Оптимизированный метод обратной политрансфекции на основе эмбриональных стволовых клеток мыши для быстрого исследования соотношения нуклеиновых кислот

Summary

В настоящем протоколе описан метод обратной политрансфекции эмбриональных стволовых клеток мыши при культивировании средами 2i и LIF. Этот метод обеспечивает более высокую жизнеспособность и эффективность, чем традиционные протоколы прямой трансфекции, а также позволяет оптимизировать соотношение плазмид в одном горшке.

Abstract

Благодаря своей относительной простоте и легкости использования, транзиторная трансфекция клеточных линий млекопитающих нуклеиновыми кислотами стала основой биомедицинских исследований. В то время как наиболее широко используемые клеточные линии имеют надежные протоколы трансфекции в адгезивной двумерной культуре, эти протоколы часто плохо переводятся на менее изученные линии или линии с нетипичной, трудно трансфицируемой морфологией. Используя мышиные плюрипотентные стволовые клетки, выращенные в среде 2i/LIF, широко используемой модели культуры для регенеративной медицины, этот метод описывает оптимизированный, быстрый протокол обратной трансфекции, способный достичь более высокой эффективности трансфекции. Используя этот протокол, выполняется трехплазмидная политрансфекция, использующая более высокую, чем обычно, эффективность доставки плазмид для изучения расширенного диапазона стехиометрии плазмид. Этот протокол обратной политрансфекции позволяет использовать экспериментальный метод с одним горшком, что позволяет пользователям оптимизировать соотношение плазмид в одной лунке, а не в нескольких котрансфекциях. Способствуя быстрому изучению влияния стехиометрии ДНК на общую функцию доставляемых генетических цепей, этот протокол сводит к минимуму время и стоимость трансфекции эмбриональных стволовых клеток.

Introduction

Доставка ДНК и РНК в клетки млекопитающих служит основой биомедицинских^{исследований1}. Распространенным методом введения экзогенных нуклеиновых кислот (НК) в клетки млекопитающих является транзиторная трансфекция ^2,3. Этот метод основан на смешивании НК с коммерчески доступными реагентами для трансфекции, способными доставить их в клетки-реципиенты. Как правило, НК доставляется путем прямой трансфекции, при которой клетки, прилипшие к двумерной поверхности, получают трансфекционный комплекс. В то время как прямая трансфекция для наиболее распространенных установленн....

Protocol

1. Приготовление реагентов для культивирования мПСК

1. Приготовьте добавку N2.
   1. В нестерильных условиях приготовьте следующие исходные растворы (шаг 1.1.1.1) в вытяжном шкафу химической безопасности. Добавьте твердый порошок каждого химического вещества в предварительно взвешенную коническую пробирку объемом 50 мл. Взвесьте каждую пробирку после добавления порошка и добавьте соответствующее количество растворителя, чтобы достичь приведенных ниже концентраций. Для одной партии носителя подготовьте указанное минимальное количество.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие реагенты являются опасными и должны обрабатываться в соответствии с местными правилам....

Results

Как прямая, так и обратная трансфекция основаны на взаимодействии между клеточной мембраной и входящими комплексами трансфекционного реагента-ДНК, что позволяет доставлять НК клеткам-реципиентам. В чем эти методы различаются, так это в состоянии клетки при доставке - в то время как ДНК обычно доставляется к монослоям адгезивных клеток при традиционной прямой трансфекции, обратная трансфекция вместо этого полагается на то, что комплекс реагент-ДНК встречается с клетками, находясь в одноклеточной суспензии. Это различие мо.......

Discussion

Основной причиной широкого распространения протоколов трансфекции является их воспроизводимость и доступность; Тем не менее, эти протоколы требуют оптимизации в экспериментальных контекстах. Выше не упоминается стандартное тестирование, необходимое при попытке трансфекции новой клеточной линии в первый раз. Во-первых, выбор реагента для трансфекции является ключевым, поскольку коммерчески доступные реагенты не являются универсальными и будут различаться по эффективности доставки NA в зависимости от типа клеток. Кроме тог.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Апотрансферрин	Дополнение к MilliporeSigma	T1147-500MG
B27	ThermoFisher Scientific
Бета-меркаптоэтанол	ThermoFisher Scientific
BSA фракция V (7,5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Шарики стандартизации проточной цитометрии	Spherotech	URCP-38-2K
Желатин	Добавка MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX	ThermoFisher Scientific
Инсулин	Gibco	12585-0014
Липофектамин 2000	Инвитроген	11668-019	Реагент для трансфекции
Нейробазальная среда	ThermoFisher Scientific
OptiMEM	Инвитроген	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Прогестерон	MilliporeSigma	P8783	Химическая опасность - ознакомьтесь с местными рекомендациями по технике безопасности, убедитесь, что вы носите надлежащие СИЗ, и работайте с твердым порошком только в вытяжном шкафу
для
химических веществ.Рекомбинантный mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Селенит натрия	MilliporeSigma	S5261-25G	Химическая опасность - ознакомьтесь с местными правилами безопасности, убедитесь в надлежащем ношении СИЗ и работайте с твердой порошковой формой только в химическом вытяжном шкафу
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific