Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Влияние Desmodium caudatum на гормоны желудочно-кишечного тракта и кишечную флору у крыс с гастритом

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65744

⸱

1 марта 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory for Quality Control and Evaluation of Traditional Chinese Medicine of Mianyang City, Mianyang Normal University, 2The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает метод анализа кишечной флоры с помощью секвенирования гена 16S рРНК на основе Illumina и обеспечивает основу для оценки эффективности травяных отваров.

Аннотация

С целью предварительного изучения влияния Desmodium caudatum на гастрит и кишечную флору у крыс была создана модель хронического гастрита крыс с использованием классического метода салицилата натрия. Восемнадцать крыс с SPF были разделены на три группы: контрольную группу (группа С), модельную группу (группа М) и группу лечения (группа Т). Патологические срезы стенки желудка были взяты у крыс в каждой группе. Кроме того, концентрации гастрина и малонового диальдегида в сыворотке крови крыс в каждой группе определяли методом ИФА. Кроме того, влияние D. caudatum на кишечную флору крыс с гастритом было изучено путем детального сравнения бактериальных сообществ кишечника в трех группах с использованием секвенирования гена 16S рРНК на основе Illumina. Результаты показали, что отвар D. caudatum может снизить содержание малонового диальдегида и увеличить содержание гастрина. Кроме того, было обнаружено, что отвар D. caudatum усиливает разнообразие и обилие кишечной флоры, оказывая положительное влияние на лечение гастрита, регулируя и восстанавливая кишечную флору.

Введение

Хронический гастрит (ХГ), одно из наиболее распространенных клинических заболеваний, характеризуется хроническими и стойкими воспалительными изменениями эпителия слизистой оболочки желудка, который часто и многократно атакуется различными патогеннымифакторами1. Уровень заболеваемости ХГ занимает первое место среди всех видов заболеваний желудка, составляя от 40% до 60% от общего объема амбулаторного обслуживания в отделении гастроэнтерологии2. Более того, уровень заболеваемости, как правило, увеличивается с возрастом, особенно у лиц среднегои старшего возраста. Несомненно, компьютерная графика значительно снижает качество жизни людей, подчеркивая острую необходимость открытия новых терапевтических агентов.

Многочисленные исследования показали, что возникновение и развитие ХГ связано с секрецией желудочно-кишечных гормонов, таких как гастрин (ГАС)4,5. GAS, распространенный пептидный гормон желудочно-кишечного тракта в пищеварительном тракте, стимулирует клетки к секреции желудочной кислоты, способствуя высвобождению гистамина из эозинофилов. Кроме того, он улучшает питание и кровоснабжение слизистой оболочки желудка, способствуя пролиферации слизистой оболочки желудка и париетальных клеток6. Таким образом, гастрин может быть использован в качестве индикатора для оценки уровня развития ХГ. Кроме того, продукты перекисного окисления липидов, вызванные реактивными оксидами, могут активировать воспалительные клетки, что приводит к ХГ. Малоновый диальдегид (МДА), маркер перекисного окисления липидов, является широко используемым индикатором для измерения степени окислительного стресса. Он в определенной степени отражает уровень свободных радикалов в слизистой оболочке желудка. Уровень MDA может свидетельствовать о атаке ненасыщенных жирных кислот в местной слизистой оболочке желудка, вызванной свободными радикалами 7,8.

Микроэкология кишечника состоит из миллионов микроорганизмов, живущих в кишечнике хозяина, играющих жизненно важную роль в поддержании здоровья хозяина и регулировании иммунитета хозяина. Здоровая кишечная флора, отличающаяся высоким богатством, разнообразием и стабильной функцией микробиоты, действует как защитный барьер от вторжения патогенных микроорганизмов, участвуя в обмене веществ. Нарушения кишечной флоры делают людей более восприимчивыми к острым и хроническим заболеваниям желудочно-кишечного тракта 9,10. В последние годы терапия микробиотой при заболеваниях желудочно-кишечного тракта быстро прогрессировала и продемонстрировала значительную эффективность11. Таким образом, учет кишечной флоры имеет решающее значение для понимания и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Являясь неотъемлемым компонентом сокровищницы традиционной китайской медицины, народные лекарственные материалы имеют большое значение для клинической практики и модернизации национальной медицины. Корни и целые части Desmodium caudatum (Thunb.) DC. широко используется для облегчения дискомфорта в желудке в районе Бэйчуань Цян города Мяньян в течение длительного периода времени. В некоторых статьях указывается научная основа лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта с помощью D. caudatum, приводятся его эффекты, такие как гемостаз, антиоксидантное действие и защита желудочно-кишечного тракта 12,13,14. Однако из-за отсутствия глубоких исследований механизм клинической фармакодинамики не установлен. Целью данной статьи является изучение эффектов D. caudatum в лечении гастрита на основе гормонов желудочно-кишечного тракта и кишечной флоры, обеспечение основы для его рационального клинического применения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры по уходу за животными и их использованию были одобрены Комитетом по этике Мяньянского педагогического университета, и все соответствующие институциональные и правительственные правила, касающиеся этичного использования животных, строго соблюдались. Для настоящего исследования использовали крыс с SPF (куньминские виды, самцы и самки, массой 180-220 г). Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Все животные содержались в среде, свободной от патогенов, и обеспечивали свободный доступ к пище.

1. Приготовление реагентов

  1. Приготовьте 5%-ный раствор салицилата натрия, взвесив 2,5 г порошка салицилата натрия (см. таблицу материалов) с помощью электронных весов. Растворите порошок в небольшом количестве дистиллированной воды и разведите его до общего объема 50 мл.
  2. Готовят отвар D. caudatum (12,8 г/кг). Взвесьте 128 г D. caudatum (см. таблицу материалов), поместите его в колбу с круглым дном, содержащую 1000 мл лабораторной дистиллированной воды, и сконцентрируйте ее до конечного объема 100 мл.

2. Группировка и администрирование

  1. Разделите крыс на разные группы и внутрижелудочно вводите необходимые растворы.
    Примечание: В настоящем исследовании 18 крыс (9 самцов, 9 самок) были разделены на три группы: контрольную группу (группа С), модельную группу (группа М) и группу лечения (группа Т), по 6 крыс в каждой группе. Контрольная группа получала физиологический раствор, а модельная группа получала 5% раствор салицилата натрия в течение 5 недель в дозе 10 мл/кг/сут15. Группу лечения предварительно обрабатывали 5% раствором салицилата натрия в течение 5 недель в дозе 10 мл/кг/сут с последующим введением отвара D. caudatum в дозировке 1 мл/100 г в течение10 дней 15,16.
  2. В последний день эксперимента соберите фекалии крыс в сухие и стерильные пробирки микроцентрифуг методом17 и заморозьте их в сверхнизкотемпературной морозильной камере с жидким азотом.
  3. После окончания отбора проб жертвовать крыс путем вывиха шейки матки (следуя институционально утвержденным протоколам). Вскрыть брюшную полость ножницами, чтобы обнажить брюшную аорту.
    1. Введите иглу (23-25 Г) почти параллельно брюшной аорте, соберите сыворотку и храните ее в морозильной камере при сверхнизкой температуре. Желудки вынуть из брюшной полости16 и замочить в 10% растворе формалина для консервации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В группе М модель хронического гастрита считается успешной, если слизистая оболочка желудка расширена и перегружена с нормальной железистой морфологией15, при этом наблюдается небольшое количество воспалительной клеточной инфильтрации в собственной пластинке.

3. Патологический срез стенки желудка

  1. Возьмите образцы стенок желудка у крыс в каждой группе для патологоанатомических срезов. В последующем проводят рутинное окрашивание гематоксилин-эозином для наблюдения и анализа патологических изменений18.

4. Определение гормонов желудочно-кишечного тракта в сыворотке крови

  1. В пробе сыворотки крови определяют содержание гастрина (ГАС) и малонового диальдегида (МДА)19 с помощью ИФА в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Используйте для анализа считыватель микропланшетов.

5. Экстракция общей ДНК кала, амплификация и очистка ПЦР

  1. Выполните экстракцию микробной ДНК с помощью имеющегося в продаже набора для выделения ДНК (см. таблицу материалов) и определите концентрацию и чистоту с помощью УФ-ВИД спектрофотометра16. В последующем оценивают целостность ДНК с помощью электрофореза в 1% агарозном геле18.
  2. Амплифицируют ген рРНК бактерий 16S с помощью праймеров 338F (5′-ACT CCT, ACG, GGA, GGC, AGC, AG-3′) и 806R (5′-GAC TAC, HVG, GGG, GTW, TCT, AT-3′) с помощью ПЦР-системы с амплификатором17. Грунтовки получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте программе ПЦР: денатурация (3 мин, 95 °C), затем 27 циклов (30 с, 95 °C; 30 с, 55 °C; 45 с, 72 °C) и окончательное продление (10 мин, 72 °C). Проводят ПЦР-реакции со следующими компонентами: 4 мкл 5× ДНК-полимеразного буфера, 2 мкл 2,5 мМ dNTP, 0,8 мкл каждого праймера (5 мкМ), 0,4 мкл ДНК-полимеразы и 10 нг матричной ДНК (см. таблицу материалов).
  3. Экстракция, очистка и количественное определение продуктов ПЦР последовательно с использованием 2% агарозного геля, коммерчески доступного набора для экстракции геля ДНК и флуориметра соответственно17.

6. Секвенирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 6 и 7 выполняются в соответствии с ранее опубликованными методами20,21.

  1. Используйте платформу Illumina для секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один конец фрагмента ДНК дополняет основание разъема, встроенного в чип, закрепляя его на чипе. Другой конец хаотично дополняет основание другого соседнего заглубленного сустава, образуя «мостик».
  2. Выполните ПЦР-амплификацию для получения кластеров ДНК. Линеаризация амплификаторов ДНК в отдельные нити.
  3. Введите измененную ДНК-полимеразу вместе с дезоксирибонуклеотидтрифосфатами (dNTP) с четырьмя различными флуоресцентными маркерами. Синтезируйте только одно основание за цикл.
  4. Используйте лазер для сканирования поверхности реакционной пластины и определения типов нуклеотидов, полимеризующихся во время начальной реакции каждой шаблонной последовательности.
  5. Химически расщепляют «флуоресцентную группу» и «концевую группу», чтобы восстановить 3'-липкий конец. Впоследствии переходят к полимеризации второго нуклеотида.
  6. Получите последовательность матричных фрагментов ДНК, проанализировав результаты флуоресцентного сигнала, собранные в каждом раунде.

7. Обработка данных секвенирования

  1. Во-первых, обрежьте чтение необработанных данных fastq на любом сайте с оценкой < Q20 и исключите чтение с неопределенными базами. Кроме того, допускают два несоответствия в точно подобранных грунтовках. Затем объедините последовательности с перекрытием >10.н.
  2. Кластеризуйте оперативные таксономические единицы (OTU) со сходством 97% с помощью UPARSE и удалите химерные последовательности с помощью UCHIME20,21.
  3. Используйте алгоритм RDP Classifier для анализа таксономии каждой последовательности гена 16S рРНК по базе данных 16S рРНК Silva (SSU123) с использованием доверительного порога 70%.
  4. Выполните анализ альфа-разнесения и анализ бета-разнесения, используя Mothur и Qiime соответственно (см. таблицу материалов).

8. Статистический анализ

  1. Проанализируйте данные этого исследования с помощью программного обеспечения для статистического анализа (см. Таблицу материалов). Используйте односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для сравнения между несколькими группами и тест наименьшей значимой разницы (LSD) для сравнения между двумя группами.
  2. Считайте P < 0,05 статистически значимыми во всех сравнениях. P < 0,01 считается чрезвычайно значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Результаты патологического среза стенки желудка изображены на рисунке 1. По сравнению с группой С, в группе М наблюдалась легкая атрофия стенки желудка и легкое воспаление. Однако, по сравнению с группой М, группа Т не показала явного воспаления, кишечной метаплазии или атрофии. Это говорит о том, что отвар D. caudatum способен эффективно улучшить состояние гастрита.

Результаты анализа на гормоны желудочно-кишечного тракта в сыворотке крови представлены н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

D. caudatum, широко используемая народной медициной народности цян12, показала значительную эффективность в лечении желудочно-кишечных заболеваний. С развитием современных фармакологических исследований дисбаланс флоры, возникающий в результате дисбаланса микроэкологии желудочно-кишечного тракта, определен как ключевой фактор острых и хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта22,23. Определенные микроорганизмы в кишечном т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована в рамках ключевых научно-исследовательских проектов Департамента науки и технологий провинции Сычуань (2020YFS0539).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анализ альфа-разнообразияMothur 1.30.2
AxyPrep набор для экстракции геля дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) Axygen Biosciences AP-GX-50
Beta анализ разнообразияQiime 1.9.1
Криогенный холодильникForma-86C ULT морозильник
Desmodium caudatumБольница традиционной китайской медицины Бэйчуань Цянский автономный уезд
E.Z.N.A. Набор почв OmegaBio-tekD5625-01
Illumina MiSeq ПлатформаIllumina Miseq PE300/NovaSeq PE250
Multiskan Spectrum spectraMaxi3
OTU clusteringUparse 7.0.1090
OTU statisticsUsearch 7.0
PCR instrumentTransGen AP221-02
PCR instrumentABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST двухцепочечный Система ДНК (dsDNA)Promega Corp.
Классификация последовательностей аннотацияRDP Классификатор 2.11
Салицилат натрияSichuan Xilong Chemical Co., Ltd54-21-7
SPF крысыChengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd
SPSS 18.0IBM

Ссылки

  1. Marginean, C. M., et al. The importance of accurate early diagnosis and eradication in Helicobacter pylori infection: pictorial summary review in children and adults. Antibiotics (Basel). 12 (1), 60(2022).
  2. Sipponen, P., Maaroos, H. I. Chronic gastritis. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 50 (6), 657-667 (2015).
  3. Wang, D. J. Methodological quality and reporting quality evaluation of chinese medicine diagnosis and treatment guidelines for chronic gastritis in China. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (7), 2776-2783 (2022).
  4. Burkitt, M. D., Varro, A., Pritchard, D. M. Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors. World Journal of Gastroenterology. 15 (1), 1-16 (2009).
  5. Hayakawa, Y., Chang, W., Jin, G., Wang, T. C. Gastrin and upper GI cancers. Current Opinion in Pharmacology. 31, 31-37 (2016).
  6. Zhang, C. Z., He, M. X., Jin, L. W., Liu, W. D. Effect of aluminum phosphate gel combined with atropine on patients with acute gastritis and its effect on serum gastrin and malondialdehyde levels. International Journal of Digestive Diseases. 40 (2), 137-140 (2020).
  7. Wang, Y. K., et al. Levels of malondialdehyde in the gastric juice: its association with Helicobacter pylori infection and stomach diseases. Helicobacter. 23 (2), e12460(2018).
  8. Turkkan, E., et al. Does Helicobacter pylori-induced inflammation of gastric mucosa determine the severity of symptoms in functional dyspepsia. Journal of Gastroenterology. 44 (1), 66-70 (2009).
  9. Liu, Y., Cai, C., Qin, X. Regulation of gut microbiota of Astragali Radix in treating for chronic atrophic gastritis rats based on metabolomics coupled with 16S rRNA gene sequencing. Chemico-Biological Interactions. 365, 110063(2022).
  10. Gai, X., et al. Heptadecanoic acid and pentadecanoic acid crosstalk with fecal-derived gut microbiota are potential non-invasive biomarkers for chronic atrophic gastritis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 1064737(2023).
  11. Sgambato, D., et al. Gut microbiota and gastric disease. Minerva Gastroenterologica e Dietologica. 63 (4), 345-354 (2017).
  12. Li, J., et al. Pharmacogenetic study of Desmodium caudatum. Anais Da Academia Brasileira De Ciencias. 91 (2), e20180637(2019).
  13. Xu, Q. N., et al. Phenolic glycosides and flavonoids with antioxidant and anticancer activities from Desmodium caudatum. Natural Product Research. 35 (22), 4534-4541 (2021).
  14. Li, W., et al. Anti-inflammatory and antioxidant activities of phenolic compounds from Desmodium caudatum leaves and stems. Archives of Pharmacal Research. 37 (6), 721-727 (2014).
  15. Shao, X. H., Wang, J. G. Establishment of chronic atrophic gastritis in a rat model. Journal of Zhangjiakou Medical Collage. 19 (2), 11-13 (2002).
  16. Yu, C., et al. Dysbiosis of gut microbiota is associated with gastric carcinogenesis in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 126, 110036(2020).
  17. Chen, R., et al. Fecal metabolomics combined with 16S rRNA gene sequencing to analyze the changes of gut microbiota in rats with kidney-yang deficiency syndrome and the intervention effect of You-gui pill. Journal of Ethnopharmacology. 224, 112139(2019).
  18. Li, Q., et al. Magnetic anchoring and guidance-assisted endoscopic irreversible electroporation for gastric mucosal ablation: a preclinical study in canine model. Surgical Endoscopy. 35 (10), 5665-5674 (2021).
  19. Xu, H., et al. Therapeutic assessment of fractions of Gastrodiae Rhizoma on chronic atrophic gastritis by 1H NMR-based metabolomics. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112403(2020).
  20. Zhang, B. N., et al. Effects of Atractylodes lancea extracts on intestinal flora and serum metabolites in mice with intestinal dysbacteriosis. Proteome Science. 21 (1), 5(2023).
  21. Tian, H., et al. The therapeutic effects of Magnolia officinalis extraction on an antibiotics-induced intestinal dysbacteriosis in mice. Current Microbiology. 77 (9), 2413-2421 (2020).
  22. Wang, J., et al. Tumor and microecology committee of China anti-cancer association. Chinese expert consensus on intestinal microecology and management of digestive tract complications related to tumor treatment (version 2022). Journal of Cancer Research and Therapeutics. 18 (7), 1835-1844 (2022).
  23. Xu, W., Xu, L., Xu, C. Relationship between Helicobacter pylori infection and gastrointestinal microecology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 938608(2022).
  24. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 5029(2019).
  25. Callahan, B. J., et al. High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution. Nucleic Acids Research. 47 (18), e103(2019).
  26. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
  27. Huang, D., et al. Characteristics of intestinal flora in patients with gastric cancer based on high throughput sequencing technology. Chinese Journal of Clinical Research. 35 (3), 303-306 (2022).
  28. Shi, Y., Luo, J., Narbad, A., Chen, Q. Advances in lactobacillus restoration for β-lactam antibiotic-induced dysbiosis: a system review in intestinal microbiota and immune homeostasis. Microorganisms. 11 (1), 179(2023).
  29. Grigor'eva, I. N. Gallstone disease, obesity and the Firmicutes/Bacteroidetes ratio as a possible biomarker of gut dysbiosis. Journal of Personalized Medicine. 11 (1), 13(2020).
  30. Thorne, G. M. Diagnosis of infectious diarrheal diseases. Infectious Disease Clinics of North America. 2 (3), 747-748 (1988).
  31. Banks, M., et al. British society of gastroenterology guidelines on the diagnosis and management of patients at risk of gastric adenocarcinoma. Gut. 68 (9), 1545-1575 (2019).
  32. Roy-Lachapelle, A., et al. Evaluation of ELISA-based method for total anabaenopeptins determination and comparative analysis with on-line SPE-UHPLC-HRMS in freshwater cyanobacterial blooms. Talanta. 223, 121802(2021).
  33. Shahi, S. K., et al. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments. (152), e59980(2019).
  34. Huang, R., et al. Blocking-free ELISA using a gold nanoparticle layer coated commercial microwell plate. Sensors (Basel). 18 (10), 3537(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

хронический гастритуровни гастринасодержание малонового диальдегидаметод ИФАсеквенирование 16S рРНКмикробиота кишечникамодель на крысах
Влияние Desmodium caudatum на гормоны желудочно-кишечного тракта и кишечную флору у крыс с гастритом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.