Методическая статья

Выделение, культивирование и характеристика стволовых клеток пульпы зуба из молочных и постоянных зубов человека

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65767

⸱

17 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе особое внимание уделяется извлечению, культивированию и сохранению мультипотентных стволовых клеток из пульпы зуба с помощью ферментативного пищеварения. Кроме того, это демонстрирует их способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты, подчеркивая важность точности и последовательности в процессе.

Аннотация

В области регенеративной медицины и терапевтических применений исследования стволовых клеток быстро набирают обороты. Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), которые присутствуют как в молочных, так и в постоянных зубах, стали жизненно важным источником стволовых клеток благодаря их доступности, адаптивности и врожденной способности к дифференцировке. DPSC предлагают легкодоступный и обильный резервуар мезенхимальных стволовых клеток, демонстрируя впечатляющую универсальность и потенциал, особенно для регенеративных целей. Несмотря на их многообещающие перспективы, основное препятствие заключается в эффективной изоляции и характеристике DPSC, учитывая их представленность в виде мельчайшей фракции в клетках пульпы зуба. Не менее важно и правильное сохранение этого бесценного клеточного ресурса. Двумя преобладающими методами выделения DPSC являются ферментативное сбраживание (ЭД) и рост из тканевых эксплантов (ОГ), часто называемые спонтанным ростом. Этот протокол сосредоточен в первую очередь на подходе ферментативного расщепления для выделения DPSC, подробно описывая этапы, охватывающие экстракцию, лабораторную обработку и сохранение клеток. Помимо экстракции и сохранения, протокол углубляется в мастерство дифференцировки DPSC. В частности, в нем описываются процедуры, используемые для стимуляции дифференцировки этих стволовых клеток в адипоциты, остеобласты и хондроциты, демонстрируя их мультипотентные свойства. Последующее использование колориметрических методов окрашивания способствует точной визуализации и подтверждению успешной дифференциации, тем самым подтверждая калибр и функциональность выделенных DPSC. Этот всеобъемлющий протокол функционирует как план, охватывающий весь спектр извлечения, культивирования, сохранения и определения характеристик стволовых клеток пульпы зуба. Это подчеркивает значительный потенциал, заложенный в DPSC, продвигающий вперед исследования стволовых клеток и открывающий перспективы для будущих регенеративных и терапевтических прорывов.

Введение

Исследования стволовых клеток процветают в биомедицинской науке благодаря их многообещающему применению в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), полученные из пульпы молочных и постоянных зубов человека, вызвали значительный интерес в качестве источника стволовых клеток благодаря их доступности и мультипотентной способности 1,2. Эти клетки обладают потенциалом к дифференцировке в различные типы клеток, включая адипоциты, остеобласты и хондроциты, что подтверждаетсямногочисленными исследованиями.

За последние несколько десятилетий исследования и терапевтическое применение стволовых клеток резко возросли. Обширный потенциал стволовых клеток требует диверсификации источников, из которых они получаются. На эффективность, жизнеспособность и стволовость выбранных клеток влияет несколько факторов. Несмотря на существование различных известных резервуаров стволовых клеток, таких как костный мозг и жировые ткани, инвазивные процедуры, заболеваемость и этические проблемы, связанные с этими источниками, часто ограничивают их изучение. Среди различных источников стволовых клеток стоматологические стволовые клетки привлекли внимание благодаря своей легкодоступности, высокой пластичности и разнообразным потенциальным применениям. В частности, стволовые клетки пульпы зуба человека были тщательно исследованы на предмет их терапевтических перспектив6. Зубы, обычно выбрасываемые как медицинские отходы, содержат большое количество мезенхимальных стволовых клеток7. Сохранение этого ценного пула стволовых клеток требует коллективных усилий со стороны пациентов, стоматологов и врачей, чтобы гарантировать, что эти ресурсы не будут потрачены впустую, что сделает каждую стволовую клетку пульпы зуба доступной для будущих регенеративных потребностей.

Стволовые клетки, полученные из пульпы зуба, такие как стволовые клетки пульпы взрослого человека (DPSC) и стволовые клетки отслоившихся молочных зубов человека (SHED), расположены в периваскулярной нише пульпы зуба. Считается, что эти клетки происходят из клеток нервного гребня черепа и демонстрируют ранние маркеры как для мезенхимальных стволовых клеток (МСК), так и для нейроэктодермальных стволовых клеток. DPSC и SHED продемонстрировали мультипотенцию и способность к регенерации различных типов тканей8.

Потенциальными источниками зубных стволовых клеток являются здоровые молочные и постоянные зубы. Стволовые клетки составляют лишь около 1% от общей популяции клеток в пульпе, что подчеркивает важностьэффективных методов выделения и размножения. Следовательно, экстракция и экспансия этих стволовых клеток являются ключевыми этапами выделения DPSC10. Удаленные или отслоившиеся зубы необходимо хранить в богатой питательными веществами транспортной среде, такой как фосфатно-солевой буфер (PBS) или буферизованный солевым раствором Хенкса (HBSS).

Получение пульпы зуба может быть достигнуто с помощью различных методов, в зависимости от типа зуба 7,11. Для молочных зубов с резорбированными корнями удаление может быть выполнено через верхушку корня. Аналогичным образом, стерильные протяжки с зазубринами могут быть использованы для получения пульпы из постоянных зубов с незрелой открытой верхушкой. В случае постоянных зубов с полностью развитыми корнями доступ к пульповой камере предполагает отделение зубной коронки от корня. Это достигается путем разрезания зуба с помощью алмазного диска в месте цементоэмального соединения. Этот разрез обнажает пульповую камеру, что позволяет извлечь пульповую ткань 12,13,14.

Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC) могут быть выделены с помощью ферментативного сбраживания (ЭД) или роста из тканевых эксплантов (ОГ), также известного как спонтанный рост. Метод ЭД использует ферменты, в первую очередь коллагеназу I и диспазу, для расщепления ткани на одиночные клеточные суспензии15,16. Метод OG, более простой и быстрый, заключается в измельчении фрагментов пульпы и непосредственном помещении их в культуральную тарелку, что позволяет клеткам вырасти из тканевых эксплантов17. Исследователи использовали и сравнивали оба метода для оценки скорости пролиферации клеток, сохранения свойств изолированных стволовых клеток, дифференцировкии экспрессии поверхностных маркеров. Создание и стандартизация протоколов для получения DPSC с высокой эффективностью и устойчивостью может проложить путь к эффективному и безопасному лечению19. Этот протокол включает в себя экстракцию DPSC с помощью ферментативного расщепления, лабораторную обработку, консервацию и дифференцировку клеток с колориметрическим окрашиванием для адипогенеза, остеогенеза и хондрогенеза.

Протокол, изложенный в этой статье, представляет собой пошаговую процедуру, начиная с первоначального выделения пульпы зуба из зуба, за которой следует культивирование и поддержание DPSC в лаборатории, и заканчивая их характеристикой с помощью специфических маркеров стволовых клеток (рис. 1). Также описаны методы индукции этих стволовых клеток в различные клеточные линии, подчеркивающие их мультипотентность.

Протокол

Протокол, изложенный в настоящем документе, соответствует руководящим принципам институционального комитета по этике исследований человека (IRB, Исследовательский центр Пушпагири, штат Керала). Использование удаленных зубов проводилось в соответствии с этическими нормами для обеспечения неприкосновенности, достоинства и прав участников. Участники, отобранные для этого исследования, были здоровыми людьми в возрасте до 30 лет, которым потребовалось удаление зуба для ортодонтического лечения. Пациенты с обширным кариесом зубов или тяжелым пародонтитом были исключены из исследования. Молочные зубы были собраны у детей, которым требовалось удаление ретинированных зубов. Также было получено информированное письменное согласие от субъектов, участвующих в этом исследовании.

1. Удаление и транспортировка зубов

  1. Коллекция молочных и постоянных зубов
    1. Объясните участникам цель процедуры и возможное использование удаленных зубов в исследовательских целях.
    2. Проводите удаление зубов под местной анестезией путем введения обезболивающего средства в непосредственной близости от удаляемого зуба. В частности, для этого исследования вводили 1,75 мл лидокаина, смешанного с эпинефрином (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:200 000. Предпочтительновыбирать зубы, у которых нет тяжелого кариеса или периодонтита.
  2. Транспортировка удаленных зубов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать в асептических условиях, чтобы избежать загрязнения. Это включает в себя ношение средств индивидуальной защиты, таких как перчатки и лабораторный халат, и работу в стерильных условиях, таких как биологически опасный капюшон для ламинарного потока.
    1. После удаления зуба прополощите его стерильным фосфатно-солевым раствором (PBS), чтобы удалить кровь и другие загрязнения. С помощью стерильных щипцов и скальпеля осторожно удалите с поверхности зуба все прикрепленные остатки мягких тканей (рисунок 2А).
    2. Погрузите зуб в дезинфицирующий раствор, например, 70% этанол, на 10 с. После дезинфекции промойте зуб стерильным PBS, чтобы смыть остатки дезинфицирующего средства.
    3. Поместите зуб в стерильный контейнер с транспортной средой.
      Транспортная среда состояла из альфа-MEM, коммерческой питательной среды с добавлением антибиотиков: 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина (см. Таблицу материалов). Эта среда снабжала клетки удаленного зуба необходимыми питательными веществами, обеспечивая их выживание до лабораторной обработки. Антибиотики служили для подавления роста бактерий.
    4. Поддерживайте температуру 4 °C во время транспортировки, чтобы замедлить клеточную метаболическую активность и отсрочить гибель клеток. Транспортируйте зуб в лабораторию для следующих этапов, включая обработку и выделение стволовых клеток пульпы зуба.

2. Забор пульповой ткани

  1. Закрепите зуб с помощью зубных щипцов, чтобы он оставался на месте во время процедуры. Используйте алмазный диск для вырезания зуба в стоматологическом наконечнике (см. Таблицу материалов), подключенном к водяной охлаждающей жидкости (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы обнажить пульповую камеру, не вызывая ненужного повреждения пульповой ткани внутри.
  2. Используйте стоматологический экскаватор (см. Таблицу материалов) для удаления ткани пульпы. Этот инструмент позволяет извлекать пульпу без нанесения повреждений, тем самым сохраняя жизнеспособность стволовых клеток пульпы зуба (Рисунок 2C).
  3. Полученную салфетку поместите на стеклянную чашку Петри. Промойте ткань пульпы фосфатно-солевым буфером.

3. Расщепление пульповой ткани и выделение клеток

  1. Измельчение и пищеварение
    1. С помощью стерильного хирургического лезвия тщательно измельчите ткань пульпы на мелкие фрагменты (Рисунок 2D) и поместите ее в мини-измельчитель для тканей с PBS для получения мелкогомогенизированной смеси. Этот процесс увеличивает площадь поверхности ткани, способствуя более эффективному действию ферментов во время пищеварения.
    2. Измельченные однородные фрагменты ткани переложите в пробирку объемом 15 мл и ферментативно расщепляйте с использованием смеси коллагеназы I типа 3 мг/мл и диспазы 4 мг/мл (см. Таблицу материалов). Эти ферменты растворяли в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) для достижения желаемых концентраций.
    3. Инкубируйте ткань пульпы в смеси ферментов (шаг 3.1.2) в течение примерно 2 ч при 37 °C. После инкубации нейтрализуйте ферменты, а клетки соберите центрифугированием (шаг 3.2.1) для дальнейшего культивирования.
  2. Центрифугирование и ресуспендирование
    1. После инкубации переложите переваренную ткань в центрифужную пробирку объемом 15 мл и вращайте при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать клетки. На этом этапе клетки отделяются от оставшихся непереваренных фрагментов тканей и ферментов. Осторожно выбросьте надосадочную среду, следя за тем, чтобы не потревожить клеточную гранулу на дне пробирки.
    2. Ресуспендируйте клеточную гранулу в свежей питательной среде. Эта среда обеспечивает необходимые питательные вещества и среду для выживания и пролиферации изолированных клеток.

4. Культура клеток

  1. Гальванизация и инкубация клеток
    1. Осторожно перенесите ресуспендированные клетки в колбу для культур размером 25 см².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь материал из одной пульпы переносится в одну колбу для клеточных культур размером 25см2 . Объем среды 5-7 мл обеспечивает достаточный охват и доступность питательных веществ для клеток. Убедитесь, что питательной средой для DPSC является модифицированная среда Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), дополненная 10%-20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (см. Таблицу материалов) для обеспечения необходимых факторов роста. Далее дополните среду 1% пенициллином/стрептомицином для предотвращения бактериального заражения. Убедитесь, что клетки равномерно распределены по всей колбе, чтобы способствовать однородному росту.
    2. Инкубируйте колбу при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5%CO2.
  2. Изменение среды и мониторинг конфлюенции
    1. Меняйте питательную среду каждые 2-3 дня, чтобы обеспечить свежие питательные вещества и удалить метаболические отходы. Для этого нужно осторожно отсасывать старую среду с помощью стерильной серологической пипетки и заменить ее свежей средой.
    2. Регулярно контролируйте клеточную культуру под микроскопом, чтобы отслеживать рост клеток и проверять наличие признаков загрязнения.
    3. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока клетки не достигнут 80%-90% конфлюенции, точки, в которой клетки покрывают большую часть поверхности колбы, но не становятся слишком переполненными.
  3. Трипсинизация клеток и пассирование или замораживание
    1. Как только клетки достигнут 80%-90% конфлюенции, удалите питательную среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления остаточной среды и неадгезивных клеток.
    2. Добавьте в колбу раствор 0,25% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить клетки от поверхности колбы. Инкубировать в течение 2-5 минут при температуре 37 °C, пока клетки не оторвутся.
    3. Нейтрализуйте трипсин, добавив равный объем питательной среды, затем осторожно пипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы обеспечить полную отслойку клеток.
    4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре для гранулирования клеток.
    5. Ресуспендируйте клетки в свежей питательной среде и либо передержите их (пассаж) для дальнейшего роста, либо заморозьте для дальнейшего использования. При замораживании используйте замораживающую среду, содержащую криопротектор, такой как ДМСО, чтобы защитить клетки от повреждений во время замораживания.

5. Характеристика DPSC

  1. Анализ проточной цитометрии
    1. Чтобы подтвердить мезенхимальную природу стволовых клеток выделенных клеток, проводят анализ проточной цитометрии22,23. Первоначально трипсинизируйте и соберите клетки, как описано в шаге 4.3.
    2. Определение жизнеспособности клеток с помощью метода исключения трипанового красителя. Проводите анализ с помощью анализатора жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов) во время2-го и8-го пассажей. Проводят фенотипический анализ с помощью проточного цитометра во время3-го и7-го пассажей.
    3. После инкубации промойте клетки в буфере для проточной цитометрии для удаления избытка антител и проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для проточной цитометрии состоит из фосфатно-солевого буфера (1x PBS), 1%-2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,1% азида натрия (NaN3). FBS или BSA блокируют неспецифическое связывание антител, в то время как азид натрия действует как консервант. Высокий процент клеток должен экспрессировать маркеры мезенхимальных стволовых клеток и не иметь гемопоэтических маркеров, что подтверждает их идентичность как DPSCs24.
    4. Отделите DPSC и окрасьте их иммунофлуоресцентными антителами для анализа проточной цитометрии.
      Примечание: Выбор маркеров для анализа проточной цитометрии мезенхимальных стволовых клеток (МСК) основан на консенсусе, достигнутом Международным обществом клеточной терапии (ISCT), который гласит, что МСК должны экспрессировать CD105, CD73 и CD90 и не иметь экспрессии CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79a или CD19 и HLA класса II25. Эти маркеры обычно используются в исследованиях стволовых клеток пульпы зуба26. Концентрации антител для окрашивания могут варьироваться в зависимости от конкретного используемого антитела, и рекомендуется следовать инструкциям производителя (см. Таблицу материалов) для разведения антител и условий инкубации25.
    5. Установить критерии классификации 27,28 для экспрессии маркеров CD, как указано выше: менее 10%, без экспрессии; от 11% до 40%, низкая экспрессия; диапазон от 41% до 70%, умеренная экспрессия; выше 71%, высокая экспрессия.
    6. Дополнительно подтвердить отсутствие гемопоэтических маркеров путем инкубации отдельной аликвоты клеток с антителами к CD34 и CD45.

6. Многолинейная дифференциация

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают протоколы остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировки стоматологических стволовых клеток. Начните с посева культур с плотностью 1 х 105 клеток на лунку в тканевый культуральный планшет, покрытый фибронектином, с полной средой (КМ). Контролируйте рост клеток до тех пор, пока не будет достигнуто 80%-90% слияние, прежде чем инициировать желаемый протокол дифференцировки. Чтобы оценить мультилинейный дифференцировочный потенциал DPSC, инициируйте процесс дифференцировки в сторону остеобластов, адипоцитов и хондроцитов путем посева клеток в 24-луночные планшеты и культивирования их в соответствующих дифференцировочных средах.

  1. Остеогенная дифференцировка
    1. Начните с культивирования DPSC в обычной питательной среде в стандартных условиях до тех пор, пока они не достигнут 70%-80% конфлюенции.
    2. Удалите питательную среду из клеток, затем промойте клетки один раз 1x PBS. Добавьте в клетки остеогенную среду для дифференцировки (ОДМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ОДМ состоит из альфа-минимальной незаменимой среды (α-MEM) с добавлением 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина, 100 μг/мл стрептомицина, 0,25 μг/мл амфотерицина B, 50 μг/мл аскорбиновой кислоты, 10 мМ бета-глицерофосфата и 100 нМ дексаметазона (см. Таблицу материалов).
    3. Инкубируйте клетки в остеогенной среде при 37 °C с 5%CO2. Меняйте остеогенную среду каждые 2-3 дня.
      Примечание: Через 14-21 день DPSC должны дифференцироваться в остеобластоподобные клетки. Это может быть подтверждено проверкой на увеличение экспрессии остеобласт-специфичных маркеров, таких как щелочная фосфатаза, или использованием методов окрашивания для обнаружения минерализованного матрикса, таких как окрашивание ализарином Red S.
    4. Зафиксируйте клетки, инкубировав их с 70% ледяным этанолом в течение 1 ч при -20 °C.
    5. Окрашивать неподвижные клетки раствором окрашивания Ализарин красный S (pH 4,2) 40 нМ при комнатной температуре в темноте в течение 10-15 минут. Визуализируйте окрашивание под микроскопом, чтобы подтвердить остеогенную дифференцировку (Рисунок 3). Подтвердите дифференцировку путем окрашивания клеток препаратом Ализарин Ред С, который идентифицирует залежи кальция, свидетельствующие о минерализации29,30.
  2. Адипогенная дифференцировка
    1. Как подробно описано в предыдущем разделе, выращивание DPSC в стандартных условиях во влажной атмосфере с 5%CO2 при 37 °C. Проходите клетки, когда они достигают примерно 70%-80% слияния.
    2. Аспирируйте среду и промойте клетки один раз 1x PBS. Замените вымытую среду средой для адипогенной дифференцировки. Эта среда обычно состоит из DMEM, 10% FBS, 10 мкг/мл инсулина, 1 мкМ дексаметазона, 200 мкМ индометацина и 0,5 мМ IBMX (см. Таблицу материалов).
    3. Меняйте среду для дифференцировки каждые 3-4 дня. Примерно через 3 недели промойте дипоген-дифференцированные DPSC PBS и зафиксируйте их 4% параформальдегидом (PFA) на 20 минут при комнатной температуре.
    4. Окрасьте неподвижные клетки маслом Red O (см. Таблицу материалов), чтобы визуализировать накопление липидных капель (Рисунок 4). Для дальнейшего подтверждения адипогенной дифференцировки проведите анализ экспрессии генов адипогенных маркеров, таких как рецептор гамма, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ) и адипонектин31,32.
  3. Хондрогенная дифференциация
    1. Для хондрогенной дифференциации используются культуры DPSCs, содержащиеся во влажной атмосфере с 5%CO2 при 37 °C. Проходите клетки, когда они достигают примерно 70%-80% слияния.
    2. Аспирируйте среду и промойте клетки один раз 1x PBS. Замените вымытую среду средой для хондрогенной дифференцировки, которая обычно содержит модифицированную орлиную среду Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 1% ITS, 100 нМ дексаметазона, 50 мкг/мл аскорбат-2-фосфата, 40 мкг/мл пролина и 10 нг/мл трансформирующего фактора роста-бета-3 (TGF-β3) (см. Таблицу материалов).
    3. Поддерживайте клетки в среде хондрогенной дифференцировки, меняя среду каждые 2-3 дня. Примерно через три недели DPSC должны дифференцироваться в хондроцитоподобные клетки.
    4. Закрепите клетки, инкубируя их с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации окрашивают клетки альцианским синим (см. Таблицу материалов) и визуализируют их под микроскопом для подтверждения хондрогенной дифференцировки (рис. 5).
    5. Подтвердите дифференцировку DPSC в хондроциты с помощью таких методов, как окрашивание протеогликанов Alcian Blue или анализ экспрессии генов хондрогенных маркеров, таких как аггрекан, SOX9 и коллаген II типа33,34.

Результаты

В результате успешного выполнения описанного протокола были получены стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), способные к многолинейной дифференцировке, демонстрирующие свою мультипотенцию.

Анализы жизнеспособности
Жизнеспособность DPSC оценивалась с помощью анализа исключения Trypan Blue в различные моменты времени. Результаты демонстрируют неизменно высокую жизнеспособность (более 95%) на протяжении всего периода культивирования, демонстрируя надежность нашего протокола изоляции и культивирования.

Анализы колониеобразующей единицы (КОЕ)
Для оценки способности DPSC к самообновлению были проведены анализы КОЕ. Одноклеточную суспензию покрывали с низкой плотностью и культивировали в течение 14 дней. Образовавшиеся колонии затем окрашивались и подсчитывались. Результаты показывают множество колоний, что указывает на высокую долю самообновляющихся клеток в популяции DPSC.

Время удвоения ячеек
Время удвоения клеток рассчитывалось на основе кривой роста DPSC. Клетки засевались с определенной плотностью и регулярно подсчитывались для построения кривой роста. Затем время удвоения было рассчитано с использованием фазы экспоненциального роста кривой. Результаты показывают время удвоения, соответствующее тому, которое было зарегистрировано для МСК, что предполагает здоровую и пролиферативную популяцию клеток (Рисунок 6).

Анализ проточной цитометрии
Анализ проточной цитометрии показал, что подавляющее большинство DPSC (например, >95%) были положительными на CD90, CD73 и CD105, подтверждая их идентичность как МСК (рис. 7). Более того, менее 2% клеток были положительными на CD45, CD34 и HLA-DR, что подтверждает отсутствие значительной контаминации гемопоэтических или эндотелиальных клеток.

Остеогенная дифференцировка
После завершения остеогенной дифференцировки клетки демонстрировали минерализованный матрикс, который визуализируется с помощью окрашивания Alizarin Red S (рис. 3). Наличие красной окраски в окрашенных клетках указывает на успешное осаждение минерализованного матрикса, что является важной характеристикой остеогенной дифференцировки. Невозможность успешного дифференцировочного окрашивания потенциально может быть связана с проблемами, возникающими во время процедуры отбора проб.

Адипогенная дифференцировка
В ходе адипогенной дифференцировки в DPSC накапливались липидные капли, свидетельствующие об адипогенезе. Липидные капли можно наблюдать при окрашивании Oil Red O (Рисунок 4). Успешная дифференцировка привела к образованию оранжево-красных окрашенных липидных капель внутри клеток.

Хондрогенная дифференциация
Наконец, после хондрогенной дифференцировки DPSC продуцировали гликозаминогликаны, критический хрящевой компонент, подтвержденный окрашиванием Alcian Blue, который связывается с этими гликозаминогликанами. Клетки, успешно претерпевающие хондрогенез, при окрашивании имели синюю окраску (рис. 5).

Клетки, которые не смогли продемонстрировать соответствующие изменения цвета в процедурах окрашивания, могут быть вызваны неоптимальной дифференцировкой, возможно, из-за проблем со средой для дифференцировки или исходным качеством DPSC. Важно обеспечить качество сред и добавок, а также здоровье и количество используемых DPSC. Успешная дифференцировка DPSC в остеобласты, адипоциты и хондроциты подтверждает мультипотентную природу этих клеток и подчеркивает их потенциал в регенеративной медицине и терапевтических приложениях.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор выделения, характеризации и дифференцировки стволовых клеток пульпы зуба. На этом рисунке схематически представлен рабочий процесс выделения, определения характеристик и дифференцировки стволовых клеток пульпы зуба (DPSC). Процесс начинается с удаления зуба (или зубов) с последующей изоляцией пульповой ткани, из которой получают DPSC. После выделения DPSC проходят различные характерные тесты, чтобы подтвердить их идентичность стволовых клеток и оценить их жизнеспособность, скорость пролиферации и другие ключевые характеристики. Заключительная стадия, представленная на этой диаграмме, включает в себя индукцию дифференцировки, при которой DPSC обрабатываются специфическими факторами, направляющими их трансформацию в специализированные типы клеток, такие как остеобласты, адипоциты или хондроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Извлечение пульпы из удаленных зубов. (A) Удаленный зуб, подготовленный к удалению пульпы. (В) Секция удаленного зуба с помощью алмазного бора. (В) Удаление ткани пульпы из пульповой камеры. (D) Фрагментация пульповой ткани с помощью хирургического лезвия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Остеогенная дифференцировка стволовых клеток пульпы зубов (DPSC), подтвержденная окрашиванием Ализарином Red S (40x). Ярко-красное окрашивание выявляет отложение минерализованного матрикса, характерную особенность остеобластов, подтверждающую успешную остеогенную дифференцировку. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Адипогенная дифференцировка стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), продемонстрированная окрашиванием Oil Red O. Наличие ярко-красных капель представляет собой накопление липидов, отличительный признак адипоцитов, подтверждающий успешную адипогенную дифференцировку. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Хондрогенная дифференцировка стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), продемонстрированная с помощью окрашивания Alcian Blue Staining (40x). Интенсивный синий цвет указывает на наличие богатого протеогликанами внеклеточного матрикса, характерного для хондроцитов, подтверждающего успешную хондрогенную дифференцировку. Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Время удвоения клеток стволовых клеток пульпы зуба (DPSC). На этом рисунке показана кривая роста DPSC с течением времени. Клетки первоначально засевались с определенной плотностью, а подсчет клеток проводился через равные промежутки времени (представленные на оси x) для мониторинга скорости пролиферации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Экспрессия маркеров поверхности стволовых клеток в культуре DPSC. На этом рисунке показано выражение специфических поверхностных маркеров на DPSC. Маркеры мезенхимальных стволовых клеток CD44, CD90 и CD105 демонстрируют высокий уровень экспрессии, что указывает на наличие мезенхимальных признаков в этих клетках. И наоборот, экспрессия гемопоэтических маркеров (CD34 и CD45) и молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II (HLA-DR) практически незначительна, что подтверждает отсутствие клеток гемопоэтической линии в культуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В протоколе описывается выделение, культивирование и характеристика стволовых клеток пульпы зуба (DPSC) из молочных и постоянных зубов человека. Она включает в себя описание хранения и пролиферации этих клеток, а также оценку их потенциала дифференцировки in vitro в остеобласты, адипоциты и хондроциты35.

Chen et al.36 продемонстрировали, что стволовые клетки пульпы зуба (DPSC) могут быть получены из различных источников, включая инфицированные жизненно важные зубы человека, пораженные такими состояниями, как периодонтит, резорбция корней, перикоронит и переломы зубов, а также избыточные и смещенные зубы. Этот вывод был дополнительно подтвержден последующими исследованиями, в которых инфицированные жизненно важные зубы были определены как потенциальные источники DPSC 37,38,39,40. Тем не менее, Bernardi et al.10 отметили, что повышенная резорбция корней может пагубно повлиять на жизнеспособность этих стволовых клеток. Существенным препятствием в этом процессе является сохранение клеток и предотвращение их деградации, которая начинается сразу после удаления зуба или отшелушивания. Кроме того, важно отметить, что зубы, пораженные серьезными заболеваниями, такими как периапикальные абсцессы, опухоли или кисты, не должны использоваться для извлечения стволовых клеток40,41.

DPSC могут быть получены с помощью метода ферментативного сбраживания (ЭД) или метода вырастания из тканевых эксплантов (ОГ), также известного как метод спонтанного роста14,15. Исследователи используют эти стратегии для изучения эффективности клеточной пролиферации или поддержания морфологических и фенотипических атрибутов выделенных стволовыхклеток. Исследования показали, что стволовые клетки, выделенные методом ОГ, демонстрируют более медленную скорость пролиферации и более слабую экспрессиюмаркеров стволовых клеток. И наоборот, DPSC, выделенные методом ЭД, продемонстрировали более быструю пролиферацию, дифференцировку и повышенную экспрессию дополнительных поверхностных маркеров, чем выделенные методом OG. Интересно, что незрелые стволовые клетки пульпы зуба (IDPSC), извлеченные из молочных зубов с использованием метода OG, показали, что клеточная культура способствовала избирательной пролиферации IDPSC, тем самым предотвращая раннюю дифференцировку42.

Очистка DPSC имеет решающее значение для получения высокорегенеративных клеток и требует специфических клеточных маркеров. Отбор клеток осуществляется с использованием флуоресцентных или магнитно-активируемых методов сортировки клеток. Помимо вышеупомянутых маркеров, из-за гетерогенной природыDSCs 43 также используются многочисленные другие поверхностные антигены. Тем не менее, не было выявлено ни одного маркера для разделения субпопуляций.

По сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга, DPSC были признаны многообещающим источником мультипотентных клеток из-заих мультилинейного потенциала. Эта стволовость, вероятно, является результатом относительной незрелости исходных тканей, поскольку зубы мудрости, часто являющиеся источником удаления DPSC, являются последними постоянными зубами, которые развиваются и, следовательно, менее зрелыми, чем костный мозг45. Этот протокол успешно исследует мультипотентную природу стволовых клеток пульпы зуба, индуцируя эти клетки к адипогенезу, остеогенезу и хондрогенезу. Примечательно, что DPSC являются единственным типом клеток, который повышает экспрессию DSPP при культивировании в остеогенных условиях, что указывает на их будущую дифференцировку в одонтобласты46.

Стоматологические стволовые клетки, выделенные из различных источников, демонстрируют множество потенциалов пролиферации и дифференцировки47. Значительные успехи, достигнутые в системах in vitro , оказали глубокое влияние на биологию и терапию стволовых клеток. Несмотря на эти достижения, остаются проблемы при переносе терапии стволовыми клетками из кабинета больного в постели больного. Особое внимание должно быть уделено выживаемости и стабильности стволовых клеток, чтобы гарантировать, что методы консервации не поставят под угрозу жизнеспособность этих клеток. В то время как исследования стоматологических стволовых клеток дали многообещающие результаты на животных моделях, существует острая необходимость распространить эти результаты на испытания на людях. Продолжая стимулировать тщательные исследования и разработки, стоматологические стволовые клетки готовы сыграть существенную роль в развитии области хранения стволовых клеток.

Несмотря на широкое распространение, ферментативный подход к расщеплению для выделения стволовых клеток пульпы зуба (DPSC) имеет ряд ограничений. Прежде всего, этот процесс может поставить под угрозу жизнеспособность клеток, поскольку ферменты, такие как коллагеназа и диспаза, могут непреднамеренно повредить клеточные мембраны, производя меньше живых стволовыхклеток. Кроме того, этот метод часто приводит к деградации жизненно важного внеклеточного матрикса (ВКМ), что имеет решающее значение для сохранения свойств, присущих стволовым клеткам. Процедура также может изменить маркеры клеточной поверхности, препятствуя точной идентификации и характеристике DPSC43. Помимо этих биологических ограничений, этот подход требует много времени, повышая риск микробного загрязнения из-за длительной инкубации при 37 °C. Кроме того, несоответствие между партиями ферментов может привести к переменным результатам, что ставит под сомнение воспроизводимость процедуры выделения. Нельзя сбрасывать со счетов финансовое бремя, так как высококачественные ферменты, пригодные для переваривания тканей, стоят дорого49. Кроме того, после пищеварения может наблюдаться остаточная активность ферментов, которая может пагубно повлиять на клеточные культуры, влияя на их здоровье, пролиферацию и дифференцировку. Наконец, потенциал ферментативного расщепления, позволяющий преимущественно выделять определенные субпопуляции DPSC по сравнению с другими, может непреднамеренно исказить результирующий клеточный пул, влияя на их терапевтический потенциал.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Мэтью Мажаванчерилу, директору и руководителю Исследовательского центра Пушпагири в Тирувалле, за его поддержку в документировании процедур в Исследовательском центре.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-изобути-l-метил-ксантин Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАI5879
Уксусная кислота Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, MO 63103.СШАRM471
Ализарин Red S раствор для окрашиванияSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, MO 63103.СШАGRM894
Набор для окрашивания щелочной фосфатазойThermo Fisher Scientific ,MA 02451,США
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, СШАGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, СШАGibco
Alpha-MEM, или Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, MA 02451, СШАGibco
Alpha-MEM, или Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, MA 02451, СШАGibco
Антибиотик/АнтимикотикSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАP4333
Аскорбат-2-фосфатSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.США012-04802
Бета-глицерофосфат Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, MO 63103.СШАG9422-10G
Шкаф биобезопасности-Ламинарный проточный колпакLabconco Corporation, MO 64132-2696,США
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 и HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,США
Клеточный фильтр (70 &; m )HiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи,ИндияTCP025Сетчатый фильтр для клеток
ЦентрифугаREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
ЦентрифугаHiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи, Индия1101 | 1102
CO2 ИнкубаторThermo Fisher Scientific, MA 02451,США
Коллагеназа типа IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, США
Коллагеназа типа IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, США
Полная среда для ростаHiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи,ИндияAT006DMEM
конические пробирки (15 или 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, США546021P/546041P15 мл и 50 мл
Криоконтейнер для заморозкиThermo Fisher Scientific, MA 02451,США15-350-50
CryolabelsLabel India:
Криовиальные коробки для хранения Криохранилище
Ящики для хранения КриовиалыThermo Fisher Scientific ,MA 02451,США
Криовиалы (1,8 мл)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,СШАPW1282Самостоятельная
колба для культуры (25 см & 2 & 2 )Corning Inc.NY 14831, США
Культура колбыHiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи, ИндияTCG4 / TCG6T25 / T75
Планшеты для культивированияHiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи, ИндияTCP129/TCP00860 мм/100 мм
стоматологические алмазные дискиKomet SC 29730, СШАKomet 
Экскаватор стоматологических ложекBrasseler, GA 31419, США5023591U0
ДексаметазонSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАD4902-25MG
ДексаметозонSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАD4902-25MG
ДексаметозонSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАD4902-25MG
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАTC185
DispaseRoche Diagnostics, Мангейм, Германия.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, США
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, США
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, этанол США
(70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи, ИндияMB106
Этанол -70%Thermo Fisher Scientific, MA 02451, СШАFisher Scientific
Extraction щипцы  Dentsply Sirona, США
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,СШАF2442-500ML
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,СШАF2442-500ML
Фетальная бычья сыворотка (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи,ИндияRM9954
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,СШАF2442-500ML
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,СШАF2442-500ML
Тканевая культуральная пластина, покрытая фибронектином, Corning Inc.Corning, NY 14831,США
Проточный цитометрBD Biosciences,CA 95131,США
Буфер для проточной цитометрииBD Biosciences, CA 95131, США
Стеклянная крышка 22 x 22 ммHiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи, ИндияTCP017
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Базель, Швейцария
Высокоскоростной стоматологический наконечник NSK Ltd, Токио 8216, ЯпонияTi-Max Z series
Сыворотка для лошадейThermo Fisher Scientific, MA 02451, США
IBMX, или 3-изобутил-1-метилксантинSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.США
ИндометацинPfizer Inc. NY 10017, США
Инсулин-трансферрин-селен (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, СШАI5523
Инсулин-трансферрин-селен (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, СШАI5523
Премикс инсулин-трансферрин-селен (ITS)Corning Incorporated, MA 01876, США
Инвертированный микроскопOlympus Corp., Токио 163-0914, Япония
Изопропанол (60%)Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАI9516
Изопропиловый спирт Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАMB063
Ламинарный проточный колпакThermo Fisher Scientific, MA 02451, США
Лидокаин смешанный с эпинефриномDENTSPLY, NC 28277, СШАЦитанест
жидкий азотAir Liquide, 75007 Париж, Франция
Резервуар для хранения жидкогоазота Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
МикропипеткиEppendorf AG,22339 Hamburg,Germany30020Accupipet-2-20 µ L
Мини-кофемолкаBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,СШАМини-кофемолки ReadyPrep
Минус 80 морозильная камераBlue Star Limited
Neubauer счетная камераMarienfeld, arktheidenfeld, Германия
Масляный красный O красительSigma-Aldrich Co. Сент-Луис, MO 63103.США1024190250
Остеогенная дифференцировочная среда (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Ванкувер, Британская Колумбия, V5Z 1B3, Канада
Параформальдегид (PFA)  Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, MO 63103.СШАTCL119
Пенициллин-стрептомицинGibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451,США
Фосфатный буферный раствор (PBS) без Ca++ и Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи,ИндияTS1101
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАGibco
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Proline Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.США
Лезвие скальпеля Размер 15 Swann-Morton Ltd, Шеффилд, S6 2BJ, UKBDF-6955C
Гипохлорит натрияHiMedia Laboratories  Ltd.Мумбаи, ИндияAS1024% w/v раствор
Стерильные центрифужные пробиркиTarsons Products Pvt. Ltd.
Стерильный контейнер -20 мл3M Center, MN 55144-1000,США3 M
Стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma Aldrich, СШАP3813-1PAK 1xPBS, pH 7,4
Стерильные пипетки (2, 5 и 10 мл)Eppendorf AG,22339 Гамбург, Германия
Стерильные пипетки и наконечникиEppendorf India Limited
Surgical Blade РучкаBecton, Dickinson and Co., Нью-Джерси, США371030BP Ручка 3
Трансформирующий фактор роста-бета 3 (TGF-β 3)Исследования и исследования D Systems, Inc.MN 55413,США
Трансформирующий фактор роста-бета-3 (TGF-β 3)Исследования и исследования D Systems, Inc.MN 55413,США
Трипановый синий 0,4% Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.США
Трипан Синий 0.4% Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАTCL046
Трипан синий 0.4% Sigma-Aldrich Co. Сент-Луис, Миссури 63103.СШАTCL046
Трипсин-ЭДТА Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,США
Трипсин-ЭДТА 0,25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,США
Водяная баняThermo Fisher Scientific ,MA 02451,СШАBSW-01D

Ссылки

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175(2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. Regenerative medicine-from protocol to patient. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572(2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945(2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392(2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372(2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114(2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854(2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434(2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -G., George, J. -M., Sweety, V. -K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906(2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89(2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531(2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213(2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DPSCoutgrowth

Похожие статьи