Инструмент для автоматического создания стабильных и воспроизводимых бесклеточных промежутков для повышения надежности анализа заживления клеточных ран

Краткое содержание

Благодаря интеграции дизайна взаимодействия и анализа требований пользователя, мы представляем инновационный скребок для клеток, который улучшает анализы заживления клеточных ран с точки зрения воспроизводимости, надежности, практичности, клеточной целостности и удобства использования.

Аннотация

Надежность измерения миграции клеток в анализах заживления ран часто подрывается преобладающей методологической нестабильностью, т.е. методом, основанным на наконечниках. Мы представляем инновационный инструмент, предназначенный для устранения этих ограничений. Наш новый скребок для ячеек превосходит существующий подход, создавая более равномерный и стабильный бесклеточный зазор. Повторные биологические эксперименты показали, что бесклеточный зазор, образованный клеточным скребком, имеет более прямые края и однородный размер и форму по сравнению с методом, основанным на наконечнике (p < 0,05). Что касается дизайна продукта, скребок для клеток может похвастаться усовершенствованной цветовой гаммой, подходящей для лабораторных условий, улучшающей мониторинг результатов экспериментов, и позволяет стерилизовать путем автоклавирования для повторного использования. Примечательно, что после обработки скребок для клеток демонстрирует незначительное влияние на жизнеспособность и пролиферацию клеток (97,31% и 24,41% соответственно). И наоборот, метод, основанный на наконечнике, дает более низкую жизнеспособность клеток (91,37%) и пролиферацию (18,79%). Это исследование представляет скребок для клеток как новое многоразовое устройство, способное генерировать воспроизводимые бесклеточные промежутки при сохранении жизнеспособности клеток, тем самым повышая надежность анализов заживления ран по сравнению с существующими методами.

Введение

Опухоли характеризуются отличительными признаками, такими как преимущества избирательного роста, метаболическая перестройка и иммунная модуляция, которые интригующе способствуют усиленной миграции клеток, что является критическим злокачественным поведением опухолевых клеток. Эта особенность напрямую влияет на отдаленное метастазирование первичной опухоли, ставя под угрозу долгосрочную выживаемость пациентов ^1,2,3. Преимущества селективного роста позволяют раковым клеткам вытеснять нормальные клетки, в то время как метаболическая перестройка поддерживает эту быструю пролиферацию, изменяя энергетические пути. В то же время, иммунная модуляция позволяет опухолям уклоняться от защитных сил организма. Исследования подчеркивают серьезность этой проблемы, показывая, что метастазирование в легкие, часто являющееся результатом усиленной миграции клеток, является терминальным событием, приводящим к смерти пациентов с различными видами рака⁴. Например, рак молочной железы⁵, карцинома шейки матки⁴ и остеосаркома⁶ составляют 20%, 9% и 30% таких случаев соответственно. Таким образом, оценка миграции опухолевых клеток стала неотъемлемой частью современных исследований в области онкологии, что еще раз подчеркивает многогранный характер прогрессирования опухоли.

Анализ заживления клеточных ран является простым в использовании методом измерения миграции клеток in vitro, часто используемым в онкологических исследованиях⁷. Большинство экспериментаторов используют наконечники для пипеток для создания клеточных ран вручную⁸. Несмотря на то, что такой метод может быстро и удобно формировать клеточные раны, он все еще имеет много ограничений, которые влияют на воспроизводимость и точность оценки миграции клеток. Во-первых, использование наконечников для пипеток для создания царапин вручную сильно зависит от рабочего угла, силы и скорости оператора, что влияет на повторяемость метода⁸. Во-вторых, дефекты клеток, генерируемые наконечником, обычно имеют зубчатые, а не прямые края, потому что наконечники пипеток представляют собой пластиковые изделия с определенной эластичностью^. В некоторых исследованиях раны образуются путем помещения сборных культуральных вставок непосредственно в планшет для клеточной культуры для ограничения диапазона пролиферации клеток. Такой подход позволяет обойти ограничения метода, основанного на зондах, такие как неровные края и воспроизводимость. Тем не менее, даже при использовании биосовместимых материалов долгосрочное сосуществование встраиваемых материалов с клетками по-прежнему влияет^{на рост клеток}. Кроме того, встраивание может также вызывать клеточные эпигенетические изменения в маргинальной зоне из-за ограничения контакта¹². Кроме того, контактные вставки, изготовленные из биосовместимых материалов, дороги и сложны в повторном использовании, что ограничивает^{их целесообразность}. Таким образом, необходим новый, воспроизводимый и практичный инструмент для простой количественной оценки миграции клеток in vitro.

Основной целью данного метода является внедрение инновационного инструмента для количественной оценки миграции клеток in vitro в онкологических исследованиях, устранение ограничений существующих методов и повышение воспроизводимости и точности оценки клеточной миграции.

Обоснование разработки этой методики заключается в критической важности оценки миграции опухолевых клеток в онкологии. Опухоли демонстрируют отличительные признаки, в том числе преимущества избирательного роста, метаболическую перестройку и иммунную модуляцию, что способствует усиленной миграции клеток, что является фундаментальным аспектом злокачественных опухолей. Этот метод направлен на то, чтобы предоставить более надежные средства изучения клеточной миграции, способствуя более глубокому пониманию поведения опухоли.

Этот метод имеет существенные преимущества по сравнению с существующими методами. Ручные анализы царапин могут страдать от зависимой от оператора интерференции, в то время как вставки культур могут влиять на рост клеток и экспрессию генов. В отличие от этого, этот метод обеспечивает улучшенную повторяемость, точность и практичность, представляя собой экономически эффективное решение для измерения миграции клеток in vitro в онкологических исследованиях. Он удовлетворяет насущную потребность в надежном и доступном инструменте для изучения миграции клеток при различных типах рака, что делает его ценным дополнением к этой области.

Протокол

Полное письменное информированное согласие было предоставлено всеми участниками. Этическое одобрение не было применимо, поскольку в настоящее исследование не были включены образцы тканей животных или человека.

1. Изучение требований сообщества пользователей

1. Раздайте анкеты биологам/экспериментаторам, работающим над анализами заживления клеточных ран. Соберите заполненные анкеты и используйте их для исследования. Для этого исследования с 12 октября 2021 года по 3 февраля 2022 года было доставлено 100 анкет 100 биологам. Процент ответов составил 97%.
2. Попросите респондентов ответить на такие вопросы, как: какой из экспериментов с царапинами на клетках вас беспокоил больше всего? И какой инструмент использовался для выполнения царапания клеток? Дополните эти вопросы подвопросами, чтобы проследить причины.
3. Изучите восприятие экспериментаторами таких инструментов, как наконечники для пипеток и вставки для клеточных культур, в экспериментах по заживлению клеточных ран. Поймите и соберите причины, по которым они выбрали один инструмент вместо другого, используя теорию «средство-конечная цепь», основанную на методах лестничной лестницы, в разделах^14,15 анкет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Метод лестницы делится на два типа: метод мягкой лестницы с глубинными интервью и метод жесткой лестницы с анкетами или викторинами на бумаге и карандаше^. Метод жесткой лестницы был основным методом, использованным в этом исследовании. Теория «средства и цепочка» предполагает, что явные знания, которыми обладают целевые пользователи, являются поверхностными и конкретными, в то время как неявные знания являются глубокими и абстрактными^.

2. Проектирование и трехмерное моделирование

1. Нарисуйте эскиз на основе выводов, полученных в ходе предыдущего опроса, и начните процесс проектирования. Используйте этот предварительный эскиз в качестве основного плана.
   1. Уточните размеры и компоновку каждого компонента, применив функции Dim, DimRadius и DimDiameter в программном обеспечении для моделирования.
   2. Выполните измерения штангенциркулем с точностью до 0,02 мм на реальных 6-луночных планшетах для определения окончательных размеров скребка ячеек. Убедитесь, что они имеют длину 42,1 мм, ширину 42,1 мм и высоту 18,5 мм. Обратите внимание на детали на этапе проектирования, особенно на высоту продукта и физическую форму в скважине, чтобы обеспечить более плавную сборку.
2. Постройте трехмерную модель и выполните ее рендеринг.
   1. Начните 3D-проектирование в программном обеспечении с создания базовой модели. Нажмите такие кнопки, как ExtrudeCrv для растяжения и Loft для формирования дизайна. Уточните модель, а затем нажмите кнопку СкруглениеКромки для сглаживания краев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие используемые функциональные кнопки включают в себя: Линии - Для рисования прямых линейных сегментов, Полилинии - Для создания непрерывных линий, состоящих из нескольких сегментов, Прямоугольники - Для рисования прямоугольных фигур, Круги - Для рисования круглых фигур, Дуги - Для рисования дуговых или эллиптических форм, Точки - Для размещения маркеров с одной точкой, Текст - Для добавления текстовых меток, Размеры - Для добавления измеренных размеров к моделям, Массив - Для создания скопированных шаблонов объектов, Поворот - Поворот - Поворот объектов на нужные углы, Перемещение - Перемещение - Перемещение - Перемещение объектов на новые места, Масштаб - Увеличение или уменьшение размера объектов, Обрезка/Удлинение - Обрезка или удлинение объектов в соответствии с другой геометрией, Булево объединение/Разница/Пересечение - Объединение, вычитание или нахождение пересечения объектов, Слои - Организация объектов на разных слоях, Рендеринг — для создания визуализированных видов с материалами и освещением и Экспорт — для экспорта геометрии модели в другие форматы файлов.
   2. Импортируйте модель в программу для 3D-рендеринга. Примените такие материалы, как пластик, губка и сталь, а затем отрегулируйте освещение для реалистичного рендеринга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обобщенный список функциональных кнопок включает в себя: Drag & Drop - Для применения материалов непосредственно к деталям или моделям путем перетаскивания материала из библиотеки на нужный компонент в режиме реального времени, Щелчок правой кнопкой мыши - При щелчке правой кнопкой мыши по материалу в библиотеке, как правило, отображаются следующие параметры: Применить к выбору - Применить материал к выбранной детали в режиме реального времени. Edit Material - Настройка свойств материала. Свойства материала (после выбора материала) — доступ к определенным свойствам материала, таким как цвет, шероховатость, показатель преломления и другие атрибуты, и их изменение. Строка поиска - Для быстрого поиска материала в библиотеке путем ввода его названия или связанных ключевых слов. Категории/Папки - Для навигации по различным категориям или папкам с материалами, такими как металлы, пластик, стекло и т. д. Добавить в избранное - Чтобы отметить определенные материалы как избранные для легкого доступа во время будущих сеансов. Горячие клавиши - Доступ к некоторым операциям можно получить с помощью горячих клавиш. Например, M обычно является горячей клавишей для быстрого вызова свойств материала выбранной детали.
   3. Наконец, увеличьте контрастность (+56) и насыщенность изображения (Vibrance +19, Saturation +7) в программах для работы с фотографиями и дизайном, а также добавьте элементы фона (текстовую информацию и цвет от белого до светло-серого градиентного фона) для контекста, чтобы обеспечить высококачественное и реалистичное представление продукта.
      1. Используйте Настройки изображения >, Яркость/Контрастность , чтобы настроить контрастность изображения. Используйте инструмент «Изображение > Оттенок/Насыщенность » для изменения уровня насыщенности изображения. Используйте инструмент «Текст» (значок T) для добавления текстовой информации к изображению.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Обобщенный список функциональных кнопок включает в себя Инструмент «Эллипс» (U) - Для рисования точек/кругов. Настройте инструмент на рисование фигуры, выберите желаемый цвет заливки, а затем щелкните и перетащите (удерживая клавишу Shift для сохранения идеального круга), чтобы создать точку. Line Tool (U) - Для рисования прямых линий на изображении. Выберите инструмент, установите желаемую ширину линии, а затем щелкните и перетащите, чтобы нарисовать линию. Кисть (Кисть) (В) - Альтернативный способ рисования точек и линий. Выберите размер и форму кисти, затем щелкните (для точек) или щелкните и перетащите (для линий).
3. После завершения трехмерной модели приступайте к изготовлению скребка для ячеек методом шлифовки и сборки 20,21,22.

3. Производство

1. Используйте теорию цвета, материалов, отделки (CMF) в текущем исследовании для разработки прототипов скребка для клеток. Теория CMF служит методологией проектирования в научных исследованиях. Он повышает удобство использования продукта, формирует восприятие пользователя и направляет выбор материалов 23,24,25.
   1. Выберите цвета, которые будут использоваться в скребке ячеек из стандартной цветовой системы, включая Black 6 C, Cool Gray 6 C и 11-0601TPG^26,27.
   2. Чтобы построить скребок для ячеек, соответствующий лабораторным стандартам, выберите подходящие материалы, включая полипропилен (ПП), губку и высокоуглеродистую сталь. Для изготовления физических прототипов начните с использования 3D-принтера для изготовления структурного каркаса. Затем используйте соединители или клеящие средства для завершения сборки скребка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки физического продукта скребка для ячеек измельчите и соберите необходимые материалы. Протоколы безопасности должны соблюдаться на протяжении всего процесса, чтобы обеспечить безопасный и эффективный конечный продукт.
   3. Переходите к процессу отделки, который может включать в себя резку, шлифовку, полировку, штамповку или другие техники. Начните с шлифовки модели наждачной бумагой со средней зернистостью 120, чтобы удалить любые шероховатости.
   4. Затем нанесите наждачную бумагу с зернистостью 220 мелкозернистая, чтобы получить гладкую поверхность.
   5. Последующая шлифовка для сглаживания поверхностей, обеспечения правильной согласованности штекерных или встроенных соединителей.
   6. Надежно соедините ползуны I и II с помощью соединителей (неподвижных стержней), чтобы обеспечить прочную и долговечную сборку скребка для ячеек. Получите окончательную фиксированную форму скребка для ячеек с помощью комбинации механического крепления и клеевого соединения. Используйте крепежные элементы, в частности, врезную и шиповую конструкцию, чтобы закрепить детали вместе с помощью механической силы. Кроме того, чтобы повысить прочность сборки, нанесите клей (клей) для дальнейшего склеивания компонентов.
   7. Автоклавируйте скребок при температуре 121,3 °C в течение 30 минут, чтобы он сохранил свою первоначальную форму и физические свойства.

4. Культура клеток

1. Выращивайте клетки HOS в минимально необходимой среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина. Культивируйте их при температуре 37 °C с 5%_CO2.
2. Меняйте питательную среду каждые 2 дня.
3. Когда рост клеток превысит 80% конфлюенции, добавьте 1 мл трипсина с 0,25% ЭДТА и переваривайте в течение 60 с. После этого центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин для субкультуры. Удалите надосадочную жидкость и добавьте питательную среду, чтобы получить конечную концентрацию 5 x 10⁴ клеток на лунку. Используйте автоматический счетчик ячеек для подсчета ячеек.

5. Оценка потенциала клеточного скребка и метод на основе наконечников

1. Подготовьте все материалы для нанесения ран и простерилизуйте их ультрафиолетовым излучением путем выдержки в течение 30 минут.
2. После стерилизации наматывают 100% сливающиеся клетки HOS в 6-луночные планшеты в концентрации 5 x 10⁴ клеток на лунку с использованием либо метода скребка для клеток, либо метода на основе наконечников.
   1. Для метода на основе наконечника используйте наконечник объемом 100 мкл и проведите им по ячейке, содержащей среду, 1 штрихом в горизонтальном направлении, а другим — в вертикальном.
   2. При использовании клеточного скребкового метода поместите прототип скребка в одну из лунок и с помощью пинцета аккуратно нажмите один раз. Камеры ранены. Проводите каждый эксперимент с ранением в трех экземплярах.
3. Анализируйте все клеточные раны с помощью системы цифрового микроскопа и программного обеспечения для визуализации.

6. Измерение жизнеспособности клеток и пролиферации клеток

1. Проводите все анализы жизнеспособности клеток в соответствии с протоколом, представленным в наборе CCK-8.
2. Инкубируйте клетки с раствором CCK-8 в течение 2 ч при 37 °C, затем измерьте их поглощение при длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов для количественной оценки жизнеспособности клеток.
3. Разработайте анализ включения 5-этинил-20-дезоксиуридина (EdU) для точного количественного определения дупликации ДНК и прямого количественного определения коэффициента пролиферации клеток. Определите влияние различных методов генерации клеточных ран на пролиферацию клеток с помощью анализа EdU, следуя протоколу, описанному в предыдущей публикации²⁸.
4. Окрашивайте клетки и визуализируйте их с помощью цифрового микроскопа. Следите за тем, чтобы каждый эксперимент проводился в трех экземплярах.

Результаты

Анализ потребностей пользователей в инструментах для создания клеточных ран
Текущий экспериментальный метод получения клеточных ран требует дальнейшего совершенствования для решения многих проблем, которые ставят под угрозу биологическую воспроизводимость, надежность, экономичность потребления и пользовательский опыт анализа заживления клеточных ран. Мы использовали метод жесткой лестницы для анализа требований пользователей, участвующих в биологических экспериментах, с помощью анкет²⁹ (рис. 1A). Информация, содержащаяся в анкете, такая как имена, была анонимизирована для защиты их конфиденциальности. Подробная информация о анкете приведена в таблице 1. За 6 недель опроса 100 человек было получено 97 полностью заполненных анкет, исключены 3 подозрительные и недействительные анкеты; Процент ответов составил 97,00%.

Результаты показывают, что наиболее тревожными проблемами при заживлении клеточных ран были зубчатые края (не прямые) и нестабильная ширина или участки ран, составляющие 55,67% и 29,90% соответственно. Они были значительно выше, чем при более низкой скорости роста клеток, контаминации клеток и других вариантах с 3,09%, 5,15% и 6,19% соответственно (p < 0,001, рисунок 1B). Что касается выбора инструментов для создания ран, то использование наконечников пипеток было гораздо более распространенным, чем вставок для клеточных культур (рис. 1C). В основном это объяснялось тем, что вставки для клеточных культур достаточно дороги и не подлежат повторному использованию (рис. 1D), в то время как наконечники для пипеток дешевы, демонстрируют экспериментальную воспроизводимость (6,59%) и жизнеспособность клеток (20,88%, рис. 1E). Важно отметить, что до 69,23% пользователей утверждали, что цена вставок для клеточных культур превышает их бюджет (рис. 1D). Напротив, только 6 испытуемых выбрали вставки для клеточных культур, из которых только 16,67% считали их цену приемлемой (Рисунок 1F). Наконец, что касается инновационного инструмента для создания клеточных ран, 86,60% из них были настроены оптимистично, в то время как лишь меньше пользователей выразили нежелание (4,12%, рисунок 1G).

Впоследствии были проанализированы особенности продукта, в которых остро нуждались пользователи 30,31,32. Эти особенности включали в себя прямые раны, стабильную ширину и площадь ран, высокую воспроизводимость и приемлемую цену. Соответственно, были проведены последующие проектные работы.

Решение о проектировании элементов и материалов, использованных при разработке скребка для ячеек
Приведенные выше данные показывают, что лабораторные материалы, используемые в рутинных биологических исследованиях, должны быть строго стерильными, чтобы избежать загрязнения^{клеток.} Поэтому предлагаемый скребок для клеток должен быть стерильным. Хотя одноразовые инструменты могут быть стерилизованы окисью этилена, стоимость эксперимента неизбежно возрастет^в 34,35,36 раза. Поэтому вместо одноразовых материалов мы предлагаем сконструировать скребок для ячеек из многоразового материала с большой устойчивостью к стерилизации паром под высоким давлением (121,3 °С), для снижения стоимости и повышения гибкости при применении в разных случаях³⁷. Чтобы соответствовать этим требованиям, материал, используемый для изготовления скребка ячеек, должен обладать определенными физическими и химическими характеристиками, включая устойчивость к нагреву, высокому давлению и коррозии водяного пара.

Для использования скребка по назначению, помимо выполнения основных функций, таких как изготовление ровных ран, он также должен иметь привлекательный дизайн и цвет. С точки зрения моделирования, с учетом целевой и прикладной областей, общий стиль должен быть подходящим для лабораторий. Внешний вид не должен быть слишком показным, чтобы помешать персоналу наблюдать за ходом эксперимента. Причем его размер должен подходить для шестилуночных планшетов, а поверхность должна иметь выступ, чтобы пинцет мог его устойчиво улавливать.

CMF в дизайне является важнейшим аспектом дизайна продукта, влияющим на эстетику и пользовательский опыт. Выбор цвета влияет на эмоциональную реакцию, выбор материала — на функциональность и экологичность, а отделка — на тактильные ощущения и визуальную привлекательность. Дизайнеры CMF гармонизируют эти элементы, учитывая рыночные тенденции и идентичность бренда, чтобы создавать продукты, которые находят отклик у пользователей.

В соответствии с теорией CMF, для определения их влияния на функцию и визуальный^{эффект были} рассмотрены три критических фактора, включая цвет, материал и процесс отделки. Сначала проводился подбор цвета. В этом контексте цвет относится к внутреннему цвету, который является присущим объекту или веществу цветом при стандартных условиях освещения, лишенным влияния внешних источников света или отражений. Учитывая, что шестилуночный планшет изготовлен из полипропилена с прозрачной поверхностью, в качестве основного цвета был выбран темно-серый. Такой выбор был сделан для удобства идентификации и эксплуатации, так как темно-серый обеспечивает оптимальный контраст и видимость при наложении на другие цвета. Кроме того, темно-серый реже вызывает искажение цвета в сочетании с другими цветами, что также имеет решающее значение для наблюдения. Основные функциональные компоненты были дополнительно выделены черным цветом (рис. 2А).

Коммерческая система подбора цвета была выбрана в качестве стандарта для выбора цвета из-за ее широкого распространения и использования в различных отраслях промышленности. Полагаясь на способность компании воспроизводить согласованные цвета на различных носителях, он был выбран для исследования, поскольку это имеет решающее значение для обеспечения точного и последовательного представления цвета.

Отбор материала проводился на основе вышеупомянутых результатов анкетирования. Корпус и компоненты скребка были изготовлены из термостойкого пластика, полипропилена (ПП), чтобы удовлетворить требование стерилизации путем автоклавирования, как показано на рисунке 2B. Высокоуглеродистая сталь подходит для пружин, потому что она устойчива к высоко- и низкотемпературным, коррозионностойким лабораторным средам. Губки высокой плотности использовались для буферизации и размещались в конце предметного стекла.

Наконец, был разработан процесс отделки. Поскольку скребок для клеток часто используется и легко загрязняется, а качество поверхности влияет на стерилизацию, гладкая и глянцевая поверхность предпочтительнее для скребка для клеток, поскольку она помогает пользователю быстро определить источник загрязнения и устранить его, создавая ощущение чистоты. Кончики частично шлифуются, чтобы избежать повреждения дна чашки для культивирования, которое может повлиять на культуральную среду и привести к ограничению пролиферации клеток³⁸.

Конструкция и прототип скребка для ячеек
На основе указанных выше результатов были разработаны три прототипа скребка ячеек (рис. 3А). Исследования показывают, что наиболее часто используемые клеточные раны в пластинах клеточных культур имели крестообразную форму³⁹, что сильно отличается от прототипа I, в котором использовались прямоугольные раны; таким образом, прототип I был отвергнут (Рисунок 3А). Несмотря на то, что прототипы II и III могли создавать крестообразные свободные от клеток области, скользящую направляющую прототипа II было трудно закрепить в дисках для клеточных культур, а ее инфраструктура была довольно сложной (рис. 3A). После благоразумных обсуждений прототип III был признан окончательной моделью для производства скребка для ячеек.

Примечательно, что учитывая, что форма наконечников могла напрямую влиять на свободную от ячеек область с точки зрения краев и размеров, для выбора было разработано три эскиза. На эскизе у меня был острый верх, который мог обеспечить очень прямые края; однако культуральный интерфейс, обеспечивающий пролиферацию клеток, может быть нарушен, если кончики слишком острые (рисунок 3B). На рисунке II была предложена квадратная вершина, которая могла бы предотвратить повреждение клеточных культуральных планшетов. Однако, поскольку контактная поверхность между кончиком и нижней частью культуральной пластины имеет квадратную форму, она нестабильна при ее использовании (рисунок 3B). На рисунке III был представлен тупой закругленный кончик, что позволило избежать вышеупомянутых проблем (рис. 3C). Поэтому он был выбран в качестве финального дизайна.

Конструкция была оптимизирована по трем параметрам: способ фиксации фиксатора, встроенная губка для подушки и удобство захвата соответственно. Во-первых, ожидаемые методы крепления изделия включали потерю устойчивости⁴⁰, врез и шип⁴¹ и поворот⁴². Учитывая фактическую стоимость добычи и удобство работы, под крестообразный фиксатор был спроектирован кулачок для облегчения зажима края скважины. Кроме того, в тесте на заживление царапин мы заметили, что кончики отскакивают назад после касания стены ближе к концу из-за фиксированной длины и твердости салазок, что влияет на состояние царапин. Поэтому мы добавили амортизирующую губку на конец слайда, чтобы стабилизировать движение кончиков. (Рисунок 3A,C). Наконец, к выступу было добавлено поверхностное углубление для облегчения захвата пинцетом.

Трехмерная модель была построена с помощью программного обеспечения для 3D-проектирования. Его визуализация показана на рисунке 4A. Взрывной график детализирует внутреннюю структуру скребка клеток, которая показывает его необходимые характеристики, рассмотренные выше (рис. 4B). Кроме того, для достижения цели плавного скольжения наконечников и прямых кромок используется внутренняя механическая структура передачи мощности. Весь функциональный блок скребка для ячеек состоит из управляющей части. В реальной работе рычаг рычажного механизма внутри скребка ячеек соединен с верхней кнопкой, а конец перемещается вниз после приложения давления, чтобы конец согнулся. Пружина внутри затвора отпускается, чтобы толкать наконечники для движения. Наконец, он останавливается на губке с узким разрезом, чтобы завершить соскабливание, а затем переключается для сброса при повторном использовании (Рисунок 5A). Более того, простота в освоении и удобство работы являются критериями для биолога при измерении качества продукции. Поэтому для оформления внешнего вида изделия компоновка поверхности следовала принципу симметрии и аккуратности^43,44, выделяя и выделяя разные компоненты с помощью разных оттенков черного, белого и серого цветов (рисунок 5А).

Скребок для ячеек превосходит метод процарапывания кончиков в практическом использовании
Физический продукт скребка ячеек получали методом измельчения и сборки (рис. 5В). Как и ожидалось, скребок для ячеек отлично интегрировался с шестилуночной пластиной, а верхний крестообразный держатель плотно прилегал к краю пластины, обеспечивая прочную фиксацию (рис. 5C). Кроме того, наконечники точно прилегают к нижней части шестилуночного планшета, что способствует плавному образованию свободных от клеток областей. Наконец, скребок для клеток был автоклавирован, чтобы проверить, можно ли его использовать повторно. Как показано на рисунке 5D, настоящий скребок сохранил первоначальную форму и физические характеристики даже после автоклавирования при 121,3 °C в течение 30 минут.

Скребок превзошел существующий метод создания клеточных ран в эталонном тесте. После повторных испытаний скребок показал высокую стабильность и воспроизводимость при подготовке раны, показал низкую флуктуацию площади каждой раны и почти прямые края, со стандартным отклонением бесклеточной площади 483,73 и отклонением к прямому краю 5041,33 ± 2420,00. Напротив, площадь каждой раны, подготовленной наконечниками пипеток, показала более высокие колебания, со стандартным отклонением свободной от клеток площади 3905,80 и отклонением к прямому краю 19562,33 ± 1068,39 (рис. 6A-C).

Наконец, было оценено влияние на жизнеспособность клеток после клеточных ран (рисунок 6D). Результаты показали, что через 12 ч после завершения клеточной раны жизнеспособность клеток была незначительно, но значительно выше в группе скребков, чем в группе кончиков. Для дальнейшего подтверждения этих результатов и уточнения влияния различных методов подготовки клеточных ран на пролиферацию клеток, т.е. репликацию ДНК, был проведен анализ EdU. Результаты анализа EdU показали, что процент пролиферирующих клеток в группе скребков клеток (24,41% ± 0,48) был значительно выше, чем при методе наконечников (18,79% ± 1,46) через 12 ч (рис. 6E,F).

Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что существующий генератор клеточных ран превосходит существующий метод создания клеточных ран с точки зрения стабильности и биологической воспроизводимости. Он оказывал незначительное влияние на жизнеспособность и пролиферацию клеток. Все эти замечательные преимущества генератора клеточных ран подтвердили его потенциал для улучшения существующих анализов клеточных ран за счет обеспечения надежности и повторяемости полученных данных.

Рисунок 1: Анализ потребностей пользователей. (A) График Сэнки представляет собой рабочий процесс исследования на основе анкет для экспериментаторов. (B) - (G) представить результаты анкетирования, включая вопросы 1-6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Дизайн продукта с использованием цветов и материалов. (A) Выбор цветов. (Б) Автоклав, используемый в биологических экспериментах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Детальное проектирование изделий. (A) Три прототипа кандидата на создание скребка для ячеек. (Б) Три эскиза дизайна наконечника. (C) Трехвидовой чертеж выбранного прототипа III, представляющий его общую конструкцию и физические и пространственные параметры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Визуализированная трехмерная модель и отображение внутренних структур. (A) Визуализация трехмерной модели. (B) Взрывной график, демонстрирующий внутреннюю структуру предлагаемого скребка для ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Рабочие механизмы скребка для клеток. (А) Эскизы показывают, как работает скребок для клеток. (В) Физический продукт скребка для клеток. (C) Скребок для ячеек помещается в 6-луночный планшет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Экспериментальная валидация клеточного скребка. (A) Клеточные раны, полученные различными методами, и их сгруппированные результаты сравнения были показаны в (B) и (C), масштабная линейка составляет 100 мкм. (D) Результаты жизнеспособности клеток. (E) и (F) Edu результаты анализа, масштабная линейка составляет 50 мкм. Для статистической оценки был проведен t-критерий для сгруппированного сравнения, а исходное p-значение было скорректировано с помощью теста Холма-Бонферрони, чтобы избежать ложноположительных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

I) Что из перечисленного ниже является для вас наиболее тревожным вопросом в эксперименте по скретканию клеток?

А) Отсутствие прямых краев

Б) Нестабильная ширина

В) Медленное распространение

D) Загрязнение клеток

д) Прочее

II) Какие инструменты вы используете для создания клеточных ран

А) Наконечники для пипеток (перейти к вопросу III)

Б) Вставки для клеточных культур (поворот к вопросу IV-V)

III) Почему вы не выбираете вставки для клеточных культур?

А) Жизнеспособность клеток

Б) Не подлежит повторному использованию

В) Стоимость

Г) Прочее

IV) Почему вы выбрали вставки для клеточных культур?

А) Стоимость

Б) Повторяемость

в) Прочее

V) Как вы думаете, какие самые серьезные проблемы возникают при вставке клеточных культур?

А) Статус ячейки

Б) Не подлежит повторному использованию

в) Дорого

Г) Прочее

д) Удовлетворен

VI) Если бы существовал недорогой, многоразовый (автоклавируемый), легко воспроизводимый инструмент для создания царапин, насколько вы были бы готовы его купить и использовать?

А) Очень охотно

Б) Желание

В) Не уверен

Г) Не желаете

Таблица 1: Опросник, использованный в этом исследовании, состоит из шести вопросов, предназначенных для понимания ситуаций, с которыми биологи сталкиваются во время анализов заживления клеточных ран.

Обсуждение

Целью настоящего исследования была разработка автоматического механизированного инструмента для анализа заживления клеточных ран. Насколько нам известно, это первая попытка применить механизированную приводную структуру для автоматического создания клеточных ран одним щелчком мыши. Таким образом, мы стремимся устранить недостатки традиционного метода, основанного на подсказках, такие как низкая воспроизводимость и нестабильное состояние царапин. Ожидается, что благодаря положительным результатам и обнадеживающим отзывам сообщества пользователей, скребок предоставит экспериментаторам эффективную и стабильную альтернативу для создания клеточных ран, тем самым значительно повысив уровень достоверности результатов экспериментального анализа.

Для использования скребка по настоящему изобретению пользователь должен: 1) подготовить ячейки до создания безклеточного зазора, аналогичного традиционным методам, таким как метод на основе зонда, т.е. засеять ячейки на шестилуночный планшет с заданной плотностью; 2) дождаться, когда скорость конвергенции ячеек достигнет > 90%; 3) поместите стерильный скребок для клеток в лунку с пластиной, нажмите кнопку, как показано на рисунке 5, и зазор без клеток будет автоматически создан в течение 1-2 секунд.

Анализ заживления клеточных ран широко используется для измерения миграционной способности клеток. Как правило, экспериментаторы используют наконечники для пипеток для создания клеточных ран. Например, Tariq et al. использовали наконечник пипетки для создания клеточных ран для оценки способности клеток к миграции⁴⁵; не случайно Rahimi et al. использовали наконечник пипетки в анализе для наблюдения за миграционной способностью клеток PC3⁴⁶; в анализе миграции мезенхимальных клеток мышей Cormier et al. также использовали пистолет-пипетку⁴⁷; Демонстрируя влияние мышьяка на миграцию клеток кожи, Pinto et al. использовали наконечник пипетки для вертикального соскабливания⁴⁸, среди прочего.

Однако, как упоминалось ранее, использование наконечника для создания клеточных ран имеет ряд проблем, таких как переменная свободная от клеток площадь, неровные края и зависимость от силы оператора и угла царапины, что приводит к низкой воспроизводимости^. Представленные результаты анкетирования также доказали, что метод на основе наконечников имеет более очевидные преимущества по сравнению со вставками для клеточных культур, в частности, с точки зрения цены, выживаемости клеток и возможности повторного использования инструмента. С другой стороны, вставки с ячейками слишком дороги и их трудно использовать повторно, в то время как любой инструмент имеет дефекты. Поэтому сообщество пользователей в целом настроено оптимистично и готово пробовать инновационные инструменты. В этом исследовании был разработан и разработан новый инструмент для подготовки бесклеточной области для облегчения и стабилизации создания клеточной раны.

Наиболее важным вкладом настоящего исследования является разработка и экспериментальная валидация клеточного скребка. По сравнению с предыдущими исследованиями, усовершенствования настоящего скребка включают в себя следующие три основных момента. 1) стабильная и удобная пластика клеточных ран. Это исследование показало, что по сравнению с традиционным методом, основанным на наконечниках, клеточные раны, изготовленные с помощью настоящего клеточного скребка, имели прямые края и могли создавать аналогичные раны в повторных экспериментах, что значительно улучшило воспроизводимость и надежность экспериментов по заживлению клеточных ран. 2) Имеющийся скребок клеток оказывал меньшее влияние на состояние клеток. Он не влиял на жизнеспособность и пролиферацию клеток (амплификацию ДНК), что было значительно лучше, чем метод, основанный на наконечнике. Таким образом, ожидается, что этот скребок для клеток еще больше снизит влияние внешних факторов на анализ заживления клеточных ран в рутинных экспериментах. 3) Этот скребок ячеек хорошо согласуется с требованиями сообщества пользователей. Результаты предыдущего анкетирования показали, что требования пользователей к новому инструменту для обработки клеточных ран в основном включают в себя одинаковую ширину штриха, высокую воспроизводимость, простую операционную процедуру и умеренную цену, которые были достигнуты в данном скребке. Кроме того, скребок для ячеек выполнен в нейтральных тонах, чтобы передать простую и практичную концепцию дизайна этого продукта. В то же время сильный черно-белый контраст эффектно выделяет его функциональные зоны. Общий стиль представляет собой крестообразную форму, образованную закругленным сочленением изогнутой поверхности, что отсылает к обычной форме раны и указывает на роль продукта. Сложность операции снижается за счет упрощения управления и функции ручного сброса. Таким образом, полученные результаты указывают на многообещающий альтернативный инструмент для экспериментаторов, позволяющий одним щелчком мыши готовить клеточные царапины автоматизированным и надежным способом, тем самым улучшая воспроизводимость научных результатов.

Следует признать ограничения данного исследования. Размер выборки опрошенных ограничивает обобщаемость данного исследования; Поэтому мы еще больше увеличим размер выборки в последующем исследовании, чтобы усовершенствовать скребок клеток. Во-вторых, скребок для клеток должен быть включен в хорошо спланированное исследование с большим количеством пользователей, чтобы можно было более всесторонне оценить производительность этого скребка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CCK-8 Kit	Beyotime Company, Китай	C0037
цифровой микроскоп	Olympus	IX81
фетальная бычья сыворотка	Gibco, США	16000044
HOS	Procell Медико-биологические науки и Technology Co., Ltd	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	version 6.0
KeyShot	Luxion	version 11.0	Программное обеспечение для 3D-рендеринга
Считыватель микропланшетов	BioTek, немецкий	ELX808
Minimum Essential Medium	Gibco, США	11095080
Система согласования Pantone	Pantone		Подбор коммерческих цветов
пенициллин-стрептомицин	Beyotime Company, Китай	ST488
Photoshop	Adobe		программное обеспечение для фото и дизайна
Rhinoceros 3D Robert	McNeel & Associates	версии 7.0	Программное обеспечение для 3D-проектирования
TC20 Автоматизированный счетчик клеток	Bio-Rad	TC20
Трипсин	Цитива  HyClone, Соединенные Штаты	SH30042.01