) высокой мощности МПНСТ II степени по классификации ВОЗ. Обратите внимание, что клеточная активность ниже, чем у МПНСТ III степени ВОЗ, показанной на панели C, и что ядра опухолевых клеток на панели D более гиперхромные (темные), чем те, которые видны на панели B. (C) Микрофотографии малой и (D) высокой мощности МПНСТ III класса по классификации ВОЗ. Эта опухоль демонстрировала >4 митотических показателя на 10 высокомощных полей, при этом клетки были более плотно упакованы и более гиперхроматическими, атипичными ядрами. (E) Низко- и (F) высокомощные представления ВОЗ IV класса MPNST. Обратите внимание на очаг некроза в нижней центральной части панели F. Низкое энергопотребление = 20x. Высокая мощность = 40x, масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Репрезентативные изображения клеток MPNST с ранним пассажем P 0-GGFβ3 и их опухолегенность, продемонстрированная ростом мягкого агара и их способностью расти в виде аллотрансплантатов. (A) Низко- и (B) высокомощные фазово-контрастные изображения клеток P_0-GGFβ3 MPNST с ранним пассажем. (C) клетки P 0-GGFβ3 MPNST, выращенные в мягком агаре и окрашенные суданской черной; Колонии проявляются в виде черных точечных в агаре. (D) Окрашенное гематоксилином и эозином изображение опухоли, которая образовалась после того, как клетки P 0-GGFβ3 MPNST были аллотрансплантированы подкожно мыши с иммунодефицитом, как описано в протоколе. (E) Пролиферация клеток P 0-GGFβ3 MPNST с ранним пассажем в течение 5-дневного периода, определяемая с помощью цитометра Celigo Image. Низкая мощность = 10x, высокая мощность = 40x; Масштабная линейка = 100 мкм для всех панелей Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Имя	Употребление	Видовая реактивность/класс
КД117	Предварительно разбавленный	кролик моноклональный
КД163	1:200	мышь моноклон
КД31	1:50	Кролик поликлональный
КД34	1:2000	кролик моноклональный
КД86	1:1000	кролик моноклональный
Цитокератин	1 мкг/мл	мышь моноклональная
Десмин	1:50	мышь моноклональная
Иба1	1:500	Поликлональный кролик
Ки-67	1:50	кролик моноклональный
МАРТ1	1 мкг/мл	мышь моноклональная
Нестин	1:1,000	мышь моноклональная
ПМЭЛ	1:100	Раббот моноклональный
С100Б	1:200	Кролик поликлональный
СМА	1:100	мышь моноклональная
Сокс10	1:10	мышь моноклональная
ТКФ4/ТКФЛ2	1:100	кролик моноклональный

Таблица 1: Антитела, применяемые для диагностики плексиформной нейрофибромы и злокачественных опухолей оболочки периферических нервов. Антитела, используемые для рутинной идентификации плексиформных нейрофибром GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), диагностики MPNST и полной оценки других типов клеток, присутствующих в нейрофибромах. Аббревиатура: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва.

		S100β	Нестин	Сокс10	МАРТ1	ПМЭЛ	Десмин	Гладкомышечный актин	Цитокератин	SS18-SSX Фьюжн
МПНСТ		50-90%, обычно фокусные	Положительный1	~30%	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная
Фибросаркома		Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная
Лейомиосаркома		Редкий	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	50-100%	Положительная	~40%	Отрицательная
Эпителиоидная саркома		Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Положительная	Отрицательная
Меланома		Положительная	Положительная	85%	Положительная	Положительная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная
Монофазная синовиальная саркома		~30%	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Отрицательная	Положительная	Положительная

Таблица 2: Маркеры, используемые для установления идентичности опухоли у человека. Эти иммуногистохимические и гистохимические маркеры вместе с оценкой микроскопической морфологии опухоли используются для того, чтобы отличить МПНСТ от других новообразований, которые их имитируют. Дифференциальный диагноз, обычно рассматриваемый для МПНТ человека, включает фибросаркому взрослого типа, эпителоидную саркому, лейомиосаркому, монофазную синовиальную саркому и меланому. Фибросаркомы взрослого типа имеют рисунок «елочка» под микроскопом и окрашиваются на виментин, но не на S100β. Лейомиосаркомы, но не МПНСТ, иммунореактивны к десмину; Лейомиосаркомы также имеют ядра с выраженной тупой морфологией. Эпителиоидные саркомы, но не МПНСТ, являются иммунореактивными к цитокератину. Меланомы, как и MPNST, могут быть S100β-положительными, но также иммунореактивными к MART-1 и PMEL. Аббревиатура: MPNST = злокачественная опухоль оболочки периферического нерва. ¹Комбинация S100β и нестина высоко прогностирует MPNST.

Discussion

Представленные здесь гистологические и биохимические методы обеспечивают основу для диагностики и характеристики GEM-моделей нейрофибромы и патогенеза MPNST. На протяжении многих лет мы обнаружили, что эти методики весьма полезны для оценки патологии опухолей оболочки периферических нервов, возникающих в моделях GEM 21,25,26. Однако, несмотря на то, что протоколы, изложенные здесь, полезны для определения того, насколько точно опухоли в моделях GEM повторяют патологию своих человеческих аналогов, существуют некоторые ограничения для этих стратегий, которые следует оценить. Начнем с того, что мыши P 0-GGFβ3 демонстрируют практически полную пенетрантность своего опухолевого фенотипа, что позволяет относительно легко получить большое количество мышей с нейрофибромами и MPNST 21,25,26, которые могут быть использованы для геномных исследований и геномных скринингов шРНК. Высокая пенетрантность фенотипа в этой модели также делает мышей P 0-GGFβ3 весьма полезными для доклинических испытаний. Следует, однако, признать, что это не относится ко всем моделям рака GEM. Вот почему мы подчеркнули важность определения доли животных, у которых можно предсказать развитие опухолей. При работе с животной моделью, на которой опухоли развиваются реже, мы считаем целесообразным использовать методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография или позитронно-эмиссионная томография, для окончательной идентификации животных, несущих опухоли, которые могут быть включены в доклинические испытания или другие исследования. Однако этот подход может быть непомерно дорогим, если требуется повторное сканирование. Вот почему мы также подчеркнули важность установления среднего времени выживания интересующей нас модели GEM,²⁶ - понимание того, когда у животного можно ожидать развития опухоли, уменьшает количество сканирований, необходимых для идентификации животных с желаемым фенотипом, и связанные с этим затраты.

Также важно понимать, что большая опухоль у мыши на самом деле представляет собой довольно небольшое количество ткани. В этом протоколе мы рекомендуем процесс, при котором опухолевая ткань разделяется на три части, при этом части посвящены гистологии/иммуногистохимии, установлению культур клеток раннего пассажа и выделению интересующих биомолекул (белков, РНК, ДНК). Тем не менее, размер опухоли будет варьироваться, и если опухоль довольно маленькая, это может помешать наличию достаточного количества ткани для деления таким образом. В этом случае исследователь должен определить, является ли приоритетом диагностика опухоли или иное использование опухолевой ткани³². В этих обстоятельствах наше предубеждение заключается в том, что мы должны иметь правильный диагноз, чтобы понять, с чем мы работаем, прежде чем приступать к другим экспериментам. Мы обнаружили, что диагноз опухоли обычно может быть легко установлен с использованием менее трети новообразования. При работе с небольшими опухолями мы, как правило, удаляем небольшой фрагмент опухолевой ткани, заворачиваем его в гистологическую ткань и помещаем в тканевую кассету, чтобы гарантировать, что ткань не будет потеряна во время обработки. Недостаток этого подхода заключается в том, что он может привести к тому, что исследователь может занизить оценку новообразования, если требуется оценка ВОЗ; Это связано с тем, что в раковых опухолях обычно сосуществуют участки с более низкой и более высокой степенью злокачественности, и, если берется очень маленький образец, полученная степень будет зависеть от того, откуда был взят образец опухоли.

Протоколы, которые мы описываем для установления идентичности опухоли оболочки периферического нерва, в значительной степени зависят от иммуногистохимии. Несмотря на то, что время от времени существуют альтернативные подходы, которые могут быть использованы для некоторых типов клеток (например, окрашивание по методу Унна для идентификации тучных клеток), это не всегда верно для большинства типов клеток, присутствующих в нейрофибромах и MPNST. Следовательно, необходимо уделять большое внимание тому, чтобы убедиться, что иммуногистохимические процедуры, которые будут использоваться, были должным образом оптимизированы. По нашему опыту, некоторые проблемы могут поставить под угрозу диагностическую иммуногистохимию. Критически важно, чтобы исследователь выполнил серию разведения с первичным антителом, которое он ранее не использовал; Кроме того, при использовании новой партии антитела, которая была предварительно оптимизирована³³, следует проводить разбавительную серию. Также необходимо позаботиться о том, чтобы под рукой были свежие партии реагентов. По нашему опыту, когда они стареют, перекись водорода и DAB особенно склонны не работать должным образом, что может привести к тому, что исследователь неправильно решит, что их красители отрицательные.

Иммуногистохимические профили, которые мы описываем для плексиформных нейрофибром, МПНСТ и различных типов новообразований, которые учитываются при дифференциальной диагностике МПНСТ, являются теми, с которыми мы чаще всего сталкивались 21,25,26,34. Однако, поскольку дивергентная дифференциация не является редкостью при MPNST и других злокачественных новообразованиях, исследователь может столкнуться с профилями окрашивания, которые несколько отличаются от того, что мы здесь описываем. Именно поэтому мы настоятельно рекомендуем, чтобы в состав команды, характеризующей новую модель онкогенеза GEM, входил опытный человеко- или ветеринарный патологоанатом. В этом протоколе мы применили классификацию ВОЗ к ВДМО и МПНСТ человека. Мы предпочитаем эту систему оценок, потому что критерии оценки относительно четко определены и их легко сравнивать между человеком и мышью MPNST ^2,28. Тем не менее, мы хотели бы отметить, что критерии классификации ВОЗ не единообразно приняты патологоанатомами. Это связано с тем, что неясно, являются ли три оценки ВОЗ, применяемые к MPNST, прогностическими для клинических исходов у пациентов. Из-за этого многие патологоанатомы предпочитают классифицировать MPNST просто как низкодифференцированные или высокодифференцированные злокачественные новообразования. При таком подходе примерно 85% МПНСТ считаются злокачественными новообразованиями высокой степени злокачественности, характеризующимися высокой митотической активностью, выраженной клеточной атипией и гиперхромазией, которые могут сопровождаться некрозом опухоли. Низкодифференцированные МПНСТ демонстрируют меньшую клеточность, гиперхромазию и митотическую активность.

Мы обнаружили, что аллотрансплантат клеток раннего пассажа MPNST является простым средством проверки опухолегенности этих культур. Тем не менее, некоторые вопросы следует учитывать, когда клетки не устанавливают аллотрансплантат³². По нашему опыту, в то время как подавляющее большинство клеток MPNST с ранним пассажем устанавливают аллотрансплантат, мы иногда сталкивались с культурами раннего пассажа, которые этого не делают. Несмотря на эту неудачу, сравнительная геномная гибридизация (aCGH) и секвенирование всего экзома показали, что эти культуры раннего пассажа имели множественные геномные аномалии, согласующиеся с тем, что они являются опухолевыми клетками^25,26. Мы также обнаружили культуры с ранним пассажем, которые не являются здоровыми, обычно потому, что культурам было позволено слиться до того, как они были собраны для прививки. Клетки, поврежденные в результате грубого обращения (например, чрезмерно долго инкубируемые с неферментативным раствором клеточной диссоциации, пипетированным вверх и вниз чрезмерное количество раз), также плохо показывают себя при трансплантации. Мы также хотели бы отметить, что сроки, которые мы указали для приживления трансплантата, являются приблизительными, основанными на нашем опыте. Иногда мы сталкивались с культурами раннего пассажа, которые успешно приживаются аллотрансплантатами, но для этого требуется больше времени.

Подходы, изложенные выше, предоставляют всестороннюю возможность охарактеризовать ключевые аспекты недавно разработанной GEM-модели неоплазии периферической нервной системы и правильно диагностировать любые нейрофибромы и МПНСТ, которые развиваются у этих животных. Описанные нами методы установления ранних пассажных культур MPNST и использования этих культур для аллотрансплантата также дают четкие доказательства опухолегенности новообразований, выявленных в моделях GEM. Подчеркнем, что мы не проводим отбор отдельных клонов при создании ранних пассажных культур. Хотя мы признаем, что некоторый отбор неизбежен при размещении опухолевых клеток в культурах, эти первоначальные результаты свидетельствуют о том, что мутации, идентифицированные в культурах GEM MPNST с ранним пассажем, остаются очень похожими на те, которые присутствуют в родительской опухоли. Однако, используя aCGH, мы также обнаружили, что продолжение переноса этих ранних пассажей культур для более длительных пассажей приводит к геномным изменениям, которые начинают отличаться от того, что наблюдается в более ранних пассажах этих опухолевых клеток.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 мм планшеты для культивирования тканей	Corning Falcon	353003
3,3'- диаминобензидин (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6-луночные планшеты	Corning Costar	3516
Уксусная кислота	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 вторичная (козья антимышь)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 вторичный (козий против мышей)	Invitrogen	A21043 или A11004
Alexa Fluor 568 вторичный (козий против кроликов)	Invitrogen	A11036
Хлорид аммония (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Anasay Kit	Thermo Scientific	23225
Бычья сыворотка альбумин	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Скребок для клеток	Sarstedt	83.183
Стриппер для клеток	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Гибрид Citrisolve (растворитель на основе d-лимонена)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Цитокератин	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	клон D33 (M0760)
Диаминобенсиздин (DAB) Раствор	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Этанол (200 пруф)	Decon Laboratories	2716
Сыворотка эмбриона теленка	Omega Scientific	FB-01
Вилксолин	Сигма-Олдрич	F6886
Глицерин	Сигма-Олдрич	G6279
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)	Corning	21-022-CV
Гематоксилин Харриса	Фишербранд	245-677
Гемацитометр	Brightline-Hauser Scientific	1490
Соляная кислота Фишера	Scientific	A144-212
Перекись водорода	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (пероксидаза) полимерный набор, мышь на мышах	векторные лаборатории	MP-2400
ImmPRESS HRP (пероксидаза) полимерный набор, лошади против кроликов	векторные лаборатории	MP-7401
Инкубатор	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 инкубатор
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Изопропанол	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
жидким азотом
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Микротом
Nestin	Millipore	Человек: MAD5236 (10C2), Человек: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	Made	by S.L.C. (также доступен как 396-HB-050/CF от R& D Systems)
Нейрофибромин	Санта Круз Биотехнология	SC-67
НОД. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ мыши	Jackson Laboratory	5557
Обезжиренное сухое молоко	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ 3 мыши	В доме
Парафин Воск	Leica	Paraplast 39601006
Парапленка M	Sigma-Aldrich	PM-999
Параформальдегид (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Ксилоловая монтажная среда)	Fisher Scientific	SP15-100
pH-метр	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Фосфатный буферный физиологический раствор (болезнь Дульбекко)	Corning	20-031-CV
	PMEL ABCAM	EP4863(2), ab137078
Поли-Л-Лизин Гидробромид	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Портативный изофлюренсный аппарат	VetEquip Ингаляционные системы
анестезии PVA-DABCO (водная монтажная среда)	Millipore Sigma	10981100ML
Рисоварка	Бук Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (сейчас GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	клон 1A4
Хлорид натрия	Fisher	Scientific S640
Цитрат натрия (дигидрат)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Стальная гистологическая форма
Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопа	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Клеточная сигнализация	(CH48H11) #2569
Тканевая кассета
Толуидин синий	ACROS Organics	348600050
Тритон X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Тризол	Инвитроген	15596026
Трипсин	Corning	25-051-31