В этом протоколе описывается метод эксплантации мембраны круглого окна из височных костей морских свинок, что является ценным ресурсом для исследований ex vivo .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эксплантация мембраны с круглым окном морской свинки для исследований ex vivo
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эффективная и минимально инвазивная доставка лекарств во внутреннее ухо представляет собой серьезную проблему. Мембрана круглого окна (RWM), являющаяся одной из немногих точек входа во внутреннее ухо, стала жизненно важным объектом исследований. Однако из-за сложностей выделения RWM наше понимание его фармакокинетики остается ограниченным. RWM состоит из трех отдельных слоев: наружного эпителия, среднего слоя соединительной ткани и внутреннего эпителиального слоя, каждый из которых потенциально обладает уникальными свойствами доставки.
Современные модели для исследования переноса через RWM используют модели животных in vivo или модели ex vivo RWM, которые полагаются на клеточные культуры или фрагменты мембран. Морские свинки служат валидированной доклинической моделью для исследования фармакокинетики лекарств во внутреннем ухе и являются важной животной моделью для трансляционной разработки средств доставки в улитку. В этом исследовании мы описываем подход к эксплантации RWM морской свинки с окружающей кохлеарной костью для экспериментов по настольной доставке лекарств. Этот метод позволяет сохранить исходную архитектуру RWM и может обеспечить более реалистичное представление транспортных барьеров по сравнению с текущими настольными моделями.
Введение
Появились новые классы терапевтических средств для лечения нейросенсорной тугоухости. Трансляция этих терапевтических препаратов в клинические популяции ограничена безопасными и эффективными путями транспортировки во внутреннее ухо. Современные методы доставки in vivo в исследованиях на животных основаны либо на фенестрации во внутреннем ухе, либо на диффузии через мембрану круглого окна (RWM), бескостный барьер, который отделяет пространство среднего уха от улитки1.
Хирургическая фенестрация и микроинъекция во внутреннее ухо являются инвазивными и могут представлять опасность для остаточной функции внутреннего уха2. Таким образом, RWM является важным маршрутом для местной доставки лекарств, а морские свинки являются основной доклинической моделью на животных, используемой для изучения фармакокинетики местных лекарств в RWM и во внутреннем ухе для фармацевтических разработок 3,4. Несмотря на то, что морская свинка тоньше RWM, она имеет идентичную трехслойную структуру. Он имеет диаметр около 1 мм, толщину 15-25 мкм и состоит из двух слоев эпителиальных клеток, скрепляющих слой соединительной ткани5. Эпителиальный слой, обращенный к среднему уху, плотно упакован и соединен плотными соединениями, в то время как слой, обращенный к внутреннему уху и scala tympani, имеет более рыхлую архитектуру и не имеет значительных межклеточных спаек.
Современные доклинические исследования, изучающие лекарственную проницаемость RWM морских свинок, основаны на инъекциях в среднее ухо in vivo с последующим забором проб перилимфатической жидкости во внутреннем ухе, что не позволяет провести специфическое исследование транспорта RWM 6,7. Фрагменты эксплантов RWM использовались в доклинических исследованиях, но из-за своей хрупкости и небольшого размера они не подходят для систематических микрофлюидных исследований транспортировки лекарств и транспортных средств, требующих водонепроницаемого уплотнения через RWM2. Другие группы использовали модели in vitro с культивируемыми эпителиальными клетками человека, чтобы приблизиться к RWM 8,9,10. Тем не менее, большинство этих конструкций сосредоточены исключительно на внешнем эпителиальном слое и не отражают сложность архитектуры нативной ткани. Для более детального понимания механизмов транспортировки в RWM необходимы целевые исследования ex vivo.
В данном исследовании мы демонстрируем эксплантацию RWM морской свинки с окружающей костной опорой для сохранения целостности мембраны и иллюстрируем их использование в экспериментальной парадигме, предназначенной для специфического изучения RWM-транспорта транспортных средств доставки лекарств.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (GP18M226). В настоящем исследовании использовались морские свинки-альбиносы Хартли (как самцы, так и самки, массой 500-700 г).
1. Настройка и подготовка процедуры
- Перед началом эксперимента простерилизуйте все инструменты окисью этилена.
- Усыпляйте животных в соответствии с утвержденным в учреждении протоколом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании для высвобождения 100% углекислого газа (CO2) из коммерческого баллона использовалась камера без предварительного заряда. Для регулирования потока газа использовался встроенный рестриктор, поддерживающий его в диапазоне от 30% до 70% объема камеры в минуту в соответствии с Руководящими принципами AVMA11 2020 года. - Поместите животное в камеру и дозируйте углекислый газ в течение 5 мин. ПотокСО2 поддерживается в течение 1 мин после остановки дыхания.
- Выполните обезглавливание после остановки дыхания, чтобы обеспечить эвтаназию.
2. Хирургический доступ и эксплантация
- Извлеките височную кость из черепа морской свинки обычным способом12. Удалите лишние мягкие ткани с помощью ронжера. Определите наружный слуховой проход, височную буллу и лицевой канал13 (рисунок 1).
- Просверлите вентральные аспекты височной буллы алмазным сверлом диаметром 6 мм (см. таблицу материалов), обнажив пространство среднего уха и наружный слуховой проход по окружности.
- С помощью ронжеров аккуратно удаляют наружный слуховой проход и барабанное кольцо, одновременно разделяя инкудомаллеолярный сустав. Определите наковальню, инкудостапедиальный сустав, улитку, горизонтальный полукружный канал и лицевой канал13 (рисунок 2А).
- Отделите инкудослентидальный сустав и удалите нарез с помощью щипцов. Определите костную нишу круглого окна.
- С помощью алмазной коронки диаметром 6 мм просверлите костную пластинку, соединяющую улитку с медиальной стенкой барабанной полости по направлению к тензорному барабанному каналу. Осторожно декомпрессируйте костный канал тензорной барабанной перепонки и удалите тензорную барабанную мышцу с помощью иглы 28 G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Медиальная стенка тензорной ямки барабанной перепонки соединяется непосредственно с кохлеарной костью вокруг RWM, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы не вызвать переломов, которые могут распространиться на круглое окно. - Просверлите костную пластинку, соединяющую улитку с нижней стенкой барабанной полости, пока не останется 1 мм костного выступа, примыкающего к улитке (рисунок 2B).
- С помощью алмазной коронки диаметром 2 мм (см. Таблицу материалов) сделайте кохлеостомию на базальном повороте улитки, оставив примерно 2 мм кости до круглого окна. Продолжайте кохлеостомию снизу в плоскости, параллельной круглой оконной мембране, чтобы отделить основание от верхушки улитки.
- Удлинить кохлеостомический разрез через основание черепа, которое намного плотнее, в результате чего получается поперечный срез базального поворота улитки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Направление сверла к проходу внутреннего слухового прохода приводит к траектории, которая максимизирует удаление костной ткани, избегая при этом слишком близкого прохождения к круглому окну. - Осмотрите образец со стороны основания черепа и, если это еще не сделано, определите внутренний слуховой проход и просверлите отверстие улитки. Удалите улитковый нерв иглой 28 G.
- Осмотрите образец с внутрикохлеарной стороны. Определите и удалите костную спиральную пластинку в базальном витке и оставшийся модиол щипцами или иглой 28 G.
- Обильно орошают единую полостную полосу преддверия, чтобы удалить мусор. Круглое окно должно быть хорошо видно из места кохэктомии без каких-либо вышележащих обломков (рис. 2C).
- Далее осмотрите образец со стороны среднего уха. Просверлите боковой полукружный канал и лицевой канал до уровня овального окна. Аккуратно удалите стремечко с помощью щипцов, обнажив овальную оконную нишу. Следует отметить, что между корами стремечков есть костяной мостик, известный как crista stapedis.
- С помощью алмазного сверла диаметром 1 мм (см. Таблицу материалов) откройте тамбур дальше, удлинив овальное окно вдоль лицевой стороны круглого окна, стараясь сохранить 1-2 мм кохлеарной кости, примыкающей к круглой оконной нише (рис. 2D).
- Завершите разрезы височной кости, соединив овальные разрезы окна с разрезами кохлектомии по обе стороны круглого окна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за хрупкости кохлеарной кости сохранение тензорной ямки барабанной перепонки в образце и избегание разрезов через нее поможет предотвратить переломы кохлеарной кости, которые распространяются на RWM и нарушают ее целостность. - Сделайте последние прикрепления к плотной кости основания черепа, прилегающей к внутреннему слуховому проходу, и аккуратно сбрите, чтобы получить иссеченный образец RWM (Рисунок 3A).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как показано на рисунке 3А, этот метод позволяет эксплантировать неповрежденную круглую оконную мембрану морской свинки с окружающим кольцом из жесткой кости. RWM должен быть полностью соединен с костным кольцом по окружности. Переломы кохлеарной кости не должны быть оценены по достоинству. По сравнению с человеческими экземплярами с круглым окном, морская свинка RWM не имеет вышележащей псевдомембраны. Кроме того, в отличие от людей, между корой стремени морской свинки есть костный мостик, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
При локальной доставке лекарств в ухо RWM является основным путем прохождения терапевтических препаратов во внутреннее ухо. Для лучшего понимания механизмов транспортировки и проницаемости новых средств доставки и разработки лекарств необходима точная и надежная настольная модель. В этом исследовании мы демонстрируем, что эксплантация RWM морской свинки является осуществимой и надежной процедурой, позволяющей проводить систематические исследования лекарственных и мембранных взаимодействий. Lundman et al. и Kelso et al., ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет никаких разглашений.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантами NIDCD No 1K08DC020780 и 5T32DC000027-33, а также Фондом исследований слуха им. Рубинштейна.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Алмазное шаровое сверло 1 мм | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 мм Алмазное шаровое сверло | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 мм Алмазное шаровое сверло | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Подойдет любая система сверления для резки костей |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. со съемным шприцем | BD Luer-Lok объемом 1 млБектон, Дикинсон и Ко. | 382903057894 | Любая игла 27-28 г |
| Gorilla Эпоксидная смола | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
Ссылки
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789(2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032(2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
