В этом исследовании был разработан новый метод экспрессии генов in planta и редактирования генов, опосредованный агробактериями , в бамбуке. Этот метод значительно повысил эффективность валидации функций генов у бамбука, что имеет значительные последствия для ускорения процесса размножения бамбука.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Планте Экспрессия генов и редактирование генов в листьях бамбука мосо
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Для бамбука был разработан новый метод трансформации генов in planta , который позволяет избежать необходимости в длительных и трудоемких процессах индукции и регенерации каллуса. Этот метод включает в себя экспрессию генов, опосредованную агробактериями, через ранение и вакуум для саженцев бамбука. Он успешно продемонстрировал экспрессию экзогенных генов, таких как репортер RUBY и ген Cas9 , в листьях бамбука. Наибольшая эффективность трансформации для накопления беталаина в проростках RUBY была достигнута при использовании штамма GV3101, с процентом 85,2% после заражения. Несмотря на то, что чужеродная ДНК не интегрировалась в геном бамбука, метод оказался эффективным в экспрессии экзогенных генов. Кроме того, с использованием этого метода была разработана система редактирования генов, из которой был получен мутант in situ , сгенерированный отредактированным геном бамбуковой виолаксантиндеэпоксидазы (PeVDE) в листьях бамбука с частотой мутаций 17,33%. Мутация гена PeVDE привела к снижению значений нефотохимического тушения (NPQ) при сильном освещении, что может быть точно обнаружено флуориметром. Это делает отредактированный PeVDE потенциальным нативным репортером как для экзогенных, так и для эндогенных генов бамбука. С помощью репортера PeVDE был успешно отредактирован ген циннамоил-КоА-редуктазы с частотой мутаций 8,3%. Эта операция позволяет избежать процесса культивирования тканей или индукции каллуса, что является быстрым и эффективным для экспрессии экзогенных генов и эндогенного редактирования генов в бамбуке. Этот метод может повысить эффективность верификации функций генов и поможет выявить молекулярные механизмы ключевых метаболических путей в бамбуке.
Введение
Исследование функции генов бамбука имеет большие перспективы для углубленного понимания бамбука и раскрытия его потенциала для генетической модификации. Эффективный способ достижения этой цели может быть достигнут с помощью процесса агробактериальной инфекции в листьях бамбука, при котором фрагмент Т-ДНК, содержащий экзогенные гены, вводится в клетки, что впоследствии приводит к экспрессии генов в клетках листьев.
Бамбук является ценным и возобновляемым ресурсом с широким спектром применения в производстве, искусстве и исследованиях. Бамбук обладает превосходными свойствами древесины, такими как высокая механическая прочность, удар....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка саженцев бамбука
- Подготовьте саженцы бамбука мосо (Phyllostachys edulis), используя семена, собранные в Гуйлине, Гуанси, Китай. Начните с замачивания семян в воде на 2-3 дня, обязательно меняя воду ежедневно. Далее создают субстрат, смешивая грунт и вермикулит в пропорции 3:1.
- Посейте замоченные семена в субстрат для проращивания. Держите рассаду в лабораторных условиях, поддерживая температуру в пределах 18-25 °C. Обеспечьте фотопериод 16 ч светлый/8 ч темный с интенсивностью света 250-350 мкмоль/м2/с во время световой фазы.
- Поддерживайте относительную влажность воздуха около 60%. Д....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Агробактерии, опосредованные экспрессией гена planta в листьях бамбука
Было продемонстрировано, что репортерный ген RUBY эффективен в визуализации транзиторной экспрессии генов благодаря его способности продуцировать ярко-красный беталаин из тирозина10. В этом исследовании для транзиторной экспрессии экзогенного гена RUBY в листьях бамбука использовалась опосредованная агробактериями трансформация (рис. 1
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод значительно сокращает необходимое время по сравнению с традиционными методами генетической трансформации, которые обычно занимают 1-2 года, и обеспечивает транзиторную экспрессию экзогенных генов и редактирование генов эндогенных генов в течение 5 дней. Тем не менее, этот метод имеет ограничения, поскольку он может трансформировать только небольшую часть клеток, а генетически отредактированные листья являются химерными и не имеют способности регенерировать в полноценные растения. Тем не менее, эта технология э.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку Национальной программе ключевых исследований и разработок Китая (грант No 2021YFD2200502), Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 31971736).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 35S::RUBY | Addgene, США | 160908 | Plaamid construct |
| Agrobacterium компетентные клетки GV3101, EHA105,LBA4404 и AGL1 | Biomed, Китай | BC304-01, BC303-01, BC301-01 и BC302-01 | При инфекции агробактерий |
| CTAB | Sigma-Aldrich, США | 57-09-0 | Экстракция ДНК |
| Imaging-PAM флуориметр | Walz, Effeltrich, Германия | Обнаружение флуоресценции хлорофилла в листьях бамбука | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Германия | Программное обеспечение для визуализации-PAM флуориметр | |
| Paq CI или Aar I | NEB, United States | R0745S | Включение целевой последовательности в вектор CRISPR/Cas9. |
| PrimeSTAR Max ДНК-полимераза | Takara, Japan | R045Q | Для клонирования гена |
| T4 DNA ligaza | NEB, United States | M0202V | Включите целевую последовательность в вектор CRISPR/Cas9. |
Ссылки
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus M....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
