Method Article

Выделение, поведенческая идентификация и оценка патогенности энтомопатогенных грибов из лесного древоточца

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол получения энтомопатогенных грибов от лесного древоточца и заместительный способ оценки их энтомопатогенной активности с помощью модельного насекомого Coleopteran. Этот метод эффективен и удобен для изучения энтомопатогенных грибных ресурсов от насекомых-вредителей древоточения в естественных лесах.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лесные древоточцы (FWB) наносят серьезный ущерб древесине и наносят экономический ущерб во всем мире. Выделение энтомопатогенных грибов (ЭПФ) в период появления ДСБ считается приемлемой альтернативой химическому контролю. Тем не менее, ресурсы EPF были значительно менее изучены для FWB, в отличие от сельскохозяйственных насекомых-вредителей. В данной статье представлен протокол исследования ресурсов EPF из FWB на примере диких популяций Monochamus alternatus . В этом протоколе назначаются ловушки с приманкой с М. Аттрактанты Alternatus для различных популяций гарантировали сбор адекватных образцов с естественными симптомами инфекции в периоды появления жука. После тонкого препарирования покровов и помещения их в селективную среду виды грибов были выделены из каждой части тел жуков и идентифицированы на основе как молекулярных, так и морфологических признаков.

Несколько видов грибов были сертифицированы как паразитические EPF путем повторного заражения здоровых M. alternatus споровыми суспензиями. Их поведенческие фенотипы на M. alternatus наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии и в дальнейшем сравнивали с таковыми на модельном насекомом Tribolium castaneum. Для EPF, которые демонстрируют устойчивые фенотипы паразитизма на обоих видах жуков, оценка их активности на T. Castaneum предоставил ценную информацию о летальности для будущих исследований M. alternatus. Этот протокол помог обнаружить недавно зарегистрированный EPF в популяциях M. alternatus в Китае, который может быть применен в качестве эффективного подхода для изучения большего количества ресурсов EPF из других FWB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опустошение, вызванное насекомыми-вредителями, привело к большим экологическим и экономическим потерям как в лесных, так и в сельскохозяйственных экосистемах. Большинство сельскохозяйственных вредителей подвергают себя воздействию естественных врагов или искусственных агентов контроля, повреждая растения-хозяева. Вместо этого лесные древоточцы (FWB) почти полностью завершают свои циклы развития внутри стволов деревьев-хозяев1, что создает большие проблемы для изучения эффективных организмов биоконтроля из FWB в дикой природе. Что еще хуже, так это то, что ДББ являются носителями большого количества фитопатогенов2 или имеют тесную связь с этими патогенами в качестве своих потенциальных переносчиков3,4, что значительно усиливает негативное воздействие ДСБ на здоровье лесов. Чрезмерное использование химических инсектицидов может облегчить тяжесть FWB, но появление устойчивости к инсектицидам 5,6 ограничивает их применение в окружающей среде. В некоторых случаях паразитоиды насекомых, хищные членистоногие, а также энтомопатогенные микробы были выпущены в качестве агентов биоконтроля в районы распространения FWB7 и оказались эффективными и экономически приемлемыми альтернативами химическому контролю 8,9,10.

Считается, что энтомопатогенные грибы (EPF) имеют преимущество в контроле FWB по сравнению с большинством других микробных групп. Их споры могут переноситься насекомыми-хозяевами и устойчиво закрепляться на поверхностях тела путем проникновения в кутикулу или покров 8,11. EPF также обладают отличной приспособляемостью к стрессам окружающей среды, а некоторые виды хорошо колонизируются в тканях деревьев в качестве эндофитов12,13, способствуя их росту, выживанию и передаче. Однако, по сравнению с сельскохозяйственными отраслями, видовое разнообразие EPF, используемое в естественных лесных экосистемах, значительно ограничено 14,15,16. Beauveria bassiana (штамм PPRI 5339) была признана наиболее перспективным штаммом для продвижения программы IPM для эвкалиптовых долгоносиков в Южной Африке17 и комбинации двух перспективных изолятов B. Бассиана предоставила возможность для практического микробного контроля над красным пальмовым долгоносиком, Rhynchophorus ferrugineus, на различных стадиях жизни на пальмовых полях18. В дополнение к Beauveria и хорошо известному Metarhizium, другие роды EPF порядка Hypocreales, особенно виды Lecanicillium (многие из которых в настоящее время классифицируются в род Akanthomyces19,20), показали сильную патогенность и высокий потенциал в борьбе с лесными вредителями, такими как кипарисовая тля в Чили21.

Сосновый жук-пилильщик Monochamus alternatus является печально известным вредителем сосновых лесов в Китае и соседних странах, который зарывается в ветви и стволы сосен, чтобы затруднить транспортировку питательных веществ и воды 22,23,24. Более того, М. alternatus также способствует инвазии растительно-паразитической древесной нематоды (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) в качестве основного жука-переносчика. Другой родственный вид жука, M. galloprovincialis, распространил PWN в нескольких странах Европы в последние25 лет. В предыдущих исследованиях сообщалось о нескольких родах природных EPF от Monochamus spp., таких как Beauveria, Metarhizium и Lecanicillium (Verticillium, даже прежнее название Lecanicillium), в Испании, Японии и провинциях Аньхой/Чжэцзян в Китае 26,27,28,29. Тем не менее, эти коллекции EPF, по-видимому, обычно ограничены в определенном месте, по сравнению с широким распространением жуков-монохамусов на естественных полях. Поскольку жук M. alternatus имеет широкое географическое распространение в Китае, его можно рассматривать как типичного древоточца для изучения большего количества потенциальных EPF в различных популяциях.

В настоящем протоколе мы вводим специальную процедуру, исследующую EPF из нескольких географических популяций M. alternatus в южном Китае. В этом протоколе в качестве заменителя используется модельный жесткокрылый жук для проведения анализов энтомопатогенности, при условии, что тестируемый вид грибов имеет устойчивый поведенческий фенотип у обоих видов жуков. Этот протокол также может дать представление об исследовании EPF для других лесных древоточцев, в которых разнообразие их энтомопатогенных видов грибов недооценивается или менее изучено.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение грибов из M. alternatus (рис. 1)

  1. Соберите образец жука
    1. Собираем сосны жуков-пилильщиков М. альтернативы с использованием коммерческих ловушек (см. Таблицу материалов) с приманкой аттрактантами до прогнозируемых периодов появления популяций жуков в естественно зараженных сосновых лесах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании жуки были собраны в пяти географических регионах южного Китая (Хучжоу/Чжэцзян, Ляншань/Сычуань, Сямынь/Фуцзянь, Шаогуань/Гуандун, Юйлинь/Гуанси). Расстановка ловушек сверху вниз следующая: круглый верх (50 см в диаметре), крестообразная панель (35 см в ширину и 66 см в длину), воронка (35,5 см в верхней круглой части и 5,5 см в нижней круглой форме), сборная чашка (10,5 см в диаметре и 26,5 см в длину). В качестве приманки30 используют летучие вещества хозяина (например, этанол и α-пинен) и феромон агрегации (2-ундецилокси-1-этанол).
    2. Промаркируйте образец перед передачей в лабораторию. Поместите каждого жука в индивидуальные стерилизованные трубочки со свежими веточками. Заменяйте веточки на свежие каждые 2 дня.
    3. Выращивайте живых жуков при температуре 25 ± 1 °C в неувлажненном инкубаторе (циклы 16-8 L/D) и наблюдайте за ними ежедневно.
    4. Записывайте образцы, показывающие снижение кормления и подвижности. Перенос мертвого М. Альтернатусы , которые становятся затвердевшими и жесткими, влажными камерами для наблюдения за ростом грибкового мицелия и конидий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После заражения энтомопатогенными грибами у жуков наблюдалось снижение питания и подвижности на начальной стадии инфекции31,32. После смерти их тела стали затвердевшими и окоченевшими, а мицелий и конидии появились через несколько дней после хранения во влажной камере.
    5. Храните трупы жуков с грибковыми инфекциями при температуре 4 °C для дальнейшего использования. Чтобы следовать этому протоколу, обработайте образцы немедленно в течение нескольких часов, чтобы избежать загрязнения более сапротрофными грибами.
  2. Приготовление питательной среды
    1. Добавьте 39 г порошка картофельного декстрозы агара (КПК) в 1 л чистой воды и автоклавируйте в течение 30 минут при температуре 121 °C.
    2. Охладите до рабочей температуры (~50 °C), добавьте 0,05 г стрептомицина, 0,05 г пенициллина G и 0,05 г тетрациклина и встряхните, чтобы распределить среду.
    3. Налейте среду в чашки Петри под чистую скамейку и используйте после застывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда PDA с антибиотиками используется для изоляции от жуков, что предотвращает рост бактерий, не влияя на рост грибков во время изоляции. Тем не менее, среда ОАП без антибиотиков используется для ежедневного выращивания и консервации.
    4. Добавьте 35 г порошка картофельного бульона декстрозы (PDB) в 1 л ddH2O и автоклавируйте в течение 30 минут при температуре 121 °C. Охладите его для использования.
  3. Вскрытие образца жука при симптомах грибковой инфекции
    1. Подготовьте стерилизованные ножницы, скальпели и булавки от насекомых; Затем поработайте под чистой скамейкой со спиртовой горелкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование инструментов для препарирования может быть отрегулировано в соответствии с личными предпочтениями. Булавки для насекомых острее, чем стандартные иглы для препарирования, и различные спецификации могут удовлетворить потребность в препарировании.
    2. Препарируйте покровы тела жука инструментами в стерильных и одноразовых чашках Петри. Будьте осторожны, чтобы избежать возможного повреждения тканей средней и задней кишки, которые могут выделять внутреннее содержимое.
    3. Разделите тела жуков на основные положения следующим образом: усики, голова, грудная клетка, брюшко, крылья (у каждой пары) и ноги.
  4. Очищение от грибков
    1. Разрежьте ножницами покровы каждого положения на небольшие кусочки. Аккуратно прижмите наружную поверхность к поверхности пластин ОАП с антибиотиками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что грибковый мицелий на покровах привит к пластине.
    2. Тщательно запечатать парапленкой и культивировать в инкубаторе при температуре 25 ± 1 °C до тех пор, пока ткани полностью не покроются мицелием.
    3. Перенесите единичные колонии по фенотипическим свойствам (цвет, форма) на новый ОАП с антибиотиками для культивирования при температуре 25 ± 1 °С.
    4. Повторите шаг 1.4.3 два или три раза для ОАП с антибиотиками до тех пор, пока чистые колонии не будут выделены отдельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в исходных пластинах растет несколько штаммов грибов, выберите мицелий точно, чтобы облегчить сортировку большего количества видов грибов.
  5. Хранение грибковых изолятов
    1. Перенос агаровых блоков (~5 мм в диаметре) из колоний на новые пластины PDA.
    2. Выращивание в инкубаторе при температуре 25 ± 1 °C в течение 1-2 недель.
    3. Поместите в холодильник при температуре 4 °C для ежедневного хранения для дальнейшего использования.
    4. Инокулируйте штаммы грибков в 50 мл стерильного PDB в колбу объемом 250 мл, встряхивая со скоростью 180 об/мин при 25 °C в течение 5-7 дней.
    5. Соберите 1 мл свежевыращенного грибного мицелия и суспензируйте его в 1 мл стерилизованного 20% глицерина в стерильных морозильных пробирках объемом 2 мл (конечная концентрация глицерина составляет 10%).
    6. Запечатайте пробирки парапленкой и предварительно охладите их при температуре -20 °C и -40 °C. Затем поддерживайте пробирки при температуре -80 °C в качестве запасов.

2. Молекулярная и морфологическая идентификация грибковых изолятов

  1. Экстракция геномной ДНК грибов
    1. Культивируйте грибы в PDB, как описано в пункте 1.5.4.
    2. Соберите мицелий и отфильтруйте его, чтобы отделить от PDB. Гомогенизируйте в жидком азоте с помощью предварительно охлажденной ступки и пестика.
    3. Извлеките геномную ДНК с помощью набора для выделения геномной ДНК Fungi в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК
    1. Смесь для ПЦР готовят следующим образом: 25 мкл Taq ДНК-полимеразы, 1 мкл матрицы, 2 мкл прямых и обратных праймеров и ddH2O до общего объема 50 мкл.
    2. Амплифицируют участок рДНК-ИТС образца ДНК с помощью пар праймеров ITS1 и ITS434 (см. таблицу 1) по следующей методике: начальная денатурация при 95 °C в течение 4 мин, затем 35 циклов денатурации при 94 °C в течение 60 с, отжиг при 58 °C в течение 60 с, удлинение при 72 °C в течение 2 мин, и окончательное удлинение при 72 °C в течение 10 минут.
    3. Электрофорез амплифицированных продуктов с использованием 1,5% агарозного геля при 100 В, 100 мА.
    4. Секвенирование ПЦР.
    5. Выровняйте последовательность с помощью Clustal X2.0 и MEGA 6.0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время выравнивания последовательностей сайты с неоднозначным выравниванием исключаются, а пробелы рассматриваются как отсутствующие данные.
    6. Сравните полученную последовательность с последовательностями в базе данных последовательностей ITS в GenBank с помощью BLAST на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Предварительно определите информацию о виде штамма гриба.
  3. Морфологическая идентификация
    1. Используйте камеру, чтобы запечатлеть морфологию зрелой чистой колонии гриба как на лицей, так и на обратной стороне пластин PDA.
    2. Выщипывают конидии из чистой культуры колонии грибов с помощью инокуляционной иглы и переносят их на предметное стекло с каплей стерильной воды.
    3. Удерживая покровное стекло, медленно опустите его под углом ~45°, чтобы покровное стекло могло покрыть образец без пузырей.
    4. Скальпелем срезать блок агара толщиной5 мм 2 мм от колоний гриба по краю грибковой колонии, и перенести его на чистое предметное стекло с каплей стерильной воды. Осторожно разберите грибы тонкой иглой, чтобы увидеть конкретные структуры.
    5. Повторите шаг 2.3.3.
    6. Наблюдайте за бесполой формой грибов под оптическим микроскопом (ОМ), включая форму, прозрачность и положение гиф, конидиофоров, фиалидов и конидий. Запишите и измерьте форму и размер бесполых признаков, чтобы отличить различные грибковые изоляты друг от друга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимального наблюдения за грибковыми структурами используйте морилки и монтажный материал35.

3. Индукция симптомов грибковой инфекции у M. alternatus для наблюдения за их поведенческими фенотипами

  1. Приготовление конидиальной суспензии
    1. Приготовьте 0,01% Tween-80 с чистой водой и автоклавируйте в течение 25 минут при температуре 121 °C. Используйте после остывания.
    2. Добавьте соответствующее количество стерильных мелких стеклянных шариков и 0,01% раствор Tween-80 в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
    3. Соскребите колонии грибков в пробирку и достаточно встряхните ее вихревым шейкером, пока колония не разобьется. Процедите через два слоя марли, чтобы удалить грибницу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание производится для обеспечения суспензии конидиоспор в 0,01% растворе Tween-80.
    4. Подсчитайте количество спор под ОМ с помощью гемоцитометра, отрегулируйте до 1 ×10 8 конидиал/мл с помощью стерильного 0,01% Tween-80 и держите при 4 °C для использования.
  2. Подготовка жуков
    1. Автоклавируйте сосновые веточки (примерно одинакового размера) и просушите в духовке (~60 °C).
    2. Храните собранный в полевых условиях М. альтернатус взрослых особей с сосновыми веточками в инкубаторе при 25 ± 1 °С.
    3. Заморочьте жуков на 24 часа и простерилизуйте поверхность жуков с помощью отбеливателя, этанола и дистиллированной воды [10:10:80 (v:v)] перед использованием.
  3. Индукция грибковой инфекции
    1. Поработайте под чистой скамейкой, погрузите сосновые веточки в конидиальную суспензию на 10 с, и высушите их на воздухе.
    2. Опустите жуков в конидиальную суспензию на 10 с, затем переложите в стерильные пробирки объемом 50 мл (по одному жуку и одной веточкой на пробирку). Заменяйте веточки на новые каждые 2 дня.
    3. Для отрицательного контроля замените конидиальную суспензию на только стерильный 0,01% раствор Твин-80. Сделайте по пять повторений для каждого штамма гриба и контрольной группы.
    4. Оценивайте активность жуков на основе количества отруба, образующегося на сосновых ветках. Когда кормление прекратится, считайте их мертвыми.
    5. Переложите мертвых жуков в новые стерильные пробирки объемом 50 мл и поместите кусок стерильной влажной ваты. Инкубировать при температуре 25 ± 1 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Влажный хлопок используется для поддержания влажности, так как для роста грибков требуется соответствующая влага, но не слишком много.
    6. Наблюдайте и фотографируйте изменение поверхности жука в одно и то же время каждый день.
  4. Повторная изоляция и подтверждение видов грибов
    1. До тех пор, пока на поверхности жуков не появятся явные фенотипы грибковой инфекции, соберите мицелий из разных тканей по отдельности в новые пластины ОАП.
    2. Культивируйте при температуре 25 ± 1 °C и наблюдайте, чтобы убедиться, что морфология соответствует морфологии инокулированных грибов.
  5. Лечение модельного жука
    1. Повторите шаги 3.2.1-3.3.6 на модели жука Tribolium castaneum, используя в пищу пшеничные отруби, и простерилизуйте пшеничные отруби с помощью ультрафиолета.
    2. Слегка прикоснитесь к жукам стерильным пинцетом. Предположите, что они мертвы, если ответа нет.

4. Подтвердить заражение фенотипами грибов на M. alternatus и модельного жука

  1. Подготовка образца к наблюдению
    1. Препарируйте зараженную М. Alternatus трупы осторожно, как в шаге 1.3.
    2. Выберите Т. Тела Castaneum с явными симптомами грибковой инфекции.
    3. Вырежьте дисковые пробки диаметром 5 мм четырех зрелых колоний грибов, растущих на КПК.
  2. Предварительная обработка образца
    1. Поместите пробки, инфицированные ткани и тела жуков в предварительно охлажденный 2,5% глутаральдегид при температуре 4 °C на 2 дня.
    2. Промывайте образцы трижды в 0,1% фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) в течение 5 минут и обезвоживайте в 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% этаноле в течение 10 минут.
    3. Высушите образцы в вакуумной сублимационной сушилке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс предварительной обработки должен быть тщательным, включая резку, замачивание, обезвоживание, промывку и сушку, чтобы предотвратить повреждение образца.
  3. Наблюдение с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
    1. Покройте предварительно обработанные образцы платиной с помощью распылительной установки для нанесения покрытий и наблюдайте под сканирующим электронным микроскопом36.
    2. Запишите морфологические характеристики гиф и конидий, растущих на PDA, M. тканей alternatus и модельных тел жуков.
    3. Сравните, согласуются ли результаты с результатами при использовании ОМ на шаге 2.3.

5. Оценка энтомопатогенной активности

  1. Приготовление конидиальной суспензии
    1. Приготовление конидиальной суспензии происходит так же, как и на этапах 3.1.1-3.1.4.
  2. Предварительная обработка модельного жука
    1. Выращивайте, кормите, стерилизуйте и морите голодом. Кастанеум как на шаге 3.5.1.
    2. Стерилизуйте пшеничные отруби с помощью ультрафиолета и поместите поровну веса в стерильные чашки Петри.
  3. Тест на энтомопатогенную активность
    1. Обработайте пшеничные отруби конидиальной суспензией и просушите их на воздухе под чистой скамейкой при комнатной температуре.
    2. Погружение Т. Жуков кастаньона в конидиальную суспензию в течение 10 с и переносят их в чашку Петри (n = 20 в каждой чашке Петри). Заменяйте новые пшеничные отруби такой же обработкой конидиалом каждые 4 дня.
    3. Для отрицательного контроля применяйте только стерильный 0,01% раствор Твин-80.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отложите не менее трех повторений для каждой группы лечения и контрольной группы.
    4. Ежедневно подсчитывайте мертвых жуков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слегка прикоснитесь к жукам стерильным пинцетом. Предположите, что они мертвы, если реакция отсутствует.
  4. Мультигенный филогенетический анализ
    1. Извлеките энтомопатогенную грибковую геномную ДНК, как описано в шаге 2.1.
      Примечание: Проводится мультигенная идентификация паразитических EPF, которые демонстрируют значимые фенотипы инфекции и сильную энтомопатогенную активность против модельного жука.
    2. Амплифицируйте следующие гены, в том числе участок, охватывающий ядерный рибосомальный ген SSU34, сегмент гена большой субъединицы рРНК (LSU37,38), часть гена фактора элонгации 1-альфа (tef-1α39), вторую по величине субъединичную последовательность РНК-полимеразы ІІ (rpb240) и часть β-тубулина41 с использованием праймерных пар NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R и TUB1/TUB22 (см. таблицу 1) соответственно.
      1. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР, как описано на шаге 2.2.1.
      2. Амплификацию проводят следующим образом: начальная денатурация при 95 °С в течение 4 мин, затем 35 циклов (tef-1α, rpb2, SSU), 38 циклов (LSU) или 39 циклов (β-тубулин) денатурации при 94 °C в течение 60 с, отжиг при 47 °C в течение 60 с (LSU), 55 °C в течение 60 с (tef-1α), 54 °C в течение 40 с (β-тубулин) и 50 °C в течение 30 с (rpb2, SSU), удлинение при 72 °C в течение 1 мин и окончательное удлинение при 72 °C в течение 10 мин.
    3. Выполните последовательность и выравнивание, выполнив те же действия, что и в шагах 2.2.4-2.2.5.
    4. Выполните филогенетический анализ с помощью MEGA 6.0 на основе метода максимального правдоподобия (ML)42.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение и идентификация грибковых изолятов из M. Альтернатус
С помощью ловушек-аттрактантов было выведено большое количество (всего около 500 жуков) М. Alternatus были собраны из пяти географических регионов. Были отобраны трупы жуков с типичными симптомами заражения энтомопатогенными грибами; Затем покровы тела каждого жука были рассечены на несколько положений, как описано в протокольном шаге 1.3. В результате было выделено более 600 грибковых изолятов из разны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные географические популяции FWB могут по-разному взаимодействовать с природными энтомопатогенными грибами, что обусловлено долгосрочной адаптацией видов EPF к местным климатическим факторам и специфической генотипической популяцией насекомого-хозяина44,45. Расширение участков отбора проб на множественные регионы встречаемости насекомых помогает увеличить возможность приобретения различных штаммов или видов EPF от их естест...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFC2600100) и Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY21C040001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл, 2 мл центрифужные пробиркиBiosharpBS-15-M
10 & микро; L наконечники для пипетокSangon BiotechF601216
10 & микро; L, 20 и микро; L, 100 & микро; L, 200 & микро; L, 1,000 &; L пипеткиRainin
1,000 &; L наконечники для пипетокSangon BiotechF630102
2 мл криогенные флаконыCorning430659
20x PBS буферSangon BiotechB548117-0500
200 &; L наконечники для пипетокSangon BiotechF601227
2,000.н. производительTaKaRarSD0531
50 мл пробиркиNest602052
50% раствор глутаральдегидаSangon BiotechG916054
50x TAE буферSangon BiotechB548101
6x загрузочный буферTaKaRarSD0503
АгарозаСангон БиотехA610013
Безводный этанолJkХимическийLB10V37
Биохимический кабинет для выращиванияShanghaiyihengLRH-250F
ХлороформJuhua61553
Коммерческие ловушки для жуковFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Гелевый имиджерBio-RadGelDoc XR+
ГлицеринSangon BiotechA600232
Высокоскоростная рефрижераторная центрифугаSigmaD-37520
Паровая стерилизация под высоким давлениемMettler ToledoJA5003
Изопропиловый спиртОбщий реагентG75885B
Краситель нуклеиновой кислотыSangon BiotechA616696
Оптический микроскоп, OMLeicaDM2000
Parafilm ParafilmPM996
PCR метрHeal ForceTrident960
Пенициллин GMarklinGB15743
Картофельный декстроза агар, PDAOxoidCM0139
Картофельный бульон декстрозы, PDBSolarbioP9240
ПраймерыSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Сканирующий электронный микроскоп, SEMHitachiS-3400N
СтрептомицинМарклинS6153
ТетрациклинМарклинT829835
Tween-80MarklinT6336
Вакуумная сублимационная сушилкаYamatoDC801
Вихревой шейкерHLDWH-861
β-МеркаптоэтанолMarklinM6230

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles