Method Article

Оценка потребления кислорода митохондриями с помощью флуоресцентного анализа на основе считывателя планшетов

DOI:

10.3791/65760

⸱

April 12th, 2024

 ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Biology Department, Elon University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка потребления кислорода дает интегральную информацию о функции митохондрий. Используя фосфоресцирующий зонд с флуоресцентным считывателем пластин, можно легко получить точные и воспроизводимые данные без специализированного оборудования. Этот анализ позволяет любой лаборатории измерить потребление кислорода изолированными митохондриями и рассчитать коэффициенты контроля дыхания.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии выполняют множество важных функций, включая клеточное дыхание, выработку АТФ, контроль апоптоза и выполнение функций центрального узла метаболических путей. Таким образом, экспериментальная оценка функциональности митохондрий может дать представление о вариациях среди различных популяций или состояний заболевания. Кроме того, важно оценить, достаточно ли здоровы изолированные митохондрии, чтобы продолжать эксперименты. Одной из характеристик, часто используемых для сравнения функции митохондрий в разных образцах, является скорость потребления кислорода. Потребление кислорода и последующий расчет соотношения контроля дыхания в интактных клетках или митохондриях, выделенных из ткани, могут служить всем трем целям. Используя митохондрии, выделенные из печени щеточных ящериц в сочетании с фосфоресцирующим зондом, чувствительным к колебаниям концентрации кислорода в растворе, мы измерили потребление кислорода с помощью считывателя флуоресцентных пластин. Этот метод не только быстр и эффективен, но и может быть проведен с небольшим количеством митохондрий и без необходимости использования специализированного оборудования. Описанный здесь пошаговый протокол повышает доступность оценки митохондриального функционирования для исследователей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии – это органеллы, размером примерно с бактерии, обнаруженные в эукариотических клетках. Они являются уникальными органеллами, потому что содержат ДНК и имеют две мембраны, внешнюю и внутреннюю. Внешняя и внутренняя мембраны митохондрий разделены межмембранным пространством, а внутренняя мембрана сворачивается в структуры, называемые кристаллами, вокруг самого внутреннего отсека, называемого матрицей. Эти кристаллы увеличивают площадь поверхности внутренней мембраны, так что несколько процессов, использующих кристаллы, могут происходить одновременно. В то время как митохондрии участвуют во многих клеточных функциях, таких как контроль апоптоза и обеспечение нескольких метаболических путей, их жизненно важная роль в производстве АТФ имеет важное значение для выживания клеток. На самом деле, 90% клеточной энергии поступает из митохондрий1. Производство АТФ включает в себя генерацию электрохимической разницы между внешней и внутренней мембранами, называемой потенциалом митохондриальной мембраны (Δψ), которая возникает при закачивании ионов H+ из матрицы в межмембранное пространство. Производство АТФ в конечном итоге используется во время окисления восстановительных эквивалентов посредством движения электронов по митохондриальной дыхательной цепи (ETC). Конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (O2). По мере потребления кислорода дифференциал концентраций H+ увеличивается до максимума, после чего ионы H+ перемещаются вниз по градиенту концентрации из межмембранного пространства в матрицу, проходя через комплекс АТФ-синтазы. Движение ионов H+ вызывает конформационные изменения в АТФ-синтазе, и АДФ вступает в контакт с неорганическим фосфатом, чтобы вступить в реакцию и образовать АТФ. Наконец, АТФ перемещается из митохондриального матрикса в цитозоль и может либо храниться, либо использоваться для облегчения реакций благодаря большому количеству свободной энергии, выделяемой во время гидролиза ее фосфатов. Весь этот процесс называется окислительным фосфорилированием, и поскольку кислород потребляется, митохондрии, как говорят, дышат2.

Накопление и сила Δψ, количество пониженногоO2 (называемое потреблением кислорода), а также образование АТФ могут быть использованы в качестве показателей здоровья клеток. Митохондриальные функциональные исследования, такие как измерение Δψ, общего содержания и продукции АТФ, а также потребления кислорода, могут быть количественно оценены либо традиционными биохимическими методами, либо флуоресценцией и люминесценцией в анализах на основе планшетов. Например, потенциал митохондриальной мембраны можно сравнить среди различных образцов с помощью флуоресцентных красителей, таких как этиловый эфир тетраметилродамина, который специфически связывается с митохондриями. Выработку АТФ можно контролировать, добавляя в реакцию люминесцентный белок, изменения которого коррелируют с концентрацией АТФ. Количественная оценка скорости потребления кислорода, или абсолютной скорости дыхания, во время OXPHOS может помочь выяснить причины различий в функции митохондрий и энергетическом обмене. Оценка потребления кислорода может быть использована для расчета коэффициентов контроля дыхания (RCR). Значения RCR описывают способность митохондрий вырабатывать АТФ в ответ на приток АДФ, который является основной функцией митохондрий. Значения RCR указывают на общее состояние изолированных митохондрий и позволяют сравнивать ответы на различные экспериментальные методы лечения. Различия в значениях RCR могут отражать митохондриальную дисфункцию или указывать на биологическую разницу между различными митохондриями, выделенными из двух или более источников. Другим важным показателем функции изолированных митохондрий является эффективность митохондрий, определяемая как количество синтезированных молей АТФ на моль O2, или отношение P/O3.

Учитывая объем информации, которая может быть собрана при измерении митохондриальных параметров, и различные случаи, в которых эта информация может быть использована, возможность эффективного сбора функциональных данных может быть полезна во многих различных областях исследований. Измерения потребления кислорода в митохондриях проводились в течение десятилетий с помощью очень специфических приборов — с использованием электрода Кларка, который может быть ограничен размером выборки, необходимой для проведения измерений, а в последнее время — с помощью сложных инструментов, которые могут измерять митохондриальное дыхание и множество других параметров, но могут быть непомерно дорогими. Этот протокол представляет собой адаптированный альтернативный подход с использованием кислород-чувствительного фосфоресцирующего зонда (MitoXpress)4,5. Сигнал зонда обнаруживается с помощью планшетного считывателя в режиме флуоресценции с временным разрешением для непрерывных измерений во времени. Фосфоресценция имеет большую разницу в энергии между поглощенным и испускаемым фотоном по сравнению с флуоресценцией и, следовательно, лучше подходит для непрерывного мониторинга изменений сигнала. Это позволяет выполнять эти измерения практически любой лаборатории, а не только той, которая специализируется на метаболизме митохондрий или может позволить себе узкоспециализированное оборудование. Модельная система, которую мы используем, представляет собой изолированные митохондрии от трех древесных ящериц, двух родительских видов и одного интрогрессированного (содержащего ядерную ДНК от одного родительского вида и митохондрии от другого — гибридов). Эти ящерицы были выбраны, потому что мы предположили, что существуют метаболические и энергетические последствия для гибридов с различными источниками ядерной и митохондриальной ДНК. Мы использовали коммерчески доступный набор для анализа с многорежимным считывателем планшетов, который может расширить доступ к этому типу анализа для большего числа исследователей и областей исследований.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ящерицы были усыплены путем удушения CO2 с последующим немедленным обезглавливанием в соответствии с политикой, изложенной Управлением по благополучию животных в лабораториях и руководящими принципами Комитета Илона по уходу за животными и их использованию.

1. Выделение митохондрий6

ПРИМЕЧАНИЕ: Храните все растворы в холоде (Таблица 1) и образцы на льду на протяжении всех этих этапов.

  1. Удалите печень, взвесьте ее, а затем промойте ~3 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (1x, -/-).
  2. Измельчите печень в 1 мл L-MIB с помощью свежего бритвенного лезвия.
  3. Доведите общий объем ткани плюс L-MIB до 2 мл и механически разрушайте клетки печени в течение четырех проходов с помощью гомогенизатора Dounce.
  4. Открутите гомогенат при 300 × г (37 °C, 10 минут).
  5. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и положите ее на лед.
  6. Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл L-MIB, повторно гомогенизируйте и снова отжмите при 300 × г (37 °C, 10 минут).
  7. Соедините надосадочную жидкость из обоих отжимов и центрифуги при 10 000 × г (37 °C, 10 мин).
  8. Ресуспендируйте гранулу в ~0,350 мл L-MIB.
  9. Определите количество общего белка (мг митохондрий/мл L-MIB) для использования в качестве приближенного значения содержания митохондрий 4,5,6.

2. Потребление кислорода

  1. Подогрейте все используемые растворы (Таблица 1) на следующих этапах до 30 °C на водяной бане.
  2. Разбавляют митохондрии в ЛЭБ до 6 мг/мл на основании результатов анализа концентрации белка на шаге 1.9.
  3. Установите анализ в стерильную 96-луночную прозрачную нижнюю пластину с черными стенками (Таблица 2).
    1. Добавьте 50 мкл образца (буфера L-EB или образца митохондрий) в соответствующие лунки.
    2. Добавьте 50 мкл лечебного вещества (L-EB, глутамат/малат или глутамат/малат с АДФ).
    3. Разбавьте зонд в соотношении 1:10 в L-EB, а затем добавьте 100 мкл флуоресцентного зонда в каждую лунку.
    4. Осторожно добавьте 50 μл тяжелого минерального масла в каждую скважину, чтобы исключить кислород из окружающей среды.
  4. Считывайте флуоресцентные измерения с нижней части пластины при волнении/излучении 380/650 нм каждые 1,5 минуты в течение 45 минут. Используйте кинетический режим с временной задержкой 30 000 μс и окном измерения 100 μс.

3. Анализ данных

  1. Экспортируйте файл необработанных данных с компьютера для чтения номерных знаков в виде файла .xls.
  2. Откройте файл, затем скопируйте и вставьте необработанные данные в новую вкладку и соответствующим образом пометьте строки и столбцы.
  3. Нанесите график буфера L-EB только на контрольный образец и L-EB + G/M как относительные флуоресцентные единицы (RFU) в зависимости от времени.
    Примечание: Эти линии должны быть относительно плоскими, так как митохондрий нет, и, следовательно, не должно быть обнаружено никаких изменений в концентрации кислорода.
  4. Построение графика значений выборки L-EB + G/M в зависимости от времени RFU.
  5. Определите, где показания становятся более стабильными и выравниваются для элементов управления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Именно здесь следует начать анализ данных для экспериментальных образцов (отмечено стрелками на рисунке 1A). Реакции могут занять 10-15 минут, чтобы выровняться и достичь максимума.
  6. Создайте новый график, содержащий данные только после момента времени, установленного на шаге 3.5 (так называемые «обрезанные» данные), и добавьте наиболее подходящую линию, чтобы визуализировать исходные данные, подлежащие анализу.
  7. Вычислите среднее значение RFU для данных усеченного буфера управления (выделено желтым цветом). Это значение используется в качестве минимального значения RFU в качестве исходного уровня при расчете кислорода ниже.
  8. Расчет расхода кислорода (μM O2/мин)
    1. Скопируйте и вставьте линейную область исходных данных из шага 3.6 (т.е. обрезанные данные) для определения концентрации кислорода в митохондриальных образцах при лечении G/M + ADP в каждой временной точке 7,8,9,10.
    2. Используйте уравнение (1)5 для определения концентрации кислорода в каждой временной точке. [О2]a – концентрация кислорода в насыщенном воздухом буфере (235 мМ при 30 °C). I(t), Ia и Io – флуоресцентный сигнал образца + зонда в момент времени t (например, образец + G/M + ADP), средний сигнал зонда в насыщенном воздухом буфере, рассчитанный на шаге 3.7, и максимальный сигнал в дезоксигенированном буфере (установленный на максимально достижимом сигнале), соответственно.
      figure-protocol-1(1)
    3. Постройте график зависимости значений [O2]t , рассчитанных на шаге 3.8.2, от времени и добавьте линейную линию тренда вместе с уравнением наиболее подходящей линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наклон каждой линии в качестве нормы потребления кислорода. Дубликаты или тройки для любой выборки могут быть агрегированы и использованы для сравнения нормы потребления.
  9. Рассчитайте RCR путем деления митохондриального дыхания с АДФ и без него, которые представляют состояния 3 и 2 соответственно.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скорость потребления кислорода и митохондриальная RCR были определены по митохондриям трех разных ящериц с использованием набора для анализа с фосфоресцирующим зондом, чувствительным к кислороду, и стандартным считывателем флуоресцентных пластин. Предыдущие исследования установили, что зонд в этом наборе напрямую коррелирует с потреблением кислорода, при котором фосфоресценция гасится молекулярным кислородом, а флуоресцентный сигнал увеличивается по мере снижения уровня кислорода из-за митохондриального дыхания. Значения РФС записываются с течением времени как для контрольных, так и для экспериментальных образцов, а затем анализируются. Показания РФУ для контрольных лунок (только буфер, буфер, обработанный глутаматом/малатом, и буфер, обработанный глутаматом/малатом + АДФ) были построены в зависимости от времени, чтобы установить, что любые изменения флуоресценции в лунках экспериментальных образцов обусловлены присутствием митохондрий. Кроме того, контроль глутамат/малат + АДФ позволяет получать исходное количество кислорода во время сбора данных. Экспериментальные образцы, содержащие изолированные митохондрии, также были нанесены на тот же график, что и контрольная группа.

На рисунке 1A показано, что РФП увеличиваются с течением времени из образца изолированных митохондрий, в отличие от относительно плоских значений РФИ в контрольной группе. Поскольку для равновесия реакций требуется время, первые 10 или около того показаний, пока показания контрольного образца не станут такими шумными и не выровняются, удаляются из набора данных (Дополнительная таблица S1 и Дополнительный рисунок S1). Затем оставшиеся значения из образца митохондрий, обработанного глутаматом/малатом + АДФ, преобразуются в концентрацию кислорода в каждой временной точке с помощью уравнения (1) (см. протокол шаг 3.2), а затем строятся в зависимости от времени. На рисунке 1B показан результат экспериментальной выборки, показанный на рисунке 1A (кресты), где значение R2 очень близко к 1 и можно рассчитать наклон линии. Наклон линии отрицательный, потому что по мере потребления кислорода общая концентрация кислорода в этом образце уменьшается. Тот же процесс повторяют для тех же образцов митохондрий, обработанных глутаматом/малатом без АДФ, чтобы получить показатели потребления кислорода (Дополнительная таблица S2 и Дополнительный рисунок S2). Затем митохондриальное дыхание с АДФ и без него, которые представляют состояния 3 и 2 соответственно, может быть использовано для расчета RCR для каждого типа образца (дополнительный рисунок S2). При сравнении друг с другом и среднее значение RCR среди трех различных типов древесных ящериц показывает, что RCR гибрида с интрогрессированными митохондриями значительно ниже, чем у любого из родительских типов (рис. 1C). Гибридные митохондрии ящериц имели скорость потребления кислорода промежуточную по отношению к двум родительским типам (рис. 2).

figure-results-1
Рисунок 1: Пример результатов анализа потребления кислорода. (A) Исходные данные контрольных реакций и реакций, содержащих только буфер, включая изолированные митохондрии, которые были обработаны глутаматом и малатом (G/M), с добавлением или без добавления АДФ. Флуоресценцию контролировали с течением времени. По мере потребления кислорода флуоресценция увеличивается. Реакции, содержащие только буфер (G/M, обозначены кружками, и G/M + ADP, обозначены треугольниками) и митохондрии с G/M обработкой (обозначены квадратами) не показали изменений. Митохондрии, обработанные G/M + ADP (обозначаются плюсами), потребляли кислород. (B) Изменения концентрации кислорода с течением времени, рассчитанные на основе исходных данных для митохондрий, обработанных G/M + ADP, представленных в A. (C) Значения RCR для митохондрий от трех различных типов ящериц, измеренные при комнатной температуре. Эта фигура воспроизведена из Haenel и Del Gaizo Moore12. Статистический анализ проводили с использованием ANOVA в R. Сокращения: G = глутамат; М = малат; RCR = коэффициент контроля дыхания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Скорость потребления кислорода митохондриями тремя типами ящериц. Ящичковые диаграммы показывают медианные нормы потребления кислорода в виде столбца, а средние — в виде точки. Родительские типы, Urosaurus graciosus и Urosaurus ornatus, значительно отличались друг от друга. Интрогрессированная форма (гибридная) была промежуточной по отношению к родительским типам и существенно не отличалась ни от одного из них. Эта фигура воспроизведена из Haenel и Del Gaizo Moore12. Сокращения: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Состав растворов, использованных в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Карта планшетов для анализа потребления кислорода. Для каждого образца выделите не менее 6 лунок (3 контрольные лунки: только L-EB, L-EB с G/M-обработкой, L-EB с G/M + ADP; 3 экспериментальные лунки/образец: митохондрии с L-EB обработкой, L-EB + G/M и L-EB G/M + АДФ). По возможности запускайте каждый экспериментальный образец в двух или трех экземплярах. Сокращения: G = глутамат; М = малат; L-EB = экспериментальный буфер, специфичный для ящериц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок S1: Графики данных. (A) График всех исходных данных для сравнения образцов и контрольных образцов. (B) График необработанных данных из выделенных столбцов в Дополнительной таблице S1, показывающий, что только в лунках, содержащих образцы митохондрий, наблюдалось заметное увеличение РФП. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Потребление кислорода и соотношения контроля дыхания. (A) График данных о потреблении кислорода из Дополнительной таблицы S1 для определения значений Состояния 2 и Состояния 3 путем нахождения уравнений наиболее подходящих линий. (В) Расчет коэффициента RCR с использованием наклонов линий в (A), которые представляют состояние 2 и состояние 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Репрезентативный пример исходных данных. Выделенные столбцы — это данные, которые используются для цифр и расчетов (т. е. обрезанные данные). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Репрезентативный пример обрезанных данных и последующих расчетов потребления кислорода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерение функции митохондрий полезно при сравнении различных образцов, таких как болезненные и неболезненные состояния, различные типы тканей одного и того же животного или между разными типами образцов. Мы использовали более позднее сравнение, чтобы проверить нашу гипотезу о том, что существуют метаболические последствия для гибридных древесных ящериц, у которых интрогрессированы митохондрии. Существует множество способов экспериментального определения функции митохондрий, включая количественную оценку Δψ, общего содержания АТФ, продукции АТФ, а также контроль дыхания и скорость потребления кислорода. Измерения потребления кислорода изолированными митохондриями могут быть проведены с помощью специализированного оборудования, такого как электрод Кларка или более сложные Seahorse XF. Однако эти методы могут быть либо ограниченными по размеру выборки, необходимым для проведения измерений, либо непомерно дорогими. Многорежимные считыватели пластин, которые могут считывать флуоресценцию, стали стандартным оборудованием в лабораториях клеточной биологии и биохимии. Таким образом, альтернативным подходом к количественному анализу потребления кислорода в митохондриях является использование коммерчески доступного набора со считывателем флуоресцентных пластин. В этом пошаговом протоколе описывается, как измерять потребление кислорода, а также проводить расчеты. и экономически в изолированных митохондриях. Точное измерение способности митохондрий вырабатывать АТФ при поступлении АДФ, называемого дыханием состояния 3, позволяет напрямую сравнивать OXPHOS между образцами, и различия могут означать функциональные различия. Кроме того, дыхание в состоянии 3 также указывает на качество выделенных митохондрий, что может определить, сработала ли процедура выделения и/или достаточно ли хорош образец для использования в других анализах. Значения RCR, которые рассчитываются с использованием Состояния 2 (только глутамат и малат, для построения Δψ) и Состояния 3 (глутамат и малат плюс АДФ, чтобы Δψ можно было использовать для производства АТФ), дают еще одну информацию для сравнения и о здоровье изолированных митохондрий. Представленные данные демонстрируют, что метод, предложенный в данной статье, может помочь расшифровать различия между различными типами образцов и измерить нормы потребления кислорода и значения RCR без необходимости использования узкоспециализированного оборудования, тем самым делая эти типы измерений более доступными.

В этом протоколе мы только что изолировали митохондрии от ящериц, а потребление кислорода было определено с помощью анализа MitoXpress Xtra Hs в соответствии с протоколом производителя и модифицировано в соответствии с Hynes et al.4 и Will et al.5 Общая масса тела ящериц варьировалась от 3,3 г до 5,1 г со средним содержанием ткани печени/ящерицы 0,170 г. что дало ~0,350 мл концентрированных сырых митохондрий. Выделенные митохондрии использовали в анализе потребления кислорода в концентрации белка 6 мг/мл. Если концентрация митохондриального белка, определенная на этапе протокола 1.7, низкая, то образец можно повторно вращать при 10 000 × г , а гранулу ресуспендировать в меньшем объеме L-MIB. Следует также отметить, что мы успешно использовали всего 4 мг/мл для небольших образцов печени или когда вся печень была недоступна.

Для обеспечения газового и температурного равновесия образцов в начале анализа все растворы, используемые в разделе 2 протокола, должны быть предварительно подогреты до 30 °C на водяной бане. В разделе 3 протокола скорости изменения растворенного кислорода (мМ/мин) экстраполируются из начальных наклонов профилей убывания концентрации кислорода для каждого образца (шаг протокола 3.3; Дополнительная таблица S1 и дополнительный рисунок S1). Частота лечения Г/М представляет митохондриальное дыхание Состояния 2, тогда как выборка с частотой лечения Г/М + АДФ представляет митохондриальное дыхание Состояния 3. Таким образом, RCR рассчитываются для каждой выборки путем деления значений состояния 3 на значения состояния 2 для каждой выборки (Дополнительная таблица S2).

Потребление кислорода можно сравнивать либо между отдельными образцами, как показано здесь, так и между различными методами обработки в одном образце. В последнем случае могут потребоваться дополнительные меры контроля, такие как контроль только на транспортном средстве с митохондриями и без них, чтобы исключить возможность того, что сама химическая обработка не взаимодействует с фосфоресцирующим зондом. Кроме того, собранные данные о потреблении кислорода и RCR можно использовать в сочетании с данными, собранными из тех же образцов, с другими анализами. После того, как митохондрии изолированы, их можно использовать в нескольких анализах для получения более полной картины их функции. Измерение Δψ, общего содержания АТФ и скорости оборота АТФ — вот некоторые из комбинированных анализов. Кроме того, использование ингибиторов ETC, OXPHOS и АТФ-синтазы в анализах дает еще более полное понимание различных типов митохондриальных образцов, укрепляя любые выводы, сделанные на основе полученных данных.

Еще одним параметром, который может быть измерен в изолированных митохондриях, является эффективность митохондрий, которая определяется как отношение P/O молей синтезированных АТФ на моль O23. Соотношения P/O могут быть рассчитаны в рамках расширения этого протокола, если митохондриям состояния 3 исчерпать АДФ, поставляемый в реакции, а затем добавить аликвоту субстрата АДФ с последующим ингибированием АТФ-синтазы путем добавления олигомицина. Эти дополнительные шаги позволяют рассчитать состояние 4, которое возникает, когда митохондрии продолжают потреблять кислород и поддерживать высокий уровень Δψ для производства максимального количества АТФ, дает информацию о негерметичности митохондрий (если ионы H+ возвращаются в матрикс без использования АТФ-синтазы и, следовательно, рассеивают Δψ), что в конечном итоге указывает на дисфункцию митохондрий. Кроме того, измерения состояния 4 могут также показать, функционирует ли транслокатор АДФ/АТФ, который перемещает вновь образованную АТФ из матрицы и в то же время приносит внутрь подложку АДФ, и происходит ли утечка АДФ и АТФ через мембраны. Добавление олигомицина, который ингибирует АТФ-синтазу, является контролем для определения того, являются ли митохондрии негерметичными из-за фактической дисфункции. В то время как измерение состояния 4 для расчета соотношения P/O выходит за рамки информации, которую мы искали для сравнения трех типов митохондриальных образцов, это еще одна часть данных о функции митохондрий, и она может быть выполнена в качестве расширения этого протокола. Наконец, стоит отметить, что митохондрии могут быть выделены из клеток в культуре и различных тканей мыши или крысы (например, печени, сердца, спинного мозга). Может потребоваться корректировка рецептур MIB и EB, а также протоколов изоляции 4,13,14,15,16. Кроме того, в соответствии с инструкциями производителя, этот анализ можно проводить с целыми, неповрежденными клетками. Таким образом, представленный метод не ограничивается ящерицами или митохондриями печени, что позволяет ему быть пригодным для широкого спектра экспериментальных моделей во многих различных научных дисциплинах.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось NSF CHE-1229562 (VDGM) и грантами Комитета по исследованиям и разработкам факультета Университета Элона (VDGM и GH) и Исследовательской программы бакалавриата (AJ).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-луночные черные/оптические донные пластиныThermo Fisher265301Необработанные черные стенки с прозрачным дном.
ADPSigmaA2754Dilut 100 µ M с EB непосредственно перед использованием.
BSAThermo FisherBP1600-100Сделайте бульон 2 мг/мл в воде для анализа белка.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)SigmaD8537Убедитесь, что PBS не содержит ионов Mg2+ или Ca2+.
EGTASigmaE3889
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
L-глутаминовая кислотаSigmaG1251
L-глутаминовая кислота калийная сольSigmaS372226
L-яблочная кислотаSigmaM8304
L-яблочная кислота монокалийная сольSigma49601
MitoXpress набор для потребления кислородаAgilentMX-200-4Kit содержит пробник и минеральное масло HS.
MOPSSigmaM3183
Protien Assay Dye (5x)BioRad500-0006Любой анализ белка может заменить.
R версия 3.3 R Core Development Team 2016
Считыватель микропланшетов Thermomax Многорежимный считыватель пластин EnSpire Многорежимный считыватель пластин и программное обеспечениеPerkinElmerСтандартный флуоресцентный считыватель
пластин Trisma базаSigmaT6066Можно использовать любую версию базы Tris.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drew, B., Leeuwenburgh, C. Method for measuring ATP production in isolated mitochondria: ATP production in brain and liver mitochondria of Fischer-344 rats with age and caloric restriction. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative andComparative Physiology. 285 (5), R1259-R1267 (2003).
  2. Ballard, J. W. O., Pichaud, N. Mitochondrial DNA: more than an evolutionary bystander. Functional Ecology. 28 (1), 218-231 (2014).
  3. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 437 (3), 575-575 (2011).
  4. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  5. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences. 92 (1), 186-200 (2006).
  6. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), 52076(2015).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle, and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  8. Dunn, D. A., Pinkert, C. A. Nuclear expression of a mitochondrial DNA gene: mitochondrial targeting of allotopically expressed mutant ATP6 in transgenic mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-7 (2012).
  9. Irwin, R. W., et al. Medroxyprogesterone acetate antagonizes estrogen up-regulation of brain mitochondrial function. Endocrinology. 152 (2), 556-567 (2011).
  10. Ma, D., et al. Cancer cell mitochondria targeting by pancratistatin analogs is dependent on functional complex II and III. Scientific Reports. 7 (1), 42957(2017).
  11. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
  12. Haenel, G. J., Del Gaizo Moore, V. Functional divergence of mitochondria and coevolution of genomes: cool mitochondria in hot Llzards. Physiological and Biochemical Zoology. 91 (5), 1068-1081 (2018).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1 G93A mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  14. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. Journal of Clinical Investigation. 117 (1), 112-121 (2007).
  15. Chonghaile, T. N., et al. Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy. Science. 334 (6059), 1129-1133 (2011).
  16. Del Gaizo, V., MacKenzie, J. A., Payne, R. M. Targeting proteins to mitochondria using TAT. Molecular Genetics and Metabolism. 80 (1-2), 170-180 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/65760

Tags

Mitochondrial Oxygen ConsumptionFluorescent AssayPlate ReaderMitochondrial FunctionOxygen Consumption RateRespiratory Control RatioIsolated MitochondriaCellular RespirationPhosphorescent ProbeATP Production
Video Coming Soon

Related Articles