Методическая статья

Применение окрашивания живых митохондрий при сортировке клеток для очистки гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/65777

⸱

1 декабря 2023 г.

 , 
1Innovative Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Kansai Medical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гепатоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, могут быть очищены путем сортировки клеток с использованием комбинации окрашивания митохондриальными и активированными молекулами адгезии лейкоцитарных клеток (ALCAM, также известными как CD166).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭС) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПКС) имеют потенциальное применение в клеточной регенеративной медицине для лечения тяжелобольных органов благодаря их неограниченной пролиферации и плюрипотентным свойствам. Тем не менее, дифференциация человеческих ES/iPS-клеток в 100% чистые типы клеток-мишеней является сложной задачей из-за их высокой чувствительности к окружающей среде. Онкогенез после трансплантации вызывается загрязненными, пролиферирующими и недифференцированными клетками, что делает технологию высокой очистки необходимой для безопасной реализации регенеративной медицины. Для снижения риска онкогенеза была разработана технология высокой очистки гепатоцитов человека, полученных из iPS-клеток. В методе используется FACS (флуоресцентно-активируемая сортировка клеток) с использованием комбинации высокого содержания митохондрий и маркера клеточной поверхности ALCAM (активированная молекула адгезии лейкоцитарных клеток) без генетической модификации. 97% ± 0,38% (n = 5) очищенных гепатоцитов, использующих этот метод, проявляли экспрессию белка альбумина. Целью данной статьи является предоставление подробных процедур для этого метода применительно к самому современному методу двумерной дифференцировки iPS-клеток человека в гепатоциты.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ЭС и ИПК соответственно) считаются перспективными источниками клеток для регенеративной терапии. Тем не менее, эффективность дифференцировки этих клеток в конкретные типы клеток-мишеней может варьироваться, даже при использовании одной и той же клеточной линии, протокола и экспериментатора 1,2,3,4. Эта изменчивость может быть связана с высокой чувствительностью клеток ES/iPS человека к окружающей среде. Поэтому в настоящее время сложно стабильно получать чистые клетки-мишени. Для достижения высокобезопасной регенеративной медицины крайне важно элиминировать пролиферативные клетки и недифференцированные стволовые клетки в терапевтических клетках, а также передовая технология очистки клеток-мишеней 5,6,7.

Сортировщик клеток — это устройство, которое мгновенно анализирует отдельные клетки и сортирует интересующие их живые клетки на основе уровня флуоресцентного сигнала, предлагая многообещающее решение. Это может быть достигнуто путем окрашивания антителами поверхностных маркеров, специфичных для типа клеток, или путем использования экспрессии репортерных генов, специфичных для типа клеток. Существует несколько сообщений о методах очистки кардиомиоцитов 8,9,10, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, и гепатоцитов11,12. Hattori et al. разработали инновационный метод митохондриальной очистки с использованием клеточного сортировщика13. Учитывая тот факт, что кардиомиоциты обладают высокими энергетическими потребностями благодаря митохондриальной активности, окрашивание клеток живым митохондриальным красителем TMRM (метиловый эфир тетраметилродамина) может быть использовано для мечения и высокой очистки кардиомиоцитов с помощью FACS из эмбриоидных телец человеческих ES-клеток, содержащих различные типы клеток. Отсутствие онкогенности было подтверждено анализами на образование тератомы с очищенными кардиомиоцитами. Кроме того, Ямасита и др. неожиданно открыли метод очистки гепатоцитов из эмбриоидных телец человека, полученных из ES-клеток, путем выделения фракций с высокой митохондриальной активностью и ALCAM-положительнойэкспрессией. Обоснование этого метода заключается в том, что гепатоциты также имеют относительно большое количество митохондрий из-за высокого потребления ими АТФ для метаболизма питательных веществ и детоксикации15, а гепатоциты экспрессируют ALCAM, члена суперсемейства иммуноглобулинов, который играет роль в адгезии и миграции клеток16.

Предыдущие высокоочищающие методы для гепатоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, требовали генетических модификаций, а негенетические методы очистки имели низкую эффективность. Митохондриальный негенетический метод имеет достоинства для достижения высокой чистоты. Когда необходимы печеночные клетки-предшественники, можно выбрать методына основе CD133 и CD13- или Dlk1 18,19. Несмотря на то, что точность технологии редактирования генома продвинулась вперед, потенциальный риск непредвиденных изменений генома (например, канцерогенеза) не может быть полностью устранен. Методы, основанные на митохондриальной активности, без привлечения генетической модификации, могут быть свободны от таких рисков.

В результате исследования различных митохондриальных показателей в кардиомиоцитах новорожденных крыс наблюдалось полное исчезновение ТМРМ в течение 24 ч, в то время как другие красители сохранялись в течение не менее 5 дней13 дней. Кроме того, важно отметить, что TMRM и JC-1 не влияли на жизнеспособность клеток при оценке с помощью анализа 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ), в то время как другие красители продемонстрировали различное влияние на жизнеспособностьклеток13. TMRM демонстрирует более высокую безопасность.

На сегодняшний день разработано несколько методов двумерной (2D) дифференцировки в качестве более эффективных подходов к индуцированию дифференцировки по сравнению с трехмерным (3D) формированием эмбриоидного тела. Это связано с тем, что пошагово индуцирующие дифференцировку соединения или цитокины могут быть равномерно введены в клетки в двумерной плоскости, а не в трехмерном пространстве. В данном исследовании ранее описанный метод20 был модифицирован для индуцирования дифференцировки в гепатоциты, полученные из iPS-клеток человека. В данной работе подробно описаны процедуры современной 2D-дифференцировки и очистки гепатоцитов, полученных из iPS-клеток человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании использовались коммерчески полученные человеческие iPS-клетки (штамм 253G1) (см. Таблицу материалов).

1. Поддержание iPS-клеток человека

  1. Поддерживайте iPS-клетки человека в безпитательных условиях в среде AK02 на чашках для культур, покрытых 0,25 мкг/см2 iMatrix-511 (см. Таблицу материалов).

2. Печеночная дифференцировка iPS-клеток человека в 2D-культурах

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1А приведен ежедневный график печеночной дифференцировки. На протяжении всего процесса используйте 6-луночные планшеты для культивирования и добавляйте 2 мл специальной промывочной или питательной среды в каждую лунку. Поддерживайте состояние клеточной культуры при 100% влажности, 5%CO2 и 20%O2 при 37 °C.

  1. Смажьте каждую лунку 6-луночного планшета 1 мл матрицы базальной мембраны (разбавленной на 1/25 PBS (-)) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
  2. Пропустите человеческие iPS-клетки на покрытую оболочкой чашку с плотностью 20 000-30 000 клеток/см² с использованием среды AK02N с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK (Y-27632) (см. Таблицу материалов). Замените среду без Y-27632 на следующий день и культуру еще на 2 дня.
  3. Промойте клетки один раз средой RPMI-1640. Инициируйте дифференцировку энтодермы, заменив среду на RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% инсулин B27 + 1% дипептид L-аланил-L-глутамин) с добавлением 3-6 мкМ CHIR-99021 и 100 нг/мл активина А в течение 24 ч (см. таблицу материалов).
  4. Замените среду на RPMI-B27-Glu с добавлением 50 нг/мл активина А на 24 ч.
  5. Чтобы вызвать дифференцировку печеночных предшественников, замените среду на RPMI-B27-Glu с добавлением 1% диметилсульфоксида (ДМСО) на 5 дней.
  6. Чтобы ускорить созревание гепатоцитов, переключитесь на среду для созревания гепатоцитов: среду L-15 Лейбовица, содержащую 10 мкМ гидрокортизона 21-гемисукцината, 8,3% триптозофосфатного бульона, 100 нМ дексаметазона (DEX), 50 мкг/мл натрия-L-аскорбата, 0,58% инсулин-трансферрин-селена (ITS), 8,3% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ дипептида L-аланил-L-глутамина и 100 нМ N-гексаноевого-три-иле-(6)-аминогексанового амида (Дигекса) (см. Таблицу материалов).
  7. Меняйте носитель каждые 2 дня в течение 20 дней. Отсортируйте клетки примерно через 27 дней после начала дифференцировки.

3. Клеточный препарат для очистки гепатоцитов iPS-клеток человека

  1. Печеночные дифференцированные клетки промывают 2 мл PBS (-) на лунку.
  2. Добавьте в буфер Ads 1 мл раствора фермента, который включает 0,1% коллагеназу, 0,083% трипсина, 10 мкМ ингибитора ROCK (Y-27632), 20 нМ циклоспорина А и 50 мкг/мл L-аскорбата натрия (116 мМ NaCl, 12,5 мМ2PO4, 20 мМ HEPES, 5,4 мМ KCl, 5,6 мМ глюкозы и 0,8 мМ MgSO4; pH 7,35) (см. Таблицу материалов). Отделите ячейки от пластин, вращая их горизонтально при температуре 37 °C в течение примерно 2 часов.
  3. Убедившись, что клетки отделены и округлены под микроскопом, диспергируйте их в отдельные клетки с помощью щадящего пипетирования и соберите в пробирку объемом 50 мл.
  4. Центрифугируйте ячейки при 200 x g в течение 5 минут при 18 °C для их гранулирования. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора.
  5. Окрашивание митохондрий клеток путем диспергирования их в 5 мл среды для созревания гепатоцитов, содержащей 100 нМ TMRM (тетраметилродамин, сложный эфир метла) (см. Таблицу материалов). Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C, защищая от света, завернув в алюминиевую фольгу.
  6. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут при 18 °C для их гранулирования. Удалите надосадочную жидкость.
  7. Ресуспендируйте ячейки с 1-5 мл буфера холодной рекламы, содержащего 2% FBS.
  8. Подсчитайте количество клеток с помощью 0,4% раствора трипанового синего и планшета для подсчета клеток.
  9. Центрифугируйте ячейки при 200 x g в течение 5 минут при 4 °C для их гранулирования. Удалите надосадочную жидкость.
  10. Разведите антитело против ALCAM (первичное антитело, см. Таблицу материалов) в соотношении 1:50 в буфере Ads и добавьте 100 мкл разведенного антитела на 10-6 клеток. Окрасьте ячейки на 50 минут на лед. Подготовьте клетки, которые не окрашены первичным антителом в качестве отрицательного контроля.
  11. Промойте ячейки холодным буфером Ads, содержащим 2% FBS, дважды.
  12. Разбавьте IgG против коз Alexa Fluor 488 (вторичное антитело, см. Таблицу материалов) в соотношении 1:100 в буфере Ads и добавьте 100 мкл разведенного антитела на 106 клеток. Покрасьте клетки на 30 минут на лед. Окрашивание клеток, которые не были окрашены первичным антителом, с помощью вторичного антитела.
  13. Промойте ячейки холодным буфером Ads, содержащим 2% FBS, дважды.
  14. Повторно суспендируйте ячейки в буфере Ads и отфильтруйте их через сетчатый фильтр с защелкивающейся крышкой (меш 35 мкм) непосредственно перед сортировкой с помощью FACS, чтобы удалить крупные скопления клеток и мусор.

4. FACS-анализ и сортировка гепатоцитов, полученных из iPS-клеток человека

  1. Настройте машину FACS для сортировки ячеек в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сопло размером 85 мкм или 100 мкм и нейтральный фильтр 2,0 для гепатоцитов. Используйте канал FITC для детектирования Alexa Flour 488 для ALCAM и канал PE для детектирования флуоресценции TMRM для митохондрий.
  2. Отрегулируйте напряжения FSC (прямое рассеяние) и SSC (боковое рассеяние) для правильной визуализации популяции ячеек.
  3. Отрегулируйте напряжение флуоресцентных каналов FITC и PE. Начните с неразмеченных ячеек и центрируйте популяцию ячеек в нижней части каждого графика канала. Убедитесь, что помеченные ячейки правильно расположены в пределах графика.
  4. Используйте общую стратегию стробирования для устранения дублетов: Гейт основной FSC-A против Популяция SSC-A (Рисунок 2A), за которой следует FSC-H в сравнении с -W, а затем SSC-H против. -W (Рисунок 2B,C).
  5. Загатите популяцию TMRMhi и ALCAM+ (P2 на рисунке 2E) для сортировки гепатоцитов. Загатите популяцию TMRMhi и ALCAM- (P1 на рисунке 2E) для сортировки негепатоцитов. Отсортированные гепатоциты и негепатоциты соберите в пробирки для сбора по 15 мл, содержащие среду для созревания гепатоцитов.
  6. Центрифугируйте сборную пробирку, содержащую отсортированные клетки, при температуре 200 x g в течение 5 мин при 18 °C.
  7. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в среду для созревания гепатоцитов.
  8. Посев клеток на обработанные митомицином С эмбриональные фибробласты мышей (МЭФ) или гелеобразный матрикс базальной мембраны средой для созревания гепатоцитов с добавлением 10 мкМ Y-27632 и 20 нМ циклоспорина А. Культивирование клеток в инкубаторе с температурой 37 °C CO2 в течение 5 дней.

5. Иммуноцитохимия для обнаружения гепатоцитов iPS-клеток человека

  1. Культивируемые клетки промыть в течение 5 дней после сортировки PBS (-).
  2. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 5 минут при комнатной температуре.
  3. Промойте клетки буфером TBS-T (1x TBS с 1% Tween 20) дважды, чтобы удалить параформальдегид.
  4. Инкубировать клетки с 0,1% разбавленным буфером TBS-T Triton X-100 в течение 5 минут при комнатной температуре.
  5. Дважды промойте элементы буфером TBS-T, чтобы удалить Triton X-100.
  6. Добавить в ячейки имеющийся в продаже раствор блокировки (см. Таблицу материалов) на 30 мин при комнатной температуре.
  7. Добавьте первичные антитела против альбумина (маркера гепатоцитов) и ядерного антигена человека (hNA, см. таблицу материалов), разведенные в соотношении 1:50 в блокирующем растворе.
  8. Инкубируйте клетки при температуре 4 °C в течение ночи. Дважды промойте ячейки буфером TBS-T.
  9. Добавьте вторичные антитела: Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG и Alexa Fluor 546 donkey anti-mouse IgG, разведенные в соотношении 1:100 в блокирующем растворе (см. Таблицу материалов).
  10. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 30 минут. Дважды промойте ячейки буфером TBS-T.
  11. Оцените чистоту гепатоцитов путем подсчета альбумин-положительных и hNA-положительных клеток под флуоресцентным микроскопом. Рассчитайте процент альбумин-положительных клеток на hNA-положительную клетку для популяций P1 и P2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Показана временная шкала процессов, индуцирующих дифференцировку iPS-клеток человека в гепатоциты с помощью 2D-культуры (рисунок 1A) и репрезентативных особенностей клеток (рисунок 1B). Примерно на 12-й день дифференцировки клетки начали проявлять многоугольную клеточную форму и круглые ядра, характерные для гепатоцитов. Некоторые гепатоциты также проявляли многоядерность.

Анализ FACS проводили с использованием клеток на 27-е сутки ди...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодаря своей функции в метаболизме питательных веществ и детоксикации, гепатоциты обладают относительно большим количеством митохондрий по сравнению сдругими типами клеток. ALCAM входит в суперсемейство иммуноглобулинов и играет роль в адгезии и миграции клеток. Он экспрессируется в различных типах клеток, включая печеночные, эпителиальные, лимфоцитарные, миелоидные, фибробластные и нейрональные клетки16. С помощью комбинации метода, основанного на митохондриях, и антите...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом No 23390072] Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий [].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
253G1 человеческая iPS-клеточная линияRIKEN BioResource Research CenterHPS0002
4% параформальдегидаFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-20145
Раствор активина А, человек, рекомбинантныйNACALAI TESQUE, INC.18585
Антитело против ядер, клон 235-1ChemiconMAB1281Антитело против ядерного антигена
человека B-27 Добавка (50x), без сывороткиThermo Fisher Scientific17504044
BD FACSAria IIIBD BiosciencesКлеточный сортировщик
CHIR-99021MedChemExpressHY-10182 
Циклоспорин АFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation035-18961
КоллагеназаFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица базальной мембраныCorning354230Гелеобразная матрица базальной мембраны
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-24023Ингибитор ROCK
ДексаметазонFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-18863
Диметилсульфоксид (ДМСО)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Высокоперекрестно адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206
Falcon 5 мл Круглое дно Полистирольная пробирка, с клеточным фильтром Защелкивающийся колпачокCorning352235
фетальной сывороткойкрупного рогатого скотаBiowest51820-500
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Антитела человека/мыши/крысы/собаки ALCAM/CD166R& D SystemsAF1172
Гидрокортизон 21-гемисукцинат натриевая сольSigma-AldrichH2270
iMatrix-511 шелкNippi892021
ImmunoBlockKACCTKN001Блокирующий раствор
ITS-G Supplement(× 100)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation090-06741
Leibovitz's L-15 MediumFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation128-06075
N-гексаноик-три-иле-(6)-аминогексановый амид (дигекса)Toronto Research ChemicalsH293745
поликлональный кролик античеловеческий альбуминдакоA0001
полиоксиэтиленсорбитан Monolaurate (Tween 20)NACALAI TESQUE, INC.28353-85
RPMI-1640FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation189-02025
L-аскорбат натрияNACALAI TESQUE, INC.03422-32
StemFit AK02NРЕПРОЦЕЛЛRCAK02N
TBS (10x)NACALAI TESQUE, INC.12748-31
Тетраметилродамин, метиловый эфир (TMRM)Thermo Fisher ScientificT668
Triton X-100NACALAI TESQUE, INC.28229-25
Трипан Блю СолюшнNACALAI TESQUE, INC.20577-34
ТРИПСИН 250Difco215240
Раствор триптозофосфатного бульонаSigma-AldrichT8159

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
  2. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  3. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  4. Chen, C. X. -Q., et al. Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons. bioRxiv. , (2021).
  5. Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).
  6. Nori, S., et al. Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition. Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).
  7. Hentze, H., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).
  8. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  9. Hidaka, K., et al. Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells. The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).
  10. Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype. The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).
  11. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  12. Takayama, K., et al. Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research. Biomaterials. 161, 24-32 (2018).
  13. Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature methods. 7, 61-66 (2009).
  14. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  15. Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis. Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).
  16. Swart, G. W. M. Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration. European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).
  17. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).
  18. Kamiya, A., Inagaki, Y. Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration. Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).
  19. Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential. PLOS One. 8 (7), e67541(2013).
  20. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).
  21. Hirata, H., et al. ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes. Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Live Mitochondria StainingCell SortingHuman Induced Pluripotent Stem CellsHepatocyte PurificationFluorescence Activated Cell SortingHepatic DifferentiationALCAM MarkerTMRM StainingAlbumin ExpressionHepatic Progenitor Cells

Похожие статьи