Применение псевдовируса Ha-CoV-2 для быстрого количественного определения вариантов SARS-CoV-2 и нейтрализующих антител

По состоянию на май 2023 г. в настоящее время зарегистрировано более 766^{миллионов случаев} COVID-191. Несмотря на всемирные кампании вакцинации, SARS-CoV-2 постоянно циркулирует и заражает людей, в основном из-за появления новых вариантов, таких как «Дельта» (B.1.617.2) и «Омикрон» (B.1.1.529), которые вызывают новые волны инфекции ^2,3,4. Учитывая, что SARS-CoV-2 постоянно эволюционирует, важно разработать быстрые тесты, которые могут точно измерить заразность новых вариантов и эффективность нейтрализующих антител, индуцированных вакциной, против этих вариантов. Эти анализы необходимы для эпиднадзора за пандемией и для определения эффективности вакцин и их бустерных доз, специфичных для конкретных вариантов.

Из-за высокой контагиозности SARS-CoV-2 Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) требует, чтобы изучение SARS-CoV-2 и его вариантов проводилось^{в учреждениях уровня} биобезопасности (BSL) 3 ^5,6. Это требование BSL-3 ограничивает использование живых вирусов для количественной оценки заразности вариантов вируса и их нейтрализующих антител в обычных исследовательских и клинических лабораториях. Кроме того, традиционные анализы на нейтрализацию SARS-CoV-2, такие как анализы на основе бляшек или цитопатических эффектов с использованием репликационно-компетентных живых вирусов, отнимают много времени и требуют длительных инкубационных периодов⁷. Для количественной оценки эффективности нейтрализующих антител было разработано несколько псевдовирусов SARS-CoV-2 с псевдотипом спайкового (S) белка 8,9,10,11,12. В SARS-CoV-2 S-белок является основным белком, опосредующим проникновение вируса¹³, и основным антигеном, используемым в вакцинах против SARS-CoV-2 9,10,14,15,16. Псевдотипированные вирионы S-белка, такие как вирионы вируса везикулярного стоматита (VSV-G) или лентивируса, были использованы для количественного определения нейтрализующих антител 17,18,19. Тем не менее, псевдовирусу, основанному на лентивирусе, обычно требуется от 2 до 3 дней инфекции для количественной оценки репортерных сигналов. Псевдовирусные системы на основе VSV часто содержат остаточные вирусы VSV, что может привести к высокому уровню ложноположительных результатов и, как правило, требует^{24 ч заражения 20}.

Новая псевдовирусная система SARS-CoV-2, гибридный альфавирус-псевдовирус SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), была недавно разработана Hetrick et al¹². Ha-CoV-2 представляет собой новый инструмент для быстрой количественной оценки инфекционности вируса и чувствительности вируса к нейтрализующим антителам в обычных лабораториях BSL-2. Структурно Ha-CoV-2 напоминает вирионную частицу SARS-CoV-2, состоящую из структурных белков SARS-CoV-2, включая S-белок (S), мембрану (M), нуклеокапсид (N) и оболочку (E), и нет структурного белка у других вирусов. Кроме того, частица Ha-CoV-2 содержит быстро экспрессирующийся геном РНК альфавируса для быстрой репортерной экспрессии в клетках. Было показано, что Ha-CoV-2 быстро измеряет нейтрализующую активность антител в сыворотках вакцинированных и выздоравливающих лиц¹². Как показали Hetrick et al., при сравнении с псевдовирусом SARS-CoV-2 на основе лентивируса в анализе с течением времени, Ha-CoV-2 экспрессировал репортера Luc уже через 2-4 ч после заражения, в то время как лентивирус-псевдовирус экспрессировал Luc через 24 ч¹². Кроме того, потенциальное применение вариантов Ha-CoV-2 для количественного определения нейтрализующих антител дополнительно демонстрируется с использованием стандартного моноклонального нейтрализующего антитела 27BV (см. дополнительный рисунок 1)¹². В данной работе подробно описывается использование платформы Ha-CoV-2 для быстрой количественной оценки инфекционности вариантов SARS-CoV-2 на примере вариантов «Дельта» (B.1.617.2) и «Омикрон» (B.1.1.529). Кроме того, потенциальное применение вариантов Ha-CoV-2 для количественного определения нейтрализующих антител дополнительно демонстрируется с использованием стандартного моноклонального нейтрализующего антитела 27BV¹².

1. Сборка вирусов и вирусных частиц

1. Переносчики: Приобретите векторы экспрессии для SARS-CoV-2 M, E или N, а также SARS-CoV-2 S (дикого типа, Wt), Delta (B.1.617.2) и Omicron (B.1.1.529) на коммерческой основе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые последовательности векторов экспрессии приведены в Дополнительном файле 1. Поставщика этих векторов выражений также можно найти в таблице материалов.
2. Клетки и клеточная культура: Поддерживайте HEK293T клеток в модифицированной среде Eagle's Medium (DMEM) Dulbecco, содержащей 10% термически инактивированную эмбриональную бычью сыворотку (FBS), 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с клеточными культурами должны выполняться в шкафу биобезопасности с ламинарным воздушным потоком. Для трансфекции полиэтиленимина (PEI) обычно требуется 5-6 часов инкубации. Время начала необходимо тщательно продумать заранее.
3. Сборка вирусов и котрансфекция на основе PEI: Сборка частиц Ha-CoV-2 путем котрансфекции HEK293T клеток. Засевают клетки в чашку Петри с 10 см клеточной культуры (4-5 x 10,⁶ клеток в чашке) в 10 мл полной среды DMEM за день до котрансфекции. В этом исследовании три чашки Петри используются для посева клеток для сборки Ha-CoV-2 дикого типа, «Дельты» и «Омикрона» соответственно.
4. Чашки Петри инкубируют в течение ночи в инкубаторе_СО2 при температуре 37 °C. На следующее утро проверьте посуду, чтобы убедиться, что ячейки сливаются на 80%. Удалите всю среду и замените ее 9 мл среды, не содержащей сыворотки DMEM.
5. Для каждого блюда приготовьте смесь для котрансфекции с 2,5 мкг каждого из векторов экспрессии структурных белков SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 мкг pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (геном HaCoV2) и 2,5 мкг вектора экспрессии S-белка, вариантов Delta или Omicron S, и 45 мкл реагента для трансфекции на основе PEI. Дайте котрансфекционной смеси образовать комплексы, инкубируя в течение 13 мин (не инкубируйте дольше 30 мин).
6. После инкубации медленно добавляйте котрансфекционную смесь в каждую чашку Петри, капля за каплей. Поместите посуду в инкубатор CO₂ при температуре 37 °C на 6 ч. Через 6 ч удалите ДМЭМ без сыворотки и замените его полной средой ДМЭМ. Собирают вирус через 48-60 ч после котрансфекции.
7. Сбор и хранение вирусов: Сбор частиц через 48 ч после котрансфекции. Отделите клетки путем многократного пипетирования по поверхности монослоя и соберите клетки из каждой чашки, поместите в центрифужные пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут. Соберите надосадочную жидкость и пропустите ее через фильтр 0,22 мкМ. Храните псевдовирус Ha-CoV-2 при температуре -80 °C.

2. Анализ на вирусную заразность

1. Клетки и клеточная культура: Поддерживайте клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) в модифицированной среде Eagle's (DMEM) Dulbecco, содержащей 10% термоинактивированного FBS, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.
2. Посев клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2): За день до анализа на вирусную инфекционность высевают клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) в 96-луночный планшет в 50 мкл полной среды DMEM. Для каждой 96-луночной пластины засейте 2,5 x 10⁴ ячейки в каждую лунку, а всего для одной пластины необходимо 2,5 x 10⁶ ячеек. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор CO₂ при температуре 37 °C на ночь.
3. Инфекция HEK293T(ACE2/TMPRSS2): используйте частицы вариантов Ha-CoV-2 для заражения клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Утром в день заражения удалите 50 мкл DMEM из предварительно засеянной 96-луночной пластины. Замените носитель 50 мкл Ha-CoV-2 дикого типа, Delta или Omicron на 18 ч при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен здесь до тех пор, пока инфекция не достигнет 18 часов инкубации и планшет не будет готов к анализу с помощью люциферазного анализа. Успешность инфекции определяется методом люциферазы, полученным в результате экспрессии репортерного гена люциферазы в инфицированных клетках, поэтому чем больше сигнала вырабатывается, тем успешнее инфекция вариантом Ha-CoV-2.
4. Анализ люциферазы: После 18 ч инкубации добавьте 7,5 мкл буфера для лизиса клеток непосредственно в каждую лунку и перемешайте путем орбитального встряхивания в течение 2 мин. Лизируйте клетки в лизисном буфере не менее 5 мин при комнатной температуре.
5. Приготовьте раствор люциферазы Firefly, смешав раствор D-люциферина с раствором люциферазы Firefly в соотношении 1:50. Для получения целой 96-луночной планшетной пластины смешайте 3 мл раствора субстрата люциферазы с 60 мкл раствора D-люциферина с 2940 мкл буферного раствора люциферазы Firefly.
6. Добавьте 25 мкл раствора люциферазы Firefly к клеточным лизатам и перемешайте планшет орбитальным встряхиванием в течение 1 мин. Проанализируйте активность люциферазы с помощью коммерческого считывателя микропланшетов люциферазы.

3. РНК-экстракция Ha-CoV-2 и количественная ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-кПЦР)

1. Экстракция вирусной РНК: Извлеките вирусную РНК из частиц Ha-CoV-2 дикого типа и Ha-CoV-2 вариантов Delta и Omicron с помощью коммерческого набора для экстракции вирусной РНК в соответствии с инструкциями производителя. Выделенную вирусную РНК хранят при температуре -80 °C или сразу используют для ОТ-кПЦР.
2. ОТ-кПЦР: Проведите ОТ-кПЦР на вирусной РНК с использованием одноэтапной мастер-смеси. Проведите реакцию в коммерческом ПЦР-аппарате. Обратите внимание, что мишенью амплификации является геномная РНК Ha-CoV-2. Используйте векторную ДНК Ha-CoV-2 в качестве стандарта для создания стандартной кривой и вычисления числа копий РНК каждого варианта.

4. Анализ нейтрализующих антител

1. Посев клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2): За день до анализа высевают клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) в 96-луночный планшет в 50 мкл полной среды DMEM. Элементы HEK293T(ACE2/TMPRSS2) приобретаются в промышленных масштабах.
2. Для подсчета клеток берут 20 мкл клеток из колбы Т75, содержащей HEK293T(ACE2/TMPRSS2) клетки, и смешивают с 20 мкл раствора трипанового синего. Добавьте 20 мкл этой смеси в камеру для подсчета клеток и подсчитайте количество клеток в мл. Чтобы засеять 96-луночную пластину для заражения, используйте 2,5 х 10⁴ ячейки на лунку, а всего потребуется 2,5 х 10⁶ клеток. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор CO₂ при температуре 37 °C на ночь.
3. Анализ нейтрализующих антител: В стерильной полипропиленовой 96-луночной планшете приготовьте стандартную смесь нейтрализующих антител 27BV и Ha-CoV-2. Добавьте 8 мкл 27BV (45 мг/мл) в планшет и выполните серийные разведения антител с 6 мкл безсывороточного DMEM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно меняйте наконечники пипеток между лунками и убедитесь, что антитела и среда, не содержащая сыворотки, тщательно перемешаны для получения точных результатов.
4. К серийно разведенному антителу добавляют 54 мкл частицы Ha-CoV-2 и смешивают вирус и антитело. Предварительную инкубацию частиц Ha-CoV-2 с последовательно разбавленным 27BV в течение 1 ч при 37 °C при 5% CO₂. После 1 ч инкубации нанести 50 мкл смеси антител и Ha-CoV-2 на 96-луночный планшет, содержащий клетки HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 10⁴ клетки на лунку), высеянные накануне.
5. Для контроля оставьте по крайней мере три лунки, содержащие только ячейки HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Добавьте 50 мкл полной среды в эти лунки, чтобы они служили неинфицированными лунками для фонового сигнала показаний анализа люциферазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть остановлен до тех пор, пока инфекция не достигнет 18 часов инкубации при 37 °C, после чего планшет будет готов к анализу с помощью люциферазного анализа.
6. Анализ люциферазы: После 18 ч инкубации добавьте 7,5 мкл лизисного буфера непосредственно в каждую лунку и перемешайте путем орбитального встряхивания в течение 2 минут. Лизируйте клетки в лизисном буфере не менее 5 мин при комнатной температуре.
7. Приготовьте раствор люциферазы Firefly, смешав раствор D-люциферина с раствором люциферазы Firefly в соотношении 1:50. Для получения целого 96-луночного планшета смешайте 3 мл раствора люциферазного субстрата с 60 мкл раствора D-люциферина с 2940 мкл буферного раствора люциферазы светлячка.
8. Добавьте 25 мкл раствора люциферазы Firefly к клеточным лизатам и перемешайте планшет орбитальным встряхиванием в течение 1 мин. Проанализируйте активность люциферазы с помощью коммерческого считывателя микропланшетов люциферазы.

5. Количественная оценка и статистический анализ

1. Сбор данных: Проведите анализ на инфекцию и люциферазу в трех экземплярах, как указано (рис. 1). Количественная оценка экспрессии люциферазы с помощью показаний анализа люциферазы. Среднее значение – это среднее значение трех показаний анализа люциферазы. Из этого среднего значения вычитаются показания фоновых сигналов от незараженных скважин. Стандартное отклонение (SD) определяется по среднему значению показаний люциферазного анализа.
2. Анализ данных: Постройте график активности нейтрализации антител и рассчитайте значения ID₅₀ (50% дозировка ингибирования) с помощью коммерческого программного обеспечения для построения графиков. Значение ID₅₀ определяется как ингибирующие антитела разведения, при которых достигается 50%-ное снижение инфицирования клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (на основе показаний анализа люциферазы).

Частицы Ha-CoV-2 были собраны с использованием пяти различных ДНК-векторов, экспрессирующих геном РНК Ha-CoV-2 и структурные белки (M, N, E и S) SARS-CoV-2 в HEK293T клетках. Вектор S-белка варьируется в зависимости от S-варианта. S-белок из оригинального уханьского штамма Ha-CoV-2 (Wild-type, Wt) был использован в качестве положительного контроля, и он был собран вместе с S-белком каждого из двух других вариантов: Дельта (B.1.617.2) или Омикрон (B.1.1.529). Одни и те же M, N, E использовались во всех вариантах. Ha-CoV-2(Wt) и его варианты собирали через 48 ч после котрансфекции, а затем использовали для инфицирования клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Инфекционность определяли по экспрессии люциферазы через 18 ч после заражения. В этой системе более высокие уровни экспрессии сигнала люциферазы отражают более высокую инфекцию клеток Ha-CoV-2. Сигнал люциферазы нормализовали копиями геномной РНК методом ОТ-кПЦР для каждого варианта. Как показано на рисунке 1, вариант Ha-CoV-2 «Омикрон» генерировал в 4–10 раз более высокий уровень сигнала, чем исходный вариант Ha-CoV-2(Wt), что свидетельствует о более высокой заразности.

Кроме того, была проведена количественная оценка способности 27BV нейтрализовать варианты HaCoV-2(Wt), «Дельта» и «Омикрон». 27BV представляет собой моноклональное антитело кролика, которое было разработано против домена RBD белка SARS-COV-2 S1. Для нейтрализации проводили серийные разведения 27BV в 96-луночном планшете, предварительно инкубировали с Ha-CoV-2, а затем добавляли к клеткам-мишеням HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Результаты показали, что 27BV обладает нейтрализующей активностью в отношении всех протестированных вариантов (рис. 2). Интересно, что ID50 27VB для Омикрона был примерно в 10 раз менее мощным, чем ID50 для Ha-CoV-2(WT) и Ha-CoV-2 (Delta; Рисунок 2). Эти результаты показывают, что платформа Ha-COV-2 может быть использована в качестве быстрого метода количественной оценки вакциноиндуцированных нейтрализующих антител в новых вариантах.

Рисунок 1. Сборка и количественное определение вариантов Ha-CoV-2. (А) Иллюстрация сборки Ha-CoV-2 и вариантных частиц. Векторы, экспрессирующие репортерный геном Ha-CoV-2 и структурные белки (M, S, N и E), котрансфицируются в HEK293T клетках. Частицы собирали через 48 ч после котрансфекции (визуализация вирионных частиц и HEK293T клеток создавалась с помощью Biorender.com). (B) Количественная оценка инфекционности вариантов Ha-CoV-2. Относительная инфекционность двух вариантов («Дельта» и «Омикрон») количественно оценивается и нормализуется с использованием геномных РНК-копий отдельных вариантов Ha-CoV-2 (Luc). Диким типом является Ha-COV-2 (Wt), который используется в качестве контроля для сравнения. Анализы на инфекцию и люциферазу проводили 3x. RU, относительная единица. Показаны среднее значение и стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Количественная оценка нейтрализующей активности 27BV в отношении вариантов Ha-CoV-2(Luc) Нейтрализующая активность 27BV была проанализирована через 18 ч после инфицирования клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2). ID50 был рассчитан с использованием относительной частоты инфицирования (активности люциферазы) в зависимости от концентрации 27BV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Инфицирование HEK293T(ACE2/TMPRSS2) Ha-CoV-2 (GFP). Частицы Ha-CoV-2 (GFP) были собраны, а затем использованы для заражения клеток HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Экспрессию GFP наблюдали через 48 ч после заражения с помощью флуоресцентной микроскопии. Слева показано белое поле инфицированных клеток, а справа — GFP-изображение. Белая полоса соответствует 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1. Графическая аннотация. Структура и применение псевдовируса Ha-CoV-2. Изображение создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1. Белковые последовательности. Список последовательностей S, M, N и E-белков SARS-CoV-2. Последовательности S-белка также включают варианты SARS-CoV-2 «Омикрон» (B.1.1.529) и «Дельта» (B.1.617.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Патент был подан Университетом Джорджа Мейсона и лицензирован компанией Virongy Biosciences Inc. на разработку продукта. Y.W. является основателем и членом консультативного совета Virongy Biosciences. В настоящее время Б. Х. является генеральным директором и главным научным сотрудником Virongy Biosciences. Других конфликтов интересов у авторов нет.