Здесь мы представляем протокол получения энтомопатогенных грибов от лесного древоточца и заместительный способ оценки их энтомопатогенной активности с помощью модельного насекомого Coleopteran. Этот метод эффективен и удобен для изучения энтомопатогенных грибных ресурсов от насекомых-вредителей древоточения в естественных лесах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение, поведенческая идентификация и оценка патогенности энтомопатогенных грибов из лесного древоточца
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лесные древоточцы (FWB) наносят серьезный ущерб древесине и наносят экономический ущерб во всем мире. Выделение энтомопатогенных грибов (ЭПФ) в период появления ДСБ считается приемлемой альтернативой химическому контролю. Тем не менее, ресурсы EPF были значительно менее изучены для FWB, в отличие от сельскохозяйственных насекомых-вредителей. В данной статье представлен протокол исследования ресурсов EPF из FWB на примере диких популяций Monochamus alternatus . В этом протоколе назначаются ловушки с приманкой с М. Аттрактанты Alternatus для различных популяций гарантировали сбор адекватных образцов с естественными симптомами инфекции в периоды появления жука. После тонкого препарирования покровов и помещения их в селективную среду виды грибов были выделены из каждой части тел жуков и идентифицированы на основе как молекулярных, так и морфологических признаков.
Несколько видов грибов были сертифицированы как паразитические EPF путем повторного заражения здоровых M. alternatus споровыми суспензиями. Их поведенческие фенотипы на M. alternatus наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии и в дальнейшем сравнивали с таковыми на модельном насекомом Tribolium castaneum. Для EPF, которые демонстрируют устойчивые фенотипы паразитизма на обоих видах жуков, оценка их активности на T. Castaneum предоставил ценную информацию о летальности для будущих исследований M. alternatus. Этот протокол помог обнаружить недавно зарегистрированный EPF в популяциях M. alternatus в Китае, который может быть применен в качестве эффективного подхода для изучения большего количества ресурсов EPF из других FWB.
Введение
Опустошение, вызванное насекомыми-вредителями, привело к большим экологическим и экономическим потерям как в лесных, так и в сельскохозяйственных экосистемах. Большинство сельскохозяйственных вредителей подвергают себя воздействию естественных врагов или искусственных агентов контроля, повреждая растения-хозяева. Вместо этого лесные древоточцы (FWB) почти полностью завершают свои циклы развития внутри стволов деревьев-хозяев1, что создает большие проблемы для изучения эффективных организмов биоконтроля из FWB в дикой природе. Что еще хуже, так это то, что ДББ являются носителями большого количества фитопатогено....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение грибов из M. alternatus (рис. 1)
- Соберите образец жука
- Собираем сосны жуков-пилильщиков М. альтернативы с использованием коммерческих ловушек (см. Таблицу материалов) с приманкой аттрактантами до прогнозируемых периодов появления популяций жуков в естественно зараженных сосновых лесах.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании жуки были собраны в пяти географических регионах южного Китая (Хучжоу/Чжэцзян, Ляншань/Сычуань, Сямынь/Фуцзянь, Шаогуань/Гуандун, Юйлинь/Гуанси). Расстановка ловушек сверху вниз сле....
- Собираем сосны жуков-пилильщиков М. альтернативы с использованием коммерческих ловушек (см. Таблицу материалов) с приманкой аттрактантами до прогнозируемых периодов появления популяций жуков в естественно зараженных сосновых лесах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выделение и идентификация грибковых изолятов из M. Альтернатус
С помощью ловушек-аттрактантов было выведено большое количество (всего около 500 жуков) М. Alternatus были собраны из пяти географических регионов. Были отобраны трупы жуков с типичными симптомами заражения энтомопатогенными грибами; Затем покровы тела каждого жука были рассечены на несколько положений, как описано в протокольном шаге 1.3. В результате было выделено более 600 грибковых изолятов из разны.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Различные географические популяции FWB могут по-разному взаимодействовать с природными энтомопатогенными грибами, что обусловлено долгосрочной адаптацией видов EPF к местным климатическим факторам и специфической генотипической популяцией насекомого-хозяина44,45. Расширение участков отбора проб на множественные регионы встречаемости насекомых помогает увеличить возможность приобретения различных штаммов или видов EPF от их естест.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFC2600100) и Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY21C040001).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл, 2 мл центрифужные пробирки | Biosharp | BS-15-M | |
| 10 & микро; L наконечники для пипеток | Sangon Biotech | F601216 | |
| 10 & микро; L, 20 и микро; L, 100 & микро; L, 200 & микро; L, 1,000 &; L пипетки | Rainin | ||
| 1,000 &; L наконечники для пипеток | Sangon Biotech | F630102 | |
| 2 мл криогенные флаконы | Corning | 430659 | |
| 20x PBS буфер | Sangon Biotech | B548117-0500 | |
| 200 &; L наконечники для пипеток | Sangon Biotech | F601227 | |
| 2,000.н. производитель | TaKaRar | SD0531 | |
| 50 мл пробирки | Nest | 602052 | |
| 50% раствор глутаральдегида | Sangon Biotech | G916054 | |
| 50x TAE буфер | Sangon Biotech | B548101 | |
| 6x загрузочный буфер | TaKaRar | SD0503 | |
| Агароза | Сангон Биотех | A610013 | |
| Безводный этанол | JkХимический | LB10V37 | |
| Биохимический кабинет для выращивания | Shanghaiyiheng | LRH-250F | |
| Хлороформ | Juhua | 61553 | |
| Коммерческие ловушки для жуков | FEIMENGDI | BF-8 | www.yinyouji.com |
| Гелевый имиджер | Bio-Rad | GelDoc XR+ | |
| Глицерин | Sangon Biotech | A600232 | |
| Высокоскоростная рефрижераторная центрифуга | Sigma | D-37520 | |
| Паровая стерилизация под высоким давлением | Mettler Toledo | JA5003 | |
| Изопропиловый спирт | Общий реагент | G75885B | |
| Краситель нуклеиновой кислоты | Sangon Biotech | A616696 | |
| Оптический микроскоп, OM | Leica | DM2000 | |
| Parafilm Parafilm | PM996 | ||
| PCR метр | Heal Force | Trident960 | |
| Пенициллин G | Marklin | GB15743 | |
| Картофельный декстроза агар, PDA | Oxoid | CM0139 | |
| Картофельный бульон декстрозы, PDB | Solarbio | P9240 | |
| Праймеры | Sangon Biotech | / | |
| Primers Taq | TaKaRar | RR902A | |
| Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit | Sangon Biotech | B518229 | |
| Сканирующий электронный микроскоп, SEM | Hitachi | S-3400N | |
| Стрептомицин | Марклин | S6153 | |
| Тетрациклин | Марклин | T829835 | |
| Tween-80 | Marklin | T6336 | |
| Вакуумная сублимационная сушилка | Yamato | DC801 | |
| Вихревой шейкер | HLD | WH-861 | |
| β-Меркаптоэтанол | Marklin | M6230 |
Ссылки
- Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
- Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-t....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
