Method Article

Модель недоношенных крыс для изучения боли

DOI:

10.3791/65800

⸱

February 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Neuroscience, Neuromodulation and Study of Pain (LANNED), UNIFAL-MG, 2SINPAIN Faculty

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем краткий протокол создания модели недоношенных крыс, облегчающий исследования по лечению боли в раннем периоде после рождения. Метод включает в себя проведение кесарева сечения за три дня до ожидаемых родов, извлечение недоношенных крыс с помощью гистерэктомии и их интеграцию с биологическим потомством суррогатной матери.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании подробно изучаются последствия последовательной стимуляции булавочными уколами для недоношенного потомства, чтобы выяснить ее долгосрочные последствия для чувствительности к боли. Основной целью этого протокола было исследование влияния неонатальных стимулов булавочным уколом на болевой порог на более поздних этапах жизни с использованием модели недоношенных крыс. Создавая эту модель, мы стремимся продвинуть исследования по пониманию и лечению ранней постнатальной боли, связанной с недоношенностью. Результаты этого исследования показывают, что, хотя исходные пороги к механическим стимулам остались неизменными, наблюдалось заметное увеличение механической гиперчувствительности после полной инъекции адъюванта Фрейнда (КФА) у взрослых крыс. Интересно, что по сравнению с самцами крыс, самки крыс демонстрировали повышенную гиперчувствительность к воспалительным процессам. Примечательно, что материнское поведение, вес пометов и траектория роста потомства оставались неизменными при стимуляции. Проявление измененных ноцицептивных реакций во взрослом возрасте после неонатальных болевых стимулов может свидетельствовать об изменениях в сенсорной обработке и функционировании глюкокортикоидных рецепторов. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для понимания основных задействованных механизмов и разработки вмешательств для устранения последствий недоношенности и неонатальной боли у взрослых.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В неонатальном периоде ноцицептивные пути претерпевают значительную структурную и функциональную зрелость, а наличие повреждений тканей и связанной с этим боли имеет глубокие последствия для развития соматосенсорногопроцессинга.

Использование животных моделей позволяет проводить контролируемые экспериментальные манипуляции с животными, что позволяет глубже понять последствия неонатальной боли для поведения в более позднем возрасте, смягчая при этом потенциальные искажающие переменные 2,3. Часто наблюдаемым исходом является влияние неонатальной боли на повышенную болевую чувствительность во взрослом возрасте 2,4,5. В отделении интенсивной терапии новорожденных (ОИТН) неонатальная боль является широко распространенным источником стресса, при этом недоношенные дети обычно подвергаются в среднем 10 инвазивным процедурам в день6. Недоношенные новорожденные в отделении интенсивной терапии новорожденных сталкиваются с целым рядом стрессоров, включая боль, ограниченный контакт с матерью, слуховые стимулы и чрезмерное освещение 7,8,9.

Использование животных моделей имеет важное значение для углубления нашего понимания основных механизмов, участвующих в этих процессах, и содействия новым достижениям в этой области. В частности, использование моделей недоношенных животных в исследованиях может внести значительный вклад в расширение знаний о недоношенных детях и предоставить ценную информацию о вмешательствах по лечению боли у недоношенных новорожденных.

В настоящее время существует ограниченное число моделей на грызунах, которые специально посвящены недоношенности, причем большинство из этих исследований в первую очередь изучают влияние недоношенности на мозг11, развитие легких12, некротизирующий энтероколит13 или исследования иммунного питания14. Тем не менее, ни одна из этих моделей не изучает созревание болевой системы, которая особенно уязвима в случаях недоношенности.

Преждевременные роды и их последствия для раннего постнатального лечения боли остаются важнейшими областями исследований. Таким образом, настоящая работа была направлена на то, чтобы внести вклад в литературу путем создания модели недоношенных крыс. Эта модель дает представление о влиянии неонатальных стимулов булавочным уколом на болевой порог на более поздних этапах жизни, улучшая наше понимание боли, связанной с недоношенностью.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры соответствовали Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию, принятому Этическим комитетом по экспериментам на животных Федерального университета Альфенас (протокол 32/2016).

1. Животные

  1. Приобретите взрослых самцов и нерожавших самок крыс линии Вистар (в возрасте примерно восьми недель) в Центральном животноводческом центре Федерального университета Альфенаса.
  2. Содержание крыс в условиях контролируемой температуры и влажности в 12:12 ч в темное время суток и кормление их кормом и водой в неограниченном количестве в помещениях для животных факультета физиотерапии (Федеральный университет Альфенаса).

2. Проверка на беременность

  1. В течение 1 месяца, каждое утро с 8:00 до 9:00 утра, перевозите каждую клетку с животными в экспериментальную комнату. Чтобы выполнить вагинальное промывание, осторожно введите во влагалище крысы пластиковую пипетку, содержащую 10 мкл 0,9% раствора NaCl. Обеспечьте неглубокое введение, чтобы избежать глубокого проникновения, а затем аккуратно извлеките, чтобы собрать вагинальные выделения.
  2. Собранную вагинальную жидкость расположите на отдельных стеклянных предметных стеклах, назначив каждой клетке с животными отдельную горку.
    1. Получите по одной капле неокрашенного материала от каждой крысы с помощью чистого наконечника для пипетки. Исследуйте материал под световым микроскопом, используя объективы с 10-кратным и 40-кратным увеличением, не используя линзу конденсора.
    2. Определите три различных типа клеток на основе их характеристик: круглые и ядрообразные эпителиальные клетки, неправильные ороговевшие клетки без ядра, а также маленькие и круглые лейкоциты15.
  3. Подвергать к спариванию самок крыс Вистар с интенсивной кератинизацией и вагинальной десквамацией, характерными для эстрального цикла и свидетельствующими о повышенной восприимчивости самцов. Спаривайте крыс, помещая 2 самок и 1 самца в клетку. Определите 0-й день беременности, проверив наличие сперматозоидов и клеток эстральной фазы в мазках из влагалища.

3. Классификация и управление беременными самками и их потомством

  1. Утилизируйте три типа беременных самок (по 2 самки каждая) в зависимости от стадии беременности: недоношенные, доношенные и суррогатные самки. Дайте доношенным сукам родиться естественным путем на 22-й день беременности и используйте их пометы для доношенной группы.
  2. На 19-й день беременности проведите кесарево сечение у недоношенных беременных матерей, которое происходит за 3 дня до предполагаемой даты родов. Используйте эти наполнители для группы недоношенных. Учитывая, что эта процедура не способствует выживанию матери, доверьте недоношенных щенков суррогатным матерям, которые родили естественным путем за 2 дня до кесарева сечения недоношенных матерей.
  3. Оставьте щенков суррогатной матери с собой на несколько часов, позволяя их запахам смешиваться с пометами недоношенных. По истечении этого срока вводят недоношенным пометы и удаляют первоначальных щенков суррогатной матери, впоследствии жертвуя их высокими дозами ингаляции изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для того, чтобы убедиться, что суррогатные матери уже стимулировали выработку молока в своих молочных железах, что позволяет им эффективно выхаживать недоношенных щенков.

4. Кесарево сечение

  1. Частично обезболить недоношенных беременных самок 2% изофлураном и усыпить их за 3 дня до предполагаемой даты родов с помощью вывиха шейки матки. После эвтаназии извлекайте потомство одного за другим с помощью гистерэктомии.
  2. Сделайте разрез 3 см по средней линии нижней части живота, а затем продольный разрез 2 см. Из этих надрезов сделайте надрез по межжелудочной границе в средней части каждой маточной трубки.
  3. Аккуратно извлеките крысят и плаценту с помощью гистерэктомии17,18. Немедленно извлекайте потомство по одному.

5. Послеоперационный уход и подготовка щенков к усыновлению

  1. Используйте процедуру усыновления, чтобы предотвратить неадекватное поведение прооперированной матери из-за хирургической процедуры и потенциальной боли, которая может повлиять на поведение щенков во взрослом возрасте.
  2. После рождения очистите дыхательные пути крысят с помощью бумажных полотенец. Очистите крысят, искупав их, чтобы предотвратить каннибализм суррогатных матерей. Вымойте крысят в воде при температуре 28 °C и высушите их.
  3. Удалите все следы крови и поместите щенков в чашки Петри под нагретое инфракрасное освещение, поддерживая температуру примерно 28 °C, пока их дыхание не станет регулярным.
  4. Разрежьте их пуповину чуть ниже плаценты и используйте вату, смоченную вH2O2 , чтобы остановить кровотечение из пуповины. Наконец, предложите их приемным матерям на усыновление.

6. Взаимодействие приемной матери и усыновление недоношенного потомства

  1. Разместите каждую приемную маму с пометом в отдельных пластиковых клетках. Перед переводом отметьте каждый термин щенка с приемной руки. Эта маркировка имеет решающее значение для последующего анализа материнского поведения. Поддерживайте целостность клеток приемных матерей на протяжении всего процесса усыновления.
  2. Первоначально поместите недоношенных детенышей за пределы гнезда. Эта стратегия позволяет суррогатной матери распознать и ознакомиться с запахом новых щенков на нейтральной территории. Кроме того, выберите одного или двух собственных щенков приемной матери и поместите их за пределы гнезда рядом с недоношенными щенками. Эта смесь побуждает суррогатную мать собирать как своих, так и недоношенных щенков, тем самым способствуя принятию и интеграции новых щенков в свое гнездо.
  3. Сначала смешайте приемное потомство с биологическим. Подтвердите эффективное внедрение. Извлеките из гнезда детенышей приемной матери и принесите их в жертву19.
    Примечание: В этом исследовании жизнеспособность недоношенных крыс составила 100%, и они не были отторгнуты суррогатной матерью.

7. Стандартизация помета

  1. Поддерживайте размер помета 8 щенков в помете во всех группах щенков, выращенных суррогатными матерями, с 4 самцами и 4 самками. После стандартизации принесите в жертву оставшихся детенышей крыс.

8. Дизайн эксперимента и реализация протокола

ПРИМЕЧАНИЕ: Целью данного протокола было получение жизнеспособных недоношенных щенков для разработки следующих экспериментальных процедур.

  1. Используйте в общей сложности 20 беременных матерей для проведения процедур. Разделите их на две экспериментальные группы, каждая из которых состоит из 10 плотин.
    1. Стимулируйте щенков в первой группе, группе ПП, с помощью стимулов от PND 2 до PND 15.
    2. Обозначьте вторую группу как группу CC, которая служит в качестве контрольной, при этом щенки в этой группе не получают стимуляции булавочным уколом.
    3. Внимательно следите за материнским поведением матерей и весом пометов в течение всего этого периода.

9. Оценка после отлучения от груди и поведенческое тестирование

  1. Отлучите потомство от груди на ПНД 22. Отсортируйте их по полу и поместите в клетки вместимостью не более 4 животных каждая, пока они не достигнут возраста примерно 8 недель.
  2. После этого подвергните этих животных оценке чувствительности к болевым раздражителям с помощью электронного теста фон Фрея. Сосредоточьтесь конкретно на боли, вызванной воспалением от CFA.
  3. Чтобы смягчить любые потенциальные влияния, связанные с пометом, выберите 1 самца и 1 самку крысы из каждого помета для каждой экспериментальной группы, чтобы пройти поведенческое тестирование во взрослом возрасте.
  4. Используйте каждое животное в одном эксперименте, чтобы избежать вмешательства гормональных факторов в ноцицептивные реакции самок потомства крыс. В частности, убедитесь, что тесты проводятся на самках во время диэструсной фазы эстрального цикла.

10. Повторная индукция боли у новорожденных

  1. Вызвать повторную неонатальную боль с помощью техники булавочного укола, аналогичной описанной в предыдущем исследовании20. Начните ежедневные уколы для щенков крыс, начиная со 2-го дня после рождения (ПНД 2) и продолжайте эту практику до ПНД 15.
  2. Осторожно введите иглу 22 G на небольшую глубину в среднеподошвенную область правой задней лапы.
    1. Убедитесь, что проникновения достаточно для стимуляции, не причиняя чрезмерной травмы. Калибруйте манометр, чтобы предотвратить более глубокое проникновение, учитывая риск его полного прохождения через лапу в этом возрасте.
    2. При возникновении кровотечения следует незамедлительно остановить его с помощью тампона с ватным наконечником; Как правило, это вмешательство длится всего несколько секунд. Вводите стимулы 4 раза, сохраняя интервал в 2 минуты между каждым, всего 8 уколов в день.
  3. Чтобы свести к минимуму возможные мешающие факторы, связанные с разлучением матери и обращением с новорожденными, отделите крысят от матерей максимум на 5 минут. Примените ту же продолжительность разделения к контрольной группе. Следуя каждому набору стимулов, немедленно возвращайте крысят к их матам 5,21,22.

11. Оценка материнского поведения

  1. Чтобы оценить поведение матерей, оцените поведение самок в обеих экспериментальных группах (n = 10 в группе) от ПНД 2 до ПНД 15. Проводите оценку в два сеанса: один утром, перед булавочным уколом на крысятах (между 08:00 и 09:30), и один во второй половине дня, после булавочного укола на крысятах (между 15:00 и 16:30).
  2. Во время этих сеансов усердно наблюдайте, записывайте и оценивайте поведение каждой матери каждые 3 минуты во время этих сеансов, что приводит к 30 наблюдениям за период в день. В общей сложности получается 60 наблюдений на одну мать в день.

12. Учет материнского и нематеринского поведения

  1. Запишите параметры материнского поведения, которые включают в себя такие действия, как вылизывание или вылизывание (на теле или в аногенитальной области), кормление, поддержание выгнутой спины в позе, похожей на «одеяло», лежание на спине или боку во время кормления, участие в строительстве гнезд и материнский самоуход (включая стимуляцию груди путем самоочищения).
  2. Задокументируйте параметры, не связанные с материнским поведением, включая такие действия, как кормление, исследование клетки, отсутствие исследования и отсутствие материнского ухода за собой.
  3. Представьте данные в процентном соотношении от общего материнского поведения и нематеринского поведения. Разделите количество записанных наблюдений за поведением цели на общее количество наблюдений и умножьте результат на 100 5,23,24.

13. Оценка веса помета

  1. На протяжении всей фазы стимуляции булавочным уколом (PND 2-15) контролируйте вес пометов в группах ПП и СС, каждая из которых состоит из 8 пометов.
  2. Во время фазы стимуляции булавочным уколом (PND 2-15) постоянно контролируйте вес пометов в группах ПП и СС, каждая из которых состоит из 8 пометов.

14. Механический пороговый тест

  1. В этом эксперименте проводили инъекции физраствора или КФА, каждая в объеме 100 мкл, крысам (в возрасте 8 недель) из групп ПП и КК. После этого по отдельности поместите их в акриловые клетки (42 см × 24 см × 15 см) с проволочной сеткой за 15-30 минут до теста для оценки механической гипералгезии.
  2. В тесте вызовите рефлекс сгибания задней лапы с помощью ручного преобразователя силы, оснащенного полипропиленовым наконечником 0,5 мм2 (Electronic von Frey).
    1. Постепенно прикладывайте кончик между пятью дистальными подушечками лапы правой задней лапы, увеличивая давление до тех пор, пока не будет замечена реакция.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда происходит втягивание лапы, стимул автоматически прекращается, и его сила документируется. Тест завершается четкой реакцией вздрагивания, за которой следует отдергивание лапы. Подкожное введение КФА вызывает длительное воспаление, достигающее пика в течение 24 ч и сохраняющееся в течение не менее 7 дней25 дней.
  3. Проводите испытания на животных до и через 4 ч, 7 ч, 10 ч и 24 ч после введения физиологического раствора или CFA4. Представьте результаты в терминах порога отмены, измеряемого в граммах (г), и рассчитайте его путем усреднения трех измерений.
  4. Чтобы предотвратить вмешательство потенциальных гормональных факторов в ноцицептивные реакции у потомства женского пола, убедитесь, что тесты проводятся исключительно во время фазы диэструса их эстрального цикла.

15. Анализ данных

  1. Обрабатывайте данные с помощью программного обеспечения для статистического анализа и представляйте их в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM). Чтобы выявить статистически значимые различия между группами, примените двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с повторными измерениями, учитывая такие факторы, как оценка материнских и нематеринских параметров и оценка веса помета.
  2. В частности, анализируйте стимулы PND и булавочные уколы для материнских параметров, а также стимулы фон Фрея: CFA и булавочные стимулы для оценки веса помета. При необходимости проведите апостериорный анализ с использованием теста Бонферрони.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании не было различий в материнском или нематеринском поведении между матерями, независимо от того, подвергались ли их дети экспериментам с булавочными уколами в неонатальном периоде или были недоношенными или доношенными (Рисунок 1). Что касается материнского поведения приемных матерей недоношенного потомства, двусторонняя ANOVA показала, что наблюдался эффект ПНД (послеродовой день), но не было влияния булавочных стимулов или какого-либо взаимодействия между двумя факторами на оценку наблюдаемого поведения матери в 8 часов утра [Фактор ПНД: F(13, 140) = 6,31, p < 0,001; фактор стимула булавочного укола: F(1, 140) = 1,04, p = 0,30; взаимодействие стимула булавочного укола x PND: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; Рисунок 1А]; или в 3 часа дня [фактор PND: F(13, 140) = 16,97, p < 0,001; фактор стимула булавочным уколом: F(1, 140) = 3,27, p = 0,07; стимул булавочным уколом x взаимодействие с PND: F(13, 140) = 1,82, p = 0,04; Рисунок 1С]. С точки зрения нематеринского поведения, наблюдался заметный эффект от ПНД, но не было существенного влияния стимулов булавочного укола или взаимодействия между этими двумя факторами в 8 часов утра [фактор ПНД: F(13, 140) = 6,31, p < 0,001; фактор булавочного укола: F(1, 140) = 1,04, p = 0,30; взаимодействие между стимулом булавочного укола и ПНД: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; см. Рисунок 1B]. Аналогичным образом, в то время как эффект ПНД сохранялся, влияние стимулов булавочного укола и его взаимодействие с ПНД не были статистически значимыми в 3 часа дня [фактор ПНД: F(13, 140) = 16,97, p < 0,001; фактор булавочного укола: F(1, 140) = 3,27, p = 0,07. Двусторонний ANOVA выявил заметный эффект ПНД и, что важно, значимое взаимодействие между булавочными стимулами и ПНД в 15:00 (фактор ПНД: F(13, 182) = 13,82, p < 0,001; фактор булавочных стимулов: F(1, 182) = 3,78, p = 0,05; взаимодействие стимулов PND x булавочный укол: F(13, 182) = 1,82, p = 0,04; см. Рисунок 1D]. Это взаимодействие подчеркивает отчетливое влияние булавочных стимулов на нематеринское поведение, особенно очевидное при дневной оценке.

figure-results-1
Рисунок 1: Влияние укола булавкой в неонатальный период (ПНД 2-15) на материнское поведение приемных матерей недоношенного потомства. (А) Количество зарегистрированных случаев материнского поведения, оцененных в 8:00 утра. (В) Количество зарегистрированных случаев нематеринского поведения, оцененных в 8:00 утра. (В) Количество зарегистрированных случаев материнского поведения, оцененных в 15:00. Каждая точка представляет собой среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 2 показано увеличение веса недоношенного помета в течение периода, в течение которого был применен стимул булавочным уколом (PND 2-15). Не наблюдалось никаких изменений в массе помета между группой КК (контроль) и группой ПП (булавочный укол). Двусторонний ANOVA выявил значимый эффект ПНД, но не выявил значимого влияния стимула булавочного укола или взаимодействия между двумя факторами на вес помета [фактор ПНД: F(13, 140) = 247,5, p < 0,001; фактор стимула булавочного укола: F(1, 140) = 0,89, p = 0,34; стимул булавочным уколом × взаимодействие с ПНД: F(13, 140) = 0,05, p = 1,00].

figure-results-2
Рисунок 2 - Влияние укола булавкой в неонатальном периоде (ПНД 2-15) на вес недоношенного помета в граммах. Каждая точка представляет среднее значение ± SEM для 8 животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наблюдалось значительное основное влияние булавочных стимулов и КФА на порог отхождения лапы, при этом значительное снижение (p < 0,001) наблюдалось у самцов из групп CC/CFA и PP/CFA во все моменты времени по сравнению с самцами в группах CC/Sal и PP/Sal (рис. 3A). Это подчеркивает сильное влияние как булавочных стимулов, так и ЦФА на ноцицептивные реакции у самцов. Примечательно, что через 4 ч после инъекции КФА в группе PP/CFA наблюдалось значительное снижение PWT (p < 0,001) по сравнению с группой CC/CFA [фактор CFA: F(4,112) = 13,12, p < 0,001; стимул-фактор булавочного укола: F(3,112) = 14,45, p < 0,05; Взаимодействие КФА x булавочный стимул: F(12,112) = 5,14, p < 0,05]. Что касается щенков женского пола (рис. 3B), то снижение порога выведения (p < 0,001) было отмечено в группах CC/CFA и PP/CFA во все моменты времени по сравнению с группами CC/Sal и PP/Sal. В частности, через 4 ч после инъекции КФА в группе ПП/КФА наблюдалось достоверное снижение порога отмены (p < 0,05) по сравнению с группой CC/CFA [фактор CFA: F(4,112) = 31,16, p < 0,001; стимулирующий фактор булавочного укола: F(3,112) = 18,22, p < 0,01; Взаимодействие КФА и булавочного стимула: F(12,112) = 58,13, p < 0,01]. Взрослые самцы и самки продемонстрировали сниженный порог отведения лапы между группой PP/CFA и группой CC/CFA во все моменты времени, начиная с отметки 4 часа.

figure-results-3
Рисунок 3 - Влияние укола булавкой в неонатальном периоде (ПНД 2-15) у недоношенных пометов на ноцицепцию по тесту фон Фрея до и после инъекции внутриподошвенного ЦФА или физиологического раствора. Порог изъятия лапы, в граммах, у (А) самцов крыс или (В) самок крыс. Каждая точка представляет среднее значение ± SEM для 8 животных. * p < 0,05 и *** p < 0,001 по сравнению с контрольной и ПП/солевыми группами против контрольной группы и группы ПП/КФА; # p < 0.01 сравнение контрольной группы CFA с группой PP/CFA. BASAL представляет собой ноцицептивный порог, измеренный перед внутриподошвенным введением КФА или физиологического раствора. Стрелкой указано время внутриплантарного введения КФА или физраствора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы заметили, что материнское и нематеринское поведение матерей остается неизменным при экспериментах с неонатальными булавочными уколами. Эта тенденция распространялась и на нематеринское поведение. Кроме того, прибавка в весе недоношенных пометов в период стимуляции булавочным уколом существенно не различалась между контрольной и булавочной группами. Анализ порога изъятия лап показал заметное снижение числа как самцов, так и самок из групп булавочных уколов и CFA по сравнению с контрольными группами. Особенно поразительным было наблюдение дальнейшего снижения порога отведения лапы через 4 ч после инъекции КФА в группе с булавочным уколом/КФА по сравнению с контрольной группой/КФА. Эти детальные результаты подчеркивают многогранное влияние неонатальной стимуляции булавочным уколом на поведение матерей, увеличение веса помета и ноцицептивные реакции у потомства, подчеркивая важность учета как преждевременных, так и доношенных состояний при интерпретации результатов.

Наше исследование ноцицептивных реакций согласуется с выводами de Carvalho et al.26 и расширяет их, которые сообщили об изменениях в ноцицептивных реакциях и воспалительной гиперчувствительности во взрослом возрасте в результате повторяющейся стимуляции булавочным уколом у недоношенного потомства. Такая конвергенция результатов подчеркивает устойчивое влияние неонатального опыта на ноцицептивные пути, подчеркивая надежность этих исходов во всех исследованиях. Наблюдаемая повышенная чувствительность к вредным стимулам как у самцов, так и у самок, подвергшихся неонатальной стимуляции булавочным уколом, свидетельствует о последовательной тенденции в модуляции ноцицептивных реакций, что еще больше способствует нашему пониманию долгосрочных последствий стрессоров в раннем возрасте.

Результаты этого исследования также согласуются с работой Gieré et al.27, которые изучали ноцицептивную гиперчувствительность у взрослых крыс после разлучения новорожденных с матерью. Их исследование показало центральное происхождение ноцицептивной гиперчувствительности, укрепив представление о том, что стрессоры в раннем возрасте могут вызывать устойчивые изменения в механизмах обработки боли. Конвергенция результатов подчеркивает сложное взаимодействие между событиями в раннем возрасте и ноцицептивными реакциями, что еще больше подчеркивает необходимость всестороннего понимания центральных механизмов, способствующих долгосрочным изменениям болевой чувствительности.

Влияние переживаний в раннем возрасте на ноцицептивные пути также подтверждается выводами Chang et al.28, которые исследовали изменения в функциональных болевых связях в соматосенсорной и медиальной префронтальной коре крыс после переживаний боли в раннем возрасте. Их работа выявила долгосрочные изменения в механизмах обработки боли, вызванные стрессорами в раннем возрасте, подчеркнув важность понимания нейронных коррелятов ноцицептивных реакций. Интеграция этих результатов с наблюдениями за повышенной чувствительностью к вредным стимулам у недоношенных детей, подвергшихся неонатальной стимуляции булавочным уколом, способствует более полному пониманию устойчивых последствий болевых переживаний в раннем возрасте для болевых контуров взрослых.

Кроме того, van den Hoogen et al.29 продемонстрировали, что повторная стимуляция прикосновением и уколом иглой в неонатальном периоде увеличивала исходную механическую чувствительность и посттравматическую гиперчувствительность в чувствительных нейронах взрослого позвоночника. Текущие результаты, согласующиеся с предыдущими исследованиями, подчеркивают долгосрочные последствия неонатальной боли для ноцицептивных путей. В совокупности эти исследования подчеркивают важность признания долгосрочного влияния опыта раннего возраста на болевую чувствительность у взрослых, способствуя всестороннему пониманию сложного взаимодействия между неонатальными стимулами и ноцицептивными реакциями.

Сочетая преждевременные роды с воздействием болевых раздражителей в неонатальный период, мы разработали модель, которая в точности имитирует ранний жизненный опыт недоношенных детей, учитывая императивную потребность в интенсивной терапии, необходимую в связи с недоношенностью. Тем не менее, трансляционная значимость этой модели, особенно в отношении опыта недоношенных детей в ОРИТН, требует дальнейшего разъяснения. Примечательно, что не было найдено исследований, в которых использовалась модель, аналогичная той, которая использовалась в настоящем исследовании. Однако, рассматривая первые дни жизни (1-2) как репрезентацию недоношенности, предыдущие исследования показали, что самцы демонстрируют большую уязвимость к ноцицептивным стимулам, чем женщины, в этот критический период. Эта уязвимость была подтверждена с помощью ноцицептивных тестов, применяемых во взрослом возрасте, что частично обосновало наблюдаемые результатыданного исследования.

В настоящем исследовании впервые было использовано использование недоношенных животных, рожденных путем кесарева сечения на 19 день беременности, для оценки ноцицептивного порога во взрослом возрасте. Эта новая модель для изучения боли у недоношенных новорожденных дает уникальный взгляд на эту популяцию. Эта модель поднимает новые вопросы, касающиеся ноцицептивных тестов, таких как тест фон Фрея, у взрослых животных обоих полов, а также всех аспектов, связанных с ноцицептивными порогами этих животных, будь то в неонатальном периоде или во взрослом возрасте.

В то время как текущее исследование в первую очередь было сосредоточено на влиянии неонатальных стимулов булавочного укола на болевой порог на более поздних этапах жизни, существует многообещающее направление для расширения этого исследования на вмешательства и стратегии постнатального обезболивания. Будущие исследования могут оценить эффективность различных вмешательств по лечению боли на модели недоношенных крыс, изучая потенциальные пути смягчения долгосрочных последствий неонатальной боли. Это может включать в себя изучение новых подходов к обезболиванию, оценку продолжительности и интенсивности необходимых вмешательств, а также изучение основных механизмов, влияющих на эффективность этих вмешательств.

В заключение следует отметить, что всестороннее исследование, проведенное в этом исследовании, было направлено на анализ сложного взаимодействия неонатальной стимуляции булавочным уколом, поведения матери и условий преждевременных родов на ноцицептивные реакции у потомства. Тщательный анализ материнского поведения в сочетании с исключением потенциальных мешающих факторов, таких как преждевременные роды и усыновление, подтвердил устойчивость материнского поведения к введенному ноцицептивному стимулу. Прибавка в весе недоношенных пометов осталась неизменной, что указывает на то, что наблюдаемые изменения в ноцицептивных реакциях во взрослом возрасте, скорее всего, связаны со стимуляцией булавочным уколом в раннем возрасте, чем с материнской заботой или развитием потомства. Результаты этого исследования согласуются с литературой о долгосрочных последствиях неонатальных болевых переживаний, подчеркивая повышенную чувствительность к вредным раздражителям во взрослом возрасте. Кроме того, изучение потенциальных механистических теорий, включая изменения в нейронной обработке и функции глюкокортикоидных рецепторов, дает ценную информацию о основных путях, способствующих ноцицептивным изменениям. В совокупности представленные здесь результаты и результаты предыдущих исследований подчеркивают сложность опыта ноцицептивных путей в раннем возрасте, проливая свет на долгосрочные последствия неонатальных стимулов для болевых контуров у взрослых. Несмотря на то, что дальнейшие исследования необходимы для выяснения нюансов, лежащих в основе исследования, это исследование вносит свой вклад в растущий объем знаний, направленных на выявление долгосрочного влияния событий в раннем возрасте на ноцицептивные реакции у взрослого потомства.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Федеральным университетом Алфенаса - UNIFAL-MG и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Бразилия (CAPES Fellowship, Laura Pereira Generoso; Натали Ланге Кандидо и Мария Габриэла Мазьеро Капелло) - Финансовый код 001.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,9% раствор NaClConcare, Бразилия
Акриловые клетки (42 см & 24 см & раз 15 см) с проволочной сеткойПолы Insight Equipamentos, Бразилия
Complete Freund's Adjuvant (CFA)  Sigma Aldrich, Brazil
Electronic von Frey,InsightEquipamentos, Бразилия
H2O2 (перекись водорода)ACS Cientifica, Бразилия
Инфракрасное освещениеCarci, Бразилия
Isoflurane (2%)Cristá lia, Бразилия
Вертикальный микроскопNikon, БразилияECLIPSE EiМикроскоп с 10-кратным и 40-кратным объективом

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neonatal complete Freund's adjuvant-induced inflammation does not induce or alter hyperalgesic priming or alter adult distributions of C-fibre dorsal horn innervation. Pain Reports. 5 (6), e872(2020).">Cooper, A. H., Hanmer, J. M., Chapman, V., Hathway, G. J. Neonatal complete Freund's adjuvant-induced inflammation does not induce or alter hyperalgesic priming or alter adult distributions of C-fibre dorsal horn innervation. Pain Reports. 5 (6), e872(2020).
  2. Inflammatory neonatal pain disrupts maternal behavior and subsequent fear conditioning in a rodent model. Developmental Psychobiology. 62 (1), 88-98 (2020).">Davis, S. M., Rice, M., Burman, M. A. Inflammatory neonatal pain disrupts maternal behavior and subsequent fear conditioning in a rodent model. Developmental Psychobiology. 62 (1), 88-98 (2020).
  3. Neonatal pain and reduced maternal care alter adult behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal axis reactivity in a sex-specific manner. Developmental Psychobiology. 62 (5), 631-643 (2020).">Mooney-Leber, S. M., Brummelte, S. Neonatal pain and reduced maternal care alter adult behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal axis reactivity in a sex-specific manner. Developmental Psychobiology. 62 (5), 631-643 (2020).
  4. Experiencing early life maternal separation increases pain sensitivity in adult offspring. International Journal of Developmental Neuroscience. 62, 8-14 (2017).">Vilela, F. C., Vieira, J. S., Giusti-Paiva, A., Silva, M. L. D. Experiencing early life maternal separation increases pain sensitivity in adult offspring. International Journal of Developmental Neuroscience. 62, 8-14 (2017).
  5. Repeated neonatal needle-prick stimulation increases inflammatory mechanical hypersensitivity in adult rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 78, 191-197 (2019).">de Carvalho, R. C., et al. Repeated neonatal needle-prick stimulation increases inflammatory mechanical hypersensitivity in adult rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 78, 191-197 (2019).
  6. Epidemiology and treatment of painful procedures in neonates in intensive care units. JAMA. 300 (1), 60-70 (2008).">Carbajal, R., et al. Epidemiology and treatment of painful procedures in neonates in intensive care units. JAMA. 300 (1), 60-70 (2008).
  7. The impact of cumulative pain/stress on neurobehavioral development of preterm infants in the NICU. Early Human Development. 108, 9-16 (2017).">Cong, X., et al. The impact of cumulative pain/stress on neurobehavioral development of preterm infants in the NICU. Early Human Development. 108, 9-16 (2017).
  8. Noise levels of neonatal high-flow nasal cannula devices - An in-vitro study. Neonatology. 103 (4), 264-267 (2013).">König, K., Stock, E. L., Jarvis, M. Noise levels of neonatal high-flow nasal cannula devices - An in-vitro study. Neonatology. 103 (4), 264-267 (2013).
  9. Measuring preterm cumulative stressors within the NICU: the Neonatal Infant Stressor Scale. Early Human Development. 85 (9), 549-555 (2009).">Newnham, C. A., Inder, T. E., Milgrom, J. Measuring preterm cumulative stressors within the NICU: the Neonatal Infant Stressor Scale. Early Human Development. 85 (9), 549-555 (2009).
  10. Development, evaluation and adaptation of a critical realism informed theory of procedural pain management in preterm infants: The PAIN-Neo theory. Journal of Advanced Nursing. 79 (6), 2155-2166 (2023).">De Clifford-Faugère, G., Aita, M., Arbour, C., Colson, S. Development, evaluation and adaptation of a critical realism informed theory of procedural pain management in preterm infants: The PAIN-Neo theory. Journal of Advanced Nursing. 79 (6), 2155-2166 (2023).
  11. Nitric oxide production in the striatum and cerebellum of a rat model of preterm global perinatal asphyxia. Neurotoxicity Research. 31 (3), 400-409 (2017).">Barkhuizen, M., et al. Nitric oxide production in the striatum and cerebellum of a rat model of preterm global perinatal asphyxia. Neurotoxicity Research. 31 (3), 400-409 (2017).
  12. Effect of prenatal steroidal inhibition of sPLA2 in a rat model of preterm lung. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 36, 31-36 (2016).">Remesal, A., et al. Effect of prenatal steroidal inhibition of sPLA2 in a rat model of preterm lung. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 36, 31-36 (2016).
  13. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist pioglitazone reduces the development of necrotizing enterocolitis in a neonatal preterm rat model. Pediatric Research. 81 (2), 364-368 (2017).">Corsini, I., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist pioglitazone reduces the development of necrotizing enterocolitis in a neonatal preterm rat model. Pediatric Research. 81 (2), 364-368 (2017).
  14. A preterm rat model for immunonutritional studies. Nutrients. 11 (5), 999(2019).">Grases-Pintó, B., et al. A preterm rat model for immunonutritional studies. Nutrients. 11 (5), 999(2019).
  15. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).">Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  16. Establishment of the patent ductus arteriosus model in preterm rats. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics. 18, 372-375 (2016).">Zhu, M. -R., Liu, H. -Y., Liu, P. -P., Wu, H. Establishment of the patent ductus arteriosus model in preterm rats. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics. 18, 372-375 (2016).
  17. Growth hormone treatment after cesarean delivery in rats increases the strength of the uterine scar. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 185 (3), 614-617 (2001).">Bowers, D., McKenzie, D., Dutta, D., Wheeless, C. R., Cohen, W. R. Growth hormone treatment after cesarean delivery in rats increases the strength of the uterine scar. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 185 (3), 614-617 (2001).
  18. Whey peptides improve wound healing following caesarean section in rats. The British Journal of Nutrition. 104 (11), 1621-1627 (2010).">Wang, J., et al. Whey peptides improve wound healing following caesarean section in rats. The British Journal of Nutrition. 104 (11), 1621-1627 (2010).
  19. Magnetic resonance imaging of pulmonary damage in the term and premature rat neonate exposed to hyperoxia. Pediatric Research. 50 (4), 502-507 (2001).">Appleby, C. J., Towner, R. A. Magnetic resonance imaging of pulmonary damage in the term and premature rat neonate exposed to hyperoxia. Pediatric Research. 50 (4), 502-507 (2001).
  20. Long-term behavioral effects of repetitive pain in neonatal rat pups. Physiology & Behavior. 66 (4), 627-637 (1999).">Anand, K. J., Coskun, V., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term behavioral effects of repetitive pain in neonatal rat pups. Physiology & Behavior. 66 (4), 627-637 (1999).
  21. Extra-territorial pain in rats with a peripheral mononeuropathy: mechano-hyperalgesia and mechano-allodynia in the territory of an uninjured nerve. Pain. 57 (3), 375-382 (1994).">Tal, M., Bennett, G. J. Extra-territorial pain in rats with a peripheral mononeuropathy: mechano-hyperalgesia and mechano-allodynia in the territory of an uninjured nerve. Pain. 57 (3), 375-382 (1994).
  22. Neonatal repetitive pain in rats leads to impaired spatial learning and dysregulated hypothalamic-pituitary-adrenal axis function in later life. Scientific Reports. 6 (1), 39159(2016).">Chen, M., et al. Neonatal repetitive pain in rats leads to impaired spatial learning and dysregulated hypothalamic-pituitary-adrenal axis function in later life. Scientific Reports. 6 (1), 39159(2016).
  23. Continuous central infusion of cannabinoid receptor agonist WIN 55,212-2 decreases maternal care in lactating rats: consequences for fear conditioning in adulthood males. Behavioural Brain Research. 257, 31-38 (2013).">Costa, H. H., Vilela, F. C., Giusti-Paiva, A. Continuous central infusion of cannabinoid receptor agonist WIN 55,212-2 decreases maternal care in lactating rats: consequences for fear conditioning in adulthood males. Behavioural Brain Research. 257, 31-38 (2013).
  24. The CB1 cannabinoid receptor mediates glucocorticoid-induced effects on behavioural and neuronal responses during lactation. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (8), 1197-1207 (2013).">Vilela, F. C., Ruginsk, S. G., de Melo, C. M., Giusti-Paiva, A. The CB1 cannabinoid receptor mediates glucocorticoid-induced effects on behavioural and neuronal responses during lactation. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (8), 1197-1207 (2013).
  25. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).">Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
  26. Effects of repetitive pinprick stimulation on preterm offspring: Alterations in nociceptive responses and inflammatory hypersensitivity in adulthood. Behavioural Brain Research. 454, 114633(2023).">de Carvalho, R. C., et al. Effects of repetitive pinprick stimulation on preterm offspring: Alterations in nociceptive responses and inflammatory hypersensitivity in adulthood. Behavioural Brain Research. 454, 114633(2023).
  27. Towards a central origin of nociceptive hypersensitivity in adult rats after a neonatal maternal separation. The European Journal of Neuroscience. 58 (10), 4155-4165 (2023).">Gieré, C., et al. Towards a central origin of nociceptive hypersensitivity in adult rats after a neonatal maternal separation. The European Journal of Neuroscience. 58 (10), 4155-4165 (2023).
  28. Early life pain experience changes adult functional pain connectivity in the rat somatosensory and the medial prefrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 42 (44), 8284-8296 (2022).">Chang, P., Fabrizi, L., Fitzgerald, M. Early life pain experience changes adult functional pain connectivity in the rat somatosensory and the medial prefrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 42 (44), 8284-8296 (2022).
  29. Repeated touch and needle-prick stimulation in the neonatal period increases the baseline mechanical sensitivity and postinjury hypersensitivity of adult spinal sensory neurons. Pain. 159 (6), 1166-1175 (2018).">vanden Hoogen, N. J., et al. Repeated touch and needle-prick stimulation in the neonatal period increases the baseline mechanical sensitivity and postinjury hypersensitivity of adult spinal sensory neurons. Pain. 159 (6), 1166-1175 (2018).
  30. Long-term effects of neonatal pain and stress on reactivity of the nociceptive system. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 161 (6), 755-758 (2016).">Butkevich, I. P., Mikhailenko, V. A. Long-term effects of neonatal pain and stress on reactivity of the nociceptive system. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 161 (6), 755-758 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Preterm Rat ModelPain SensitivityNeonatal PainPinprick StimulationMechanical HypersensitivityInflammatory HypersensitivityMaternal BehaviorGlucocorticoid ReceptorsHysterectomy ProcedureFoster Adoption

Related Articles