Разработка и характеристика децеллюляризованных гидрогелей внеклеточного матрикса легких

Summary

Протокол разъясняет две различные методики децеллюляризации, применяемые к нативным легочным тканям крупного рогатого скота, обеспечивая всестороннее описание их соответствующих характеристик.

Abstract

Использование гидрогелей, полученных из внеклеточного матрикса (ECM), в тканевой инженерии становится все более популярным, поскольку они могут имитировать естественную среду клеток in vitro. Тем не менее, поддержание нативного биохимического состава ВКМ, достижение механической стабильности и понимание влияния процесса децеллюляризации на механические свойства гидрогелей ВКМ являются сложной задачей. Описан трубопровод для децеллюляризации легочной ткани крупного рогатого скота с использованием двух различных протоколов, последующая характеристика эффективности децеллюляризации, изготовление восстановленных децеллюляризованных гидрогелей ВКМ легких и оценка их механических и цитосовместимых свойств. Децеллюляризацию легкого крупного рогатого скота проводили физическим (циклы замораживания-оттаивания) или химическим (на основе моющих средств) методом. Окрашивание гематоксилином и эозином проводили для подтверждения децеллюляризации и удержания основных компонентов ВКМ. Для оценки содержания остаточного коллагена и сульфатного гликозаминогликана (sGAG) в децеллюляризованных образцах использовали методы окрашивания Sirius red и Alcian Blue соответственно. Механические свойства децеллюляризованных гидрогелей ВКМ легких характеризовались колебательной реологией. Полученные результаты свидетельствуют о том, что децеллюляризованные гидрогели для легких крупного рогатого скота могут стать надежной органотипической альтернативой коммерческим продуктам ECM, сохраняя большинство нативных компонентов ECM. Кроме того, эти результаты показывают, что выбранный метод децеллюляризации существенно влияет на кинетику гелеобразования, а также на жесткость и вязкоупругие свойства получаемых гидрогелей.

Introduction

Традиционные монослойные условия культивирования не обеспечивают точного представления нативного тканевого микроокружения и не имеют возможности обеспечить трехмерный (3D) каркас с информативными лигандами, которые обеспечивают взаимодействие между клеткой и матрицей и клеткой между клетками^1. Состав и механические свойства внеклеточного матрикса (ВКМ) сильно тканеспецифичны, зависят от времени и претерпевают изменения при патологических состояниях. Поэтому существует потребность в биомиметических 3D-моделях тканей, которые позволяют настраивать такие характеристики, модулировать клеточное поведение и достигать желаемой функциональности тканей. Нативные биоматериалы, полученные из ECM, привлекают большое внимание в тканевой инженерии благодаря возможности прямого использования тканеспецифичных ECM 1,2,3,4,5. Носители на основе ECM используются во многих приложениях, начиная от регенерации тканей и заканчивая разработкой моделей заболеваний. Они используются в качестве инъекционных или имплантируемых каркасов биоматериалов ^4,5, в приложениях для скрининга лекарств ^6,7, при разработке материалов, индуцирующих рост клеток ^8,9,10, в качестве биочернил 11,12,13, в микрофлюидике¹⁴ и в моделях раковых тканей 15,16,17^,18,19.

Децеллюляризация тканей и органов является популярным подходом к созданию каркасов, имитирующих тканеспецифичные ВКМ. Восстановление децеллюляризованных тканей и органов в гидрогели позволяет встраивать клетки в биомиметические 3D модели тканей²⁰. Методы децеллюляризации в основном направлены на устранение клеточных компонентов с сохранением состава ECM. Для децеллюляризации тканей обычно применяются физические методы, такие как циклы замораживания-оттаивания или химические процессы, такие как обработка Triton-X-100. Кроме того, лечение ДНКазой предпочтительно для удаления остаточной ДНК, чтобы свести к минимуму иммунологические реакции при внедрении клеток. Для оптимизации процедур децеллюляризации крайне важно добиться максимального удаления клеток и минимального нарушения ECM²¹. Помимо этих аспектов, характеристика биохимических и механических свойств восстановленных скаффолдов, включая вязкоупругость и жесткость, имеет решающее значение для улучшения инженерных 3D-моделей тканей, полученных из нативных матриц²⁰.

Органоспецифическая ВКМ в легочной тканевой инженерии позволяет имитировать легочное микроокружение для моделирования процессов развития, гомеостатики или патологии in vitro и тестирования терапевтических средств в физиомиметических условиях 20,22,23. Предыдущие исследования продемонстрировали децеллюляризацию легочной ткани у нескольких видов, таких как крысы, свиньи и люди, но эти методы еще предстоит адаптировать к менее часто используемым видам, таким как крупный рогатый скот. Лучшее понимание параметров процесса децеллюляризации и того, как они влияют на полученные восстановленные каркасы ECM в отношении биохимического состава и механических свойств, позволит лучше настроить такие аспекты и проложить путь к более надежным тканевым моделям в норме и при заболеваниях. В этом исследовании децеллюляризация легких крупного рогатого скота двумя различными методами, циклами замораживания-оттаивания и обработкой Triton-X-100, подробно описана и сопровождается биохимическим и механическим анализом гидрогелей децеллюляризованных легких ECM (dECM). Полученные данные показывают, что оба метода обеспечивают эффективную децеллюляризацию и удержание лигандов ECM. Примечательно, что выбор метода существенно изменяет результирующую жесткость и вязкоупругость восстановленных гидрогелей. Гидрогели, полученные из бычьего dECM, демонстрируют заметные биохимические аналогии с внеклеточным матриксом легких человека и обладают надежными характеристиками термического гелеобразования²⁰. Как было описано ранее, оба метода подходят для 3D-культивирования клеток рака легких, здоровых эпителиальных клеток бронхов и органоидов легких, полученных от пациентов²⁰.

Protocol

Свежие нативные легкие от молодых (1-2 года) доноров крупного рогатого скота были получены с местной скотобойни и доставлены в герметичном пластиковом контейнере на льду в лабораторию. Жертвоприношение животных проводится для общего потребления мяса (легкие выбрасываются как отходы) и не связано с исследованием или в связи с ним. Мы подтверждаем, что скотобойня соответствует национальным законам и правилам о жертвоприношениях животных. Кроме того, мы подтверждаем, что использовали только отходы, и исследовательский проект не повлиял на количество принесенных в жертву животных.

1. Забор органов и подготовка тканей

1. Свежеполученные ткани легких крупного рогатого скота хранят при температуре -80 °C до начала эксперимента.
2. В день эксперимента подождите, пока замороженные легочные ткани оттают при комнатной температуре.
3. Рассеките ткани стерильными скальпелями и ножницами для удаления трахеи и хрящевых дыхательных путей, а затем измельчите на мелкие кусочки (5^мм3).
4. Тщательно промыть сверхчистой водой, содержащей 2% пенициллина/стрептомицина (P/S) не менее 3 раз.

2. Децеллюляризация тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Нативные ткани легких крупного рогатого скота децеллюляризовали с использованием двух различных протоколов.

1. Метод замораживания-оттаивания
   1. Подготовьте образцы тканей в соответствии с шагом 1. Измельченные ткани погрузить в 2% раствор йода в стерильную дистиллированную воду (dH₂O) на 1 мин. Выполните две последовательные стирки в стерильном dH₂O.
   2. Переложите измельченные кусочки ткани в пробирку объемом 50 мл до уровня 15 мл и выполните пять ручных циклов замораживания-оттаивания с помощью портативного контейнера с жидким азотом. Наполните пробирки доверху стерильным dH₂O и заморозьте пробирки на 2 минуты в жидком азоте. Через 2 мин немедленно перенесите их на водяную баню с температурой 37 °C на 10 мин. Это составляет 1 цикл замораживания-оттаивания.
   3. Инкубируют образцы с 30 мл раствора ДНКазы (10 ЕД/мл) в буфере 10 мМ MgCl₂ (рН 7,5) в течение 1 ч при 37 °C при постоянном встряхивании при 100 об/мин.
   4. Продолжайте интенсивную стирку со стерильным dH₂O в течение 3 дней при постоянном встряхивании при 100 об/мин, с пополнением раствора каждые 24 часа.
   5. Выполните лиофилизацию и криомление следующим образом²⁰: Заморозьте влажные образцы dECM при -80 °C в течение 24 часов. Перенесите замороженные образцы в лиофилизатор и работайте в режиме сушки под вакуумом в течение 3-4 дней до полного высыхания. По завершении сублимационной сушки произвести измельчение образцов в виде мелкодисперсного порошка с помощью измельчительного аппарата и сухого льда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это состояние мелкодисперсного порошка считается необходимым из-за его улучшенной растворимости на последующих стадиях процесса разложения.
2. Метод Тритон-Х-100
   1. Подготовьте образцы тканей в соответствии с шагом 1. Обрабатывайте легочные ткани 1% препаратом Triton-X-100 в течение 3 дней при осторожном вращении при температуре 4 °C. Замена раствора каждые 24 часа.
   2. Инкубируют образцы с раствором ДНКазы (10 ед/мл) в буфере 10 мМ MgCl₂ (рН 7,5) в течение 1 ч при 37 °C при постоянном встряхивании.
   3. Продолжайте интенсивное промывание стерильным dH₂O в течение 3 дней при осторожном вращении, с пополнением раствора каждые 24 часа.
   4. Выполните лиофилизацию с последующим криоизмельчением, как описано в шаге 2.1.

3. Переваривание пепсина

1. Дигестируют порошкообразные образцы dECM в концентрации 15 мг/мл (w/v) в растворе пепсина (1 мг/мл пепсина в 0,01 M HCl, pH 2). Проводите процесс разложения образца при комнатной температуре при постоянном помешивании в течение 48 ч и часто поддерживайте рН раствора для эффективного разложения.
2. Переложите дигестиви в пробирку и центрифугу при 5000 x g в течение 10 минут.
3. Соберите надосадочную жидкость, нейтрализуйте и буферизуйте ее до физиологических условий (pH 7, 1x фосфатный солевой буфер (PBS)) путем добавления 5M NaOH и 10x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать концентрированные щелочные растворы для регулирования рН кислого пищеварения, так как этот подход позволяет избежать нежелательного расширения объема, которое может отрицательно повлиять на гелеобразование на последующих этапах.
4. Храните предварительно гелевые дигестивали при температуре −20 °C для дальнейших исследований.

4. Гистологическое окрашивание

1. Зафиксируйте небольшую порцию (5^мм3) образца децеллюляризованной ткани в 1 мл 3,7% раствора формальдегида при температуре 4 °C в течение ночи.
2. Инкубируют ткани в пробирках, содержащих 1 мл 30% раствора сахарозы, в ПБС в течение 12 ч при 4 °С на устойчивой породе.
3. Чтобы поместить ткани в компаунд с оптимальной температурой резки (OCT), налейте 1 мл OCT в криоформу, поместите ткань в середину криоформы, затем налейте 2 мл OCT поверх ткани.
4. Поместите криоформы, содержащие ткани, на сухой лед и мгновенно заморозьте, используя жидкий азот. Образцы готовы, когда ОКТ становится полностью белой, что обычно занимает 3 минуты. Храните ткани, внедренные ОКТ, при температуре -20 °C до использования.
5. Получите срезы размером 10 мкм в криостате при -25 °C на предметном стекле с поли-L-лизиновым покрытием и переведите предметное стекло в комнатную температуру, чтобы дать возможность срезу ткани расплавиться на предметном стекле. Храните предметные стекла при температуре -20 °C до использования.
6. Для того, чтобы подтвердить отсутствие ядер после децеллюляризации, выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E), как описано ниже.
   1. Инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 10 мин. Погрузите предметные стекла в ПБС и окрасьте их готовым к использованию 50 мл раствора гематоксилина в банке для окрашивания на 3 мин, после чего 3 мин промыть водопроводной водой.
   2. Погрузите предметные стекла в 95% этиловый спирт и окрасьте 50 мл 0,5% спиртового раствора эозина в банке для окрашивания на 45 с.
7. Выполните окрашивание Sirius в красный цвет, чтобы показать сохранение содержимого коллагена после децеллюляризации.
   1. Увлажните предметные стекла PBS и погрузите их в 50 мл 0,1% сириуса красного в насыщенном водном растворе пикриновой кислоты в банке для окрашивания на 1 ч.
   2. Промойте предметные стекла в 0,5% растворе уксусной кислоты в течение 5 секунд и обезвоживайте все предметные стекла, последовательно замачивая их в 70%, 95% и 100% этаноле в течение 1 минуты каждое.
8. Чтобы проанализировать содержание sGAG в образцах тканей, выполните окрашивание альциановым синим, как описано ниже.
   1. Погружают предметные стекла в 50 мл 1% альцианового синего в 3% растворе уксусной кислоты (рН 2,5) в банку для окрашивания на 30 мин. Промойте предметные стекла проточной водой из-под крана в течение 2 минут.
   2. Обезвоживайте все предметные стекла, последовательно замочив их в 70%, 95% и 100% этаноле на 1 минуту каждое.
9. Добавьте 0,1 мл монтажной среды поверх образцов и визуализируйте с помощью световой микроскопии с 10-кратным увеличением.

5. Определение механических характеристик

1. Выполняйте измерения осцилляторных реологических свойств с помощью реометра с параллельной геометрией пластины.
2. Налейте 250 мкл раствора предварительного геля, хранящегося на льду, на предварительно охлажденную (4 °C) нижнюю пластину, чтобы избежать быстрого гелеобразования.
3. Опускайте параллельную пластину диаметром 20 мм до тех пор, пока раствор предварительного геля не образует диск с шириной зазора 1 мм между двумя пластинами.
4. Немедленно приступайте к измерению. Измеряйте модули накопления и потерь с течением времени с фиксированной частотой и деформацией при нагревании нижней пластины до 37 °C в течение 30 минут, чтобы наблюдать за кинетикой гелеобразования. Используйте фиксированную частоту 0,5 Гц и 0,1% деформации.
5. Выполните испытание на восстановление ползучести после того, как значение модуля накопления перестанет расти и достигнет плато.
6. Прикладывают к гидрогелю напряжение сдвига 1 Па в течение 15 мин, измеряют деформацию, выгружают образец из напряжения и регистрируют изменение значения деформации в течение 15 мин.
7. Нарисуйте график зависимости напряжения от времени, чтобы показать поведение, расслабляющее стресс. Повторите измерения для трех разных дайджестов dECM в качестве репликаций.

Results

Децеллюляризация
Децеллюляризация легочной ткани крупного рогатого скота с получением гидрогелей dECM, воспроизводящих нативное микроокружение легких, была достигнута как физическими (замораживание-оттаивание), так и химическими (Triton-X-100) методами. После вскрытия кусочки тканей промывали в dH2O-содержащих антибиотиках для удаления патогенов, которые в дальнейшем могут повлиять на стерильность гидрогелей dECM. В общей сложности пять циклов чередования жидкого азота с водяной баней 37 °C...

Discussion

Гидрогели органного происхождения стали многообещающими моделями, которые повторяют нативную ткань ECM и имитируют органотипическую клеточную функцию. Несмотря на то, что децеллюляризованная ВКМ легких часто используется в тканевой инженерии, тщательная характеристика состава и механических свойств биоматериала поможет лучше понять, как взаимодействия между клеткой и ВКМ могут быть модулированы для моделирования биологических процессов во время гомеостаза или заболевания. В частности, оценка и контроль механических свойс...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Абсолютный этанол	ISOLAB	64-17-5
Уксусная кислота	ISOLAB	64-19-7
Раствор альцианского синего	Sigma-Aldrich	B8438
Дезоксирибонуклеаза I из бычьей поджелудочной железы	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 реометр	TA Instruments
Entellan монтажная среда	Merck	107960
Раствор эозина	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Формальдегид	Электронная микроскопия Науки	50-980-485
Соляная кислота	Merck	100317
Йод	Sigma-Aldrich	3002
Хлорид магния	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Раствор для окрашивания гематоксилина по Майеру	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T соединение	Tissue-Tek	4583
Пенициллин/стрептомицин	Biowest	L0018-100
Пепсин из слизистой оболочки желудка свиньи	Sigma-Aldrich	P6887
Пикриновая кислота	Polysciences	88-89-1
Сириус Ред	Polysciences	09400-25
Гидроксид натрия	Sigma-Aldrich	S5881
Сахароза	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298