Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Комплексный подход к анализу клеточных компонентов церебральных тромбов

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65791

⸱

21 июля 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Emergency Department, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Haematology, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 4Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании описывается быстрый и эффективный метод анализа клеточных компонентов церебральных тромбов путем растворения сгустка, окрашивания клеток и рутинного исследования крови.

Аннотация

Церебральный тромбоз, тромб в мозговой артерии или вене, является наиболее распространенным типом инфаркта головного мозга. Исследование клеточных компонентов церебральных тромбов важно для диагностики, лечения и прогноза. Однако современные подходы к изучению клеточных компонентов сгустков в основном основаны на окрашивании in situ , которое не подходит для комплексного изучения клеточных компонентов, так как клетки плотно завернуты в сгустки. Предыдущие исследования успешно выделили фибринолитический фермент (sFE) из Sipunculus nudus, который может разрушать сшитый фибрин напрямую, высвобождая клеточные компоненты. В данном исследовании был создан комплексный метод изучения клеточных компонентов церебрального тромба на основе sFE. Этот протокол включает в себя растворение сгустка, высвобождение клеток, окрашивание клеток и рутинный анализ крови. Согласно этому методу, компоненты клетки могут быть изучены количественно и качественно. Приведены репрезентативные результаты экспериментов с использованием данного метода.

Введение

Цереброваскулярная болезнь является одним из трех основных заболеваний, которые могут угрожать здоровью человека, среди которых более 80% приходится на ишемическую цереброваскулярную болезнь. Церебральный тромбоз и тромбоз церебральных вен являются наиболее распространенными ишемическими цереброваскулярными заболеваниями на сегодняшний день, в основном вызываемыми церебральными тромбами 1,2. Если лечение не проводится должным образом, оно будет иметь высокие показатели инвалидности и смертности, а также высокую частоту рецидивовпосле выписки.

В последнее время все большее число исследований показало, что клеточные компоненты церебральных тромбов тесно коррелируют с диагностикой, лечением и прогнозом церебрального тромбоза 4,5,6. Поэтому наличие данных о составе тромба, особенно клеточных компонентов, имеет важное значение для клинической диагностики и лечения. К сожалению, имеющиеся в настоящее время методы не могут всесторонне проанализировать компонент тромба количественно и качественно. Например, окрашивание на основе Martius Scarlett Blue in situ позволяет исследовать только красные/белые кровяные тельца определенных срезов сгустка7. Окрашивание in situ на основе иммуногистохимии (ИГХ) позволяет изучать только ограниченные компоненты крови определенных срезов тромба с использованием их антител8. Методы, основанные на микроскопических изображениях, касаются только специфической структуры сгустка9. Более того, все эти способы трудоемки и отнимают много времени10. На сегодняшний день о процедурах количественного и качественного исследования церебральных тромбальных клеточных компонентов не сообщается. Широко признано, что сшитый фибрин плотно обволакивает клетки крови в сгустки11. Следовательно, специфическая деградация сшитого фибрина и высвобождение интактных клеток имеет решающее значение для точного анализа клеточных компонентов.

Предыдущие работы выделили фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE), который может специфически и быстро расщеплять фибрин12. В работе предложен метод анализа клеточных компонентов церебральных тромбов, основанный на уникальной активности sFE. В этом протоколе сначала использовали sFE для разрушения фибрина сгустков, а затем анализировали клеточные компоненты с помощью окрашивания по методу Райта и рутинного анализа крови13,14. Согласно этому методу, клеточные компоненты церебральных тромбов могут быть количественно и качественно изучены. Этот простой и эффективный протокол может быть применен для анализа клеточных компонентов других тромбов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование выполнено в соответствии с руководящими принципами Комитета по медицинской этике Университета Хуацяо. Тромбы головного мозга были удалены хирургическим путем и собраны в Первой больнице Цюаньчжоу, филиале Фуцзяньского медицинского университета, с информированного согласия пациентов.

1. Предварительная обработка сгустков крови

  1. Поместите сгустки на чистую посуду, добавьте пинцетом 5 мл физиологического раствора, аккуратно встряхните посуду и удалите физиологический раствор пипеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите полоскание три раза.
  2. Разрежьте сгустки на более мелкие кусочки (размером менее 5 мм x 5 мм x 5 мм) ножницами. Добавьте 5 мл физиологического раствора, аккуратно встряхните посуду и удалите физиологический раствор пипеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите полоскание три раза. Следите за тем, чтобы во время полоскания не отсасывались сгустки.
  3. Перенесите сгустки на другую чистую U-образную пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь (хранить пластину при температуре 2-8 °C) и возобновить позже.

2. Тромболизис

  1. Готовят рабочий раствор sFE, доводя концентрацию sFE до 2000 Ед/мл физиологическим раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: sFE был подготовлен в соответствии с хорошо зарекомендовавшими себя протоколами Tang Lab15.
  2. Добавьте 300 мкл рабочего раствора sFE в предварительно обработанные сгустки.
  3. Выполните первый раунд деградации.
    1. Инкубируют смесь sFE и сгустков при 37 °C в течение 0,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блоттинг, обработанный физиологическим раствором, был установлен в качестве отрицательного контроля. Не вращайте образец на шейкере.
    2. Аккуратно перемешайте пробу. Переложите жидкую часть в другую чистую пробирку с чистой пипеткой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся сгустки были использованы для еще одного раунда разложения.
    3. Центрифугируют жидкую часть при 200 × г в течение 5 мин при 4 °С.
    4. Переложите надосадочную жидкость в другую чистую пробирку с помощью пипетки, чтобы получить восстановленный раствор sFE.
    5. Осторожно смешайте клеточный осадок с 50 мкл физиологического раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная смесь хранилась при температуре 2-8 °C для последующего использования.
  4. Выполните последующую деградацию.
    1. Разлагают оставшиеся сгустки (этап 2.3.2) восстановленным раствором sFE (этап 2.3.4) при 37 °C в течение 0,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные этапы были такими же, как и в первом раунде деградации. Процесс разложения завершался до тех пор, пока не разлагались все сгустки.
  5. Выполните сбор клеток.
    1. Подготовьте образец клеток крови, собрав клеточную смесь каждого раунда деградации.

3. Окрашивание Райта

  1. Выполняют мазок из клеток.
    1. Доведите клетки до плотности 1 x 106 клеток/мл.
    2. Добавьте 5 мкл клеток на предметное стекло с поли-L лизиновым покрытием, затем намажьте их с помощью покровного стекла.
    3. Выпарите жидкость комнатной температуры.
  2. Выполните окрашивание.
    1. Аккуратно добавьте 200 мкл красителя Райта (см. таблицу материалов) в клеточный мазок и добавьте 600 мкл красителя Райта B для равномерного смешивания.  Окрашивать в течение 10 минут при комнатной температуре.
    2. Аккуратно смойте краситель чистой водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенный клеточный мазок можно хранить при комнатной температуре для последующего использования.
  3. Выполните микроскопическую визуализацию.
    1. Осмотрите окрашенные клетки с помощью светового микроскопа (см. Таблицу материалов).

4. Плановое исследование крови

  1. Доведите клетки до плотности 1 x 106 клеток/мл.
  2. Анализ клеточных компонентов, таких как тромбоциты, эритроциты, лейкоциты, лимфоциты, нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, базофилы и незрелые гранулоциты, с помощью аутогематологического анализатора в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На начальном этапе процесса деградации было установлено, что тромбы имели красную компактную структуру, а рабочий раствор был бесцветным. После инкубации в течение 30 мин рабочий раствор становился светло-красным, что указывало на то, что скрещенные клетки крови были высвобождены в рабочий раствор. Большинство сгустков растворялось при удлинении времени инкубации до 5 ч, а рабочий раствор становился светло-красным. Напротив, даже после 10-часовой инкубации не было выявлено существенных изменений в физиологической группе ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

sFE является фибринолитическим агентом, который может непосредственно и эффективно разрушать фибрин12,16. Здесь sFE использовали для разрушения сшитого фибрина церебральных тромбов, высвобождения заключенных клеток внутри сгустков и качественного и количественного анализа клеточных компонентов сгустков. Данные микроскопии и рутинного исследования крови показали, что заключенные клетки были высвобождены из сгустков крови. Кроме того, типы клеток и структуры высвоб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование финансировалось Бюро науки и технологий города Сямынь (3502Z20227197) и Бюро науки и технологий провинции Фуцзянь (No 2019J01070, No 2021Y0027).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реакционная пластина для агглютинацииROTESTRTB-4003
Автоматический гематологический анализаторSYSMEXXNB2
Автоматический вертикальный паровой стерилизатор под давлением SANYOMLS-3750
(1,5 мл)BiosharpBS-15-M
Чистый стендAIRTECHBLB-1600
Инкубатор постоянной температурыJINGHONGJHS-400
Тарелка для культивирования (100 мм)
 SENXINDGG-9140AD
Электронные аналитические весыDENVERTP-213
Фильтрующая мембрана (0.22 &; m)Millex GPSLGP033NK
микроохлаждаемая центрифуга CenceH1650-W
Микроскоп СлайдыCITOGLAS01-30253-50
Milli-Q РеференсМиллипорZ00QSV0CN
Нормальный физиологический растворОптическийH37022337
Оптический микроскопNikonECLIPSE E100
ПарапленкаBemisPM-996
Фосфатно-солевой буферBeyotimeC0221A
Наконечник для пипетки (1 мл )AxygeneT-1000XT-C
Наконечник для пипетки (200 &; L)Пипетка AxygeneT-200XT-C
(1 мл)Пипетка Thermo Fisher ScientificZY18723
(200 &; L)Thermo Fisher ScientificZY20280
ScalpelMARTOR23111
Малогабаритный вихревой генераторKylin-BellVORTEX KB3
ПинцетHysticHKQS-180
Wright Раствор для окрашиванияBeyotimeC0135-500мл
Центрифужная трубка Нагревательно-сушильная печь серии DHG NEST 704001 микроскоп CISEN

Ссылки

  1. Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
  2. Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  3. Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
  4. Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
  5. Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  6. Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
  7. Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
  8. Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
  9. Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536(2021).
  10. Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
  11. C W Francis, a, Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
  12. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  13. Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254(2015).
  14. Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446(2023).
  15. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631(2023).
  16. Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
  17. Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
  18. Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Комплексный подход к анализу клеточных компонентов церебральных тромбов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.