Источником пищи для Caenorhabditis elegans в лаборатории является живая кишечная палочка. Поскольку бактерии метаболически активны, они представляют собой искажающую переменную в метаболических и лекарственных исследованиях C. elegans. Подробный протокол метаболической инактивации бактерий с использованием параформальдегида описан здесь.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Методология метаболически инактивировать бактерии для исследования Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Caenorhabditis elegans является распространенным модельным организмом для исследований в области генетики, развития, старения, метаболизма и поведения. Поскольку C. elegans потребляют пищу из живых бактерий, метаболическая активность их источника пищи может запутать эксперименты, направленные на изучение прямого воздействия различных вмешательств на червя. Чтобы избежать сбивающих с толку эффектов бактериального метаболизма, исследователи C. elegans использовали несколько методов метаболической инактивации бактерий, включая ультрафиолетовое (УФ)-облучение, тепловое убийство и антибиотики. УФ-обработка имеет относительно низкую пропускную способность и не может быть использована в жидких культурах, поскольку каждая пластина должна быть исследована на предмет успешного уничтожения бактерий. Второй метод обработки, тепловое умерщвление, отрицательно влияет на текстуру и питательные качества бактерий, что приводит к остановке развития C. elegans. Наконец, лечение антибиотиками может напрямую изменить физиологию C. elegans в дополнение к предотвращению роста бактерий. В данной статье описывается альтернативный метод метаболической инактивации бактерий с использованием параформальдегида (PFA). Лечение PFA сшивает белки в бактериальных клетках, чтобы предотвратить метаболическую активность, сохраняя при этом клеточную структуру и содержание питательных веществ. Этот метод является высокопроизводительным и может быть использован в жидких культурах или твердых планшетах, так как тестирование одной пластины бактерий, обработанных PFA, на рост проверяет всю партию. Метаболическая инактивация с помощью лечения PFA может быть использована для устранения искажающих эффектов бактериального метаболизма в исследованиях лекарственного или метаболитного приема добавок, стрессоустойчивости, метаболомики и поведения C. elegans.
Введение
Caenorhabditis elegans был первоначально предложен в качестве модельного организма в 1965 году1 и с тех пор широко используется в исследованиях генетики, развития, поведения, старенияи метаболизма. Благодаря большому размеру выводка и прозрачной кутикуле C. elegans особенно хорошо подходит для высокопроизводительного скрининга с флуоресцентными репортерами3. Их короткий жизненный цикл, гермафродитное размножение и генетическая гомология с человеком также делают C. elegans ценной модельной системой для исследований развития4 и биологии старения
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Посев бактерий
- Приготовьте отвар Лурия (LB), растворив 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлорида натрия (NaCl) в 950 мл дистиллированной воды.
- Отрегулируйте pH LB до 7,0, добавив 5M гидроксида натрия (NaOH). Для этого потребуется всего около 0,2 мл NaOH.
- Автоклавируйте среду LB с регулируемым pH в жидком цикле в течение 45 минут при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм. Дайте раствору остыть и храните при комнатной температуре.
- Инокулируют одну колонию бактерий в 100 мл LB в колбу Эрленмейера объемом 500 мл. Культивируйте бактерии в течение ночи в инкубаторе-шейкере при температуре 37 °C. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Подробный рабочий процесс протокола показан на рисунке 1. Был разработан и оптимизирован высокопроизводительный метод последовательной инактивации репликации бактерий (рис. 2A) и метаболизма (рис. 2B) для метаболических и лекарственных исследований в исследованиях C. elegans с использованием параформальдегида16. Цель состояла в том, чтобы определить самую низкую концентрацию PFA, необходимую для посл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Преимущества уничтожения PFA по сравнению с другими методами уничтожения бактерий
Обработка PFA является высокопроизводительным методом предотвращения бактериального метаболизма при сохранении питательного источника пищи для C. elegans. Уничтожение бактерий с помощью PFA-обработки имеет множество преимуществ по сравнению с другими методами. В отличие от УФ-обработки, где каждая пластина должна быть проверена на успешное уничтожение, одна пластина из партии бактерий, обработанных PFA, может бы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа финансировалась NIH R21AG059117 и Лабораториями Пола Ф. Гленна по исследованию биологии старения в Мичиганском университете. SB финансировался компанией T32AG000114. ESK финансировался NSF DGE 1841052.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Скобы из алюминиевой фольги | 2549291 | ||
| горелке Бунзена | VWR | 470121-700 | |
| Измеритель плотности ячеек | Denville | 80-3000-45 | |
| Центрифуга | Eppendorg | 5430 | |
| Химический вытяжной шкаф | Labcono | 975050411384RG | |
| Конинкальные пробирки (50 мл) | Fisher | 339652 | |
| Кюветы | Фишер | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Колбы Эрленмайера | Фишер | 250 мл: FB501250<бр/> 500 мл: FB501500<бр/> 1000 мл: FB5011000 | |
| Петля инокуляции | Фишер | 22-363-605 | |
| LB Агар | Фишер | BP1425500 | |
| Бутылка для сбора жидких отходов | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Сульфат магния (MgSO4) | Sigma M7506 | ||
| (32%) | Электронная микроскопия Sciences | 15714-S | Параформальдегид – раствор без метанола |
| Пипеттор | Eppendorf Eppendorf | Easypet 3 | |
| Пластиковая посуда (100 мм) | Fisher | FB0875712 | |
| Моноосновной фосфат калия (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Набор для анализа внеклеточного потока и микропланшет для клеточных культур | Agilent | 101085-004 | |
| Серологические пипетки (50 мл) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Шейкер инкубатор | Thermo | 11 676 083 | |
| Натрия хлорид (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Двухосновной фосфат натрия безводный (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Ведро для сбора твердых отходов | M& М Индастриз | 5,0 галлона M1 Традиционное ведро | |
| Триптон | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Весы Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Весы | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Экстракт дрожжей | Genesee Scientific | 20-255 |
Ссылки
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
