Методическая статья

Количественная оценка каллозы в растительных тканях с помощью ферментно-связанного иммуносуорбентного анализа/иммунофлуоресцентной спектрофотометрии

DOI:

10.3791/65833

⸱

22 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол количественно оценивает каллозу в растительных тканях с помощью специфического для мозоли метода иммунофлуоресцентной спектрофотометрии/ELISA, который основан на связывании каллозы в образцах растений с специфическими к мозоли антителам, а затем количественной оценке связанного каллозы с помощью ферментно-маркированных антител для обнаружения путём измерения ферментативной активности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существующие методы количественного определения каллозы из растительных тканей включают эпифлуоресцентную микроскопию, флуоресцентную спектрофотометрию, иммунофлуоресцентную микроскопию и косвенную оценку активности как кальлозинтазы, так и β-(1,3)-глюканазы. Однако некоторые из этих методов имеют значительные ограничения, среди которых трудоёмкие, неспецифические к мозоли, трудоёмкие, субъективные, высокая автофлуоресценция, низкая чувствительность, более качественные, а не количественные, а также необходимость приобретения программных ресурсов и технических навыков. Поэтому существует острая необходимость изучить альтернативные методы количественного определения каллозы в растительных тканях. Выдвигалась гипотеза, что иммунофлуоресцентная спектрофотометрия или ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), использующий мозолисто-специфические антитела, могут преодолеть некоторые ограничения современных методов количественной оценки каллозы. Биотический стресс применялся путём инокуляции банановых растений, полученных из тканевой культуры, Xanthomonas vasicola pv. бактерии musacearum (Xvm), которые индуцировали производство каллозы. Образцы ткани банановой клубки были собраны через 14 дней после инокуляции (dpi) для количественной оценки каллозы с использованием нового метода иммунофлуоресцентной спектрофотометрии. Выработка каллозы в клубнень групп, инокуленных Xvm, и контрольных групп значительно различалась в обоих генотипах бананов (независимый t-тест, p < 0,05). Метод иммунофлуоресцентной спектрофотометрии, описанный здесь, может быть применён для количественного определения каллозы в различных растительных тканях с высокой специфичностью к мозолю, чувствительностью, надёжностью и воспроизводимостью. Кроме того, использование пластины с 96 лунками делает этот метод подходящим для высокопроизводительных количественных исследований каллозы с минимальными смещениями выборки и анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Каллозе — это полисахарид из β-1,3-глюкана, природного соединения, содержащегося в клеточных стенках различных высших растений. Каллозе синтезируется кальлозинтазами (CalS) и разлагается β-(1,3)-глюканазами 1,2,3. Он участвует в нескольких биологических процессах, включая рост и развитие, а также реакцию на абиотические и биотическиестрессы 4,5,6. Во время заражения патогенами увеличение отложения каллозы в папиллах помогает предотвратить дальнейшую микробную колонизацию, выступая в роли барьера проницаемости между соседними клеткамирастений 2,4,7,8,9,10,11,12 . Замедляя инвазию патогена в поражённую ткань, отложение каллозы даёт время для индуцирования дополнительных защитныхреакций 13. Точное пространственно-временное количественное определение каллозы в растительных тканях крайне важно для понимания её роли в различных физиологических процессах. Однако современные методы количественной оценки каллозы из растительных тканей, включая эпифлуоресцентную микроскопию, иммунофлуоресцентную микроскопию и флуоресцентную спектрофотометрию, имеют значительные ограничения и задачи количественной оценки. Поэтому существует острая необходимость изучить альтернативные методы количественной оценки каллозы для преодоления этих недостатков. Выдвигалась гипотеза, что иммунофлуоресцентная спектрофотометрия или ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) могут предложить более эффективный метод количественной оценки каллозы в образцах растений, который включает высокую специфическую способность, чувствительность, надёжность, воспроизводимость и обеспечивает высокопроизводительный метод.

Золотой стандарт для количественной оценки каллозы включает визуализацию анилиновых синих частиц каллозы с помощью эпифлуоресцентноймикроскопии 14,15,16,17. Каллоза с анилиновым синим окрашением при возбуждении синих или ультрафиолетовых излучений выглядит в виде жёлтых флуоресцентных частиц, которые можно вручную посчитать для количества флуоресценционных частицкаллозы 14,15 или подсчитать с помощью автоматического программного обеспечения для подсчёта каллоз. Ручной подсчёт частиц каллозы — это трудоёмкий, трудоёмкий и субъективный дляисследователя, тогда как автоматический подсчет требует приобретения программных ресурсов и значительных технических навыков. Некоторые программы, используемые для автоматического подсчёта каллозы, включают ImageJ19, 20, 21, 22,Photoshop 23, CalloseMeasurer24,Icy 18, 25 и Ilastik26. Анилиновая синяя каллоза также может быть количественно измерена с помощью флуоресцентной спектрофотометрии 17,19,27,28,29. Однако высокий фон/автофлуоресценция, связанный с эпифлуоресцентной микроскопией и флуоресцентной спектрофотометрией, делает эти методы сложными и ненадёжными из-за низкого отношения сигнал/шум26. Кроме того, анилино-синий может окрашать другие β-1,3-глюканы, помимокаллозы 30, что делает как эпифлуоресцентную микроскопию, так и флуоресцентную спектрофотометрию для обнаружения и количественной оценки каллозы частично неспецифичными и ненадёжными. Метод иммунофлуоресцентной микроскопии для количественного определения каллозы, основанный на мозолисто-специфических антителах, также использовался в несколькихисследованиях 31, 32, 33. Хотя этот метод имеет некоторые недостатки эпифлуоресцентной микроскопии анилино-синего окрашенного мозоля, его преимущество является специфическим к мозоли благодаря используемым здесь антителам. Количественная оценка Каллозе также проводилась с использованием методов, основанных на активности ферментов. Методы количественной оценки кальлозы на основе активности ферментов включают оценку активности кальлозинтазы (CalS)20,33 и активности β-(1,3)-глюканазы34,35. Методы, основанные на активности ферментов, имеют ряд недостатков по сравнению с эпифлуоресцентной микроскопией, иммунофлуоресцентной микроскопией и флуоресцентной спектрофотометрией. К ним относятся косвенная оценка мозолей, сложность извлечения ферментов и их активности, а также отсутствие равномерного распределения каллозы в растительных тканях.

Из-за недостатков современных методов количественной оценки каллозы, включая эпифлуоресцентную микроскопию, иммунофлуоресцентную микроскопию, флуоресцентную спектрофотометрию, анализы CalS и β-(1,3)-глюканазы, возникла необходимость разработать новый метод количественной оценки каллозы, который дал бы ряд преимуществ, включая: 1) высокую специфичность, чувствительность, надёжность и воспроизводимость, а также более простую количественную оценку кальлозы с высокой пропускной способностью. Использование иммунофлуоресцентной спектрофотометрии для количественной оценки каллозы не исследовано. Здесь представлен новый метод количественной оценки каллозы на основе иммунофлуоресцентной спектрофотометрии, более конкретно — ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA). Метод можно оптимизировать для количественного определения каллозы в разных растениях или их тканях с хорошей степенью специфичности к мозолистым, точностью, воспроизводимостью и высокопроизводительными экспериментальными возможностями. Этот метод также может быть модифицирован для количественной оценки любого растительного аналита, если наличие антитела против этого аналита. Для обеспечения точного, эффективного и надёжного пространственно-временного распределения каллозы в растительных тканях рекомендуется одновременно использовать различные методы количественной оценки каллозы, включая микроскопию, спектрофотометрию и методы активности ферментов. В результате это позволит точно и эффективно понять роль каллозы в различных физиологических и стрессовых реакциях.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Инокуляция экспериментальных растений

  1. Изолировать, подготовить и подтвердить инокулюм Xvm по стандартнымпроцедурам 36, 37. Случайным образом выберите 10 двухмесячных растений Musa balbisiana и Mbwazirume, полученных из тканевой культуры, и инокулируйте спинную сторону самого молодого, полностью открытого черешка листья 200 мкл (1 x 108 клеток) подтверждённого ПЦР инокуля Xvm (Рисунок 1)38.
  2. Аналогично, случайным образом выберите 10 банановых растений Musa balbisiana и Mbwazirume и инокулируйте их 200 мкл стерильной дистиллированной воды (SDW).
  3. Поддерживайте банановые растения, инокуленные Xvm, и контролируйте их в аналогичных условиях в защитном доме с фотопериодом 12 часов света и 12 часов темноты при 25 °C, поливая их каждые 3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов и таблицу 1 для списка материалов и оборудования, а также рецепта буферов соответственно.

2. Отбор проб тканей клубнеков и подготовка образцов

  1. Проведите разрушительный отбор проб для получения образцов клубневиков из экспериментальных растений (рисунок 1).
  2. Быстро удалите примерно 2 г образцов клубовиков стерильными хирургическими лезвиями через 14 дней после инокуляции (dpi) и поместите их по отдельности в маркированные пробирки объёмом 50 мл. Сделайте это для всех 10 образцов, собранных с растений, инокуленных Xvm, и контрольных растений.
  3. Немедленно погрузите пробирки объемом 50 мл с образцами в жидкий азот.
  4. Транспортируйте образцы в лабораторию и храните их при -80 °C до готовности к работе. Храните образцы при −80 °C до 1 года и дольше с минимальными циклами замораживания и оттаивания.
  5. Сублимационная сушка образцов в течение 72 часов с помощью сублимационной сушилки (рисунок 1).
  6. Поместите ровно 30 мг сублимированных образцов в пробирки объемом 2 мл, содержащие 2 стальные велосипедные шарики, и измельчите их в мелкий порошок, установив скорость 5 в течение 1 минуты (рисунок 1).
  7. Храните измельчённые образцы в прохладной сухой среде комнатной температуры, хорошо запечатанные до готовности к использованию. Храните измельчённые образцы при комнатной температуре до 4 месяцев или при −80 °C до 1 года с минимальными циклами заморозки-оттаивания39,40.

3. Извлечение каллозы и подготовка ламинариновых стандартов и заготовок

  1. Для извлечения каллозы из 30 мг измельчённого образца клубничества добавьте 800 мкл 1 М NaOH и инкубировать 30 минут при 80 °C в водяной бане, с редкими вихрями через каждые10 минут 27,41 (Рисунок 1, Шаг 6).
  2. Дайте образцам остыть до комнатной температуры (примерно 5 минут), затем центрифугуйте при 15 294 x g в течение 5 минут.
  3. Переведите супернатант (экстракт каллозы) в стерильную трубку объёмом 2 мл и разведите с блокирующим буфером (Таблица 1) в соотношении 1:2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте коэффициент разбавления на основе предварительных экспериментов и оптимизации. Разбавление экстракта каллозы может быть как необходимо, так и нет. При необходимости разбавление следует проводить в блокирующем буфере, а коэффициент разбавления оптимизировать для разных типов образцов, чтобы он попадал в диапазон стандартной кривой.
  4. Храните экстракты каллозы при -20 °C, пока не будете готовы приступить к работе. Храните экстракт каллозы до 6 месяцев с минимальными циклами заморозки и размораживания.
  5. Приготовьте концентрированный запас стандартного ламинарина в концентрации 100 мг/мл при 1 M NaOH 6,42,43,44,45.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ламинарин — это полимер 1-3-β глюкана, который может использоваться как стандарт для эквивалентов каллозы в иммунофлуоресцентной спектрофотометрии.
  6. Инкубировать полученную суспензию стандарта при 80 °C в водяной бане, аккуратно встряхивая её с интервалами, пока весь ламинарин полностью не растворится (примерно 20-40 минут).
  7. Охладите растворённый стандарт до комнатной температуры (примерно 10 минут).
  8. Подготовьте стандарты ламинаринов в концентрациях 80 мг/мл, 60 мг/мл, 40 мг/мл, 20 мг/мл, 10 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,01 мг/мл, начиная с концентрированного запаса 100 мг/мл.
  9. Подготовьте заготовки, смешивая 1 M NaOH и блокирующий буфер в соотношении 1:2. Если требуется разбавление, используйте то же соотношение разбавления, что и для приготовления экстракта каллозы.
  10. Храните стандарты ламинарина и заготовки при −20 °C. Храните стандарты и заготовки до 6 месяцев с минимальными циклами заморозки и оттаивания.

4. Количественная оценка Каллозе с помощью иммунофлуоресцентной спектрофотометрии

  1. Добавьте 100 мкл первичного антитела (1-3-β-глюкан-ориентированный мышей IgG), приготовленного с помощью буфера покрытия (Таблица 1), в каждую из 96 лунок полистироловых пластин ИФА (Рисунок 2).
  2. Плотно запечатайте тарелку керофиновой пленкой и инкубуйте её на ночь при 4 °C в холодильнике.
  3. На следующий день поставьте тарелку на скамейку и дайте ей достичь комнатной температуры (примерно 10 минут).
  4. Постирайте тарелку по стандартным процедурам промоканияи мытья 46. Кратко: добавьте 200 мкл буфера для промывания (Таблица 1) в колодцы, заведите вихрь при 500 об/мин в течение 30 секунд с помощью цифрового шейкера и промокните на папиросной бумаге. Повторите этот процесс промывания дважды (рисунок 2). Убедитесь, что колодцы не высохнут полностью, и используйте стерильный наконечник микропипетки, чтобы удалить пузырьки в колодцах, не касаясь основания и стенок.
  5. Добавьте 200 мкл блокирующего буфера в каждую скважину (рисунок 2) и плотно запечатайте пластину парафиновой пленкой. Инкубировать её 4 часа при 37 °C. Помой тарелку, как было сказано выше (рисунок 2).
  6. Добавьте 100 мкл экстракта каллозы из 10 инокуляционных Xvm и 10 контрольных установок в назначенные скважины. Добавьте 100 мкл стандарта ламинарина в другие скважины. Добавьте 100 мкл заготовки в другие скважины (рисунок 2).
  7. Плотно запечатайте тарелку керофиновой пленкой и инкубуйте ночью при 4 °C в холодильнике. Промой тарелку ещё раз, как было указано выше (рисунок 2).
  8. Добавьте 100 мкл первичного антитела (1-3-β-глюкан-ориентированного мышиного IgG), приготовленного с помощью блокирующего буфера, в каждую из колодцев (см. рисунок 2).
  9. Плотно запечатайте пластину парафиновой пленкой и инкубуйте 4 часа при 37 °C, затем промыйте пластину, как указано выше (рисунок 2).
  10. Добавьте 100 мкл вторичного антитела противомышиного IgG-щелочного фосфатазного антитела в каждую яму, 46,47 (рисунок 2).
  11. Плотно запечатайте тарелку парафиновой пленкой и инкубируете ночью при 4 °C в холодильнике. Затем помойте тарелку, как указано выше (рисунок 2).
  12. Добавьте 100 мкл свежеприготовленного раствора пара-нитрофенилфосфата (pNPP) при концентрации 1 мг/мл (Таблица 1) в колодцы (Рисунок 2)
  13. Инкубировать тарелку на столе при комнатной температуре 30 минут48 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться в зависимости от образцов растений и используемого стандарта. В этом исследовании ламинарин показал лучшие показатели — 30 минут.
  14. Прекратите реакцию, добавив 100 мкл свежеприготовленного стоп-раствора (0,5 М NaOH) в каждуюиз колодец 48 (см. рисунок 2).
  15. Перенесите пластину на считыватель микропластин (уравновешенный до 37 °C), встряхните её на средней скорости 1 минуту и считайте поглощение при 405нм 48 (см. рисунок 1, рисунок 2).

5. Анализ данных

  1. Выполните простую линейную регрессию поглощения ламинарина при 405 нм по концентрации ламинарина (мкг/мл), чтобы получить стандартную кривую. Уравнение стандартной кривой выглядит
    Y = β1X + β0
    где Y обозначает поглощение ламинарина на 405 нм,β 1 — наклон регрессионной линии (коэффициент корреляции Пирсона), X — Log10 (концентрация ламинарина в мкг/мл), аβ 0 — y-пересечение.
  2. Вычислите концентрацию каллозы в образцах клубневок, вычитая поглощение заготовки от поглощения образцов. Затем используйте стандартную кривую для оценки концентрации каллозы в мкг/мл как ламинаринового эквивалента (LE).
  3. Проверьте все данные на нормальность распределения с помощью теста Шапиро-Уилка и проверьте гомоскедастичность дисперсий с помощью теста Левена (α > 0,05).
  4. Используйте независимый t-тест образца для сравнения образования каллозы между группами, инокуляционными Xvm, и контрольными группами (p≤ 0.05).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известные концентрации стандартов ламинарина были проанализированы с помощью спектрофотометрии и зафиксированы соответствующие значения поглощения. Используя эти данные, был построен график Бира-Ламберта путём нанесения концентраций стандартов ламинарина по оси x и поглощения по оси y. Уравнение регрессионной линии было y = 0,5079x − 0,04534 (рисунок 3)49. График Бира-Ламберта дал высокий коэффициент корреляции (r) 0,9988 и коэффициент определения (r2) 0,9975, что указывает на сильную линейную связь между концентрацией и поглощением, а до 0,9975 дисперсии зависимой переменной (поглощение) объяснялось независимой переменной (концентрацией; Рисунок 3; стр<0.0001). Поэтому эта модель хорошо подходила, была точной и надёжной для прогнозирования концентрации ламинарина и мозолей. Концентрация каллозы в образцах банановой клубнины определялась путём измерения поглощения образцов клубовины с помощью спектрофотометрии и использования значений поглощения для расчёта концентраций каллозы с помощью уравнения.

Иммунофлуоресцентный спектрофотометрический анализ показал значительное увеличение индуцированной каллозы у растений, инокуленных Xvm, по сравнению с контрольной группой по обоим банановым генотипам (независимый образец t-тест, p < 0,05; Рисунок 4). Производство каллозы на контрольных установках при 14 dpi составляло 1474,34 мг/мл и 1037,11 мг/мл для Mbwazirume и M. balbisiana соответственно (Рисунок 4). Инокуляция растений Xvm привела к получению 4190,78 мг/мл и 1996,07 мг/мл каллозы в клубнениках Xvm-инокуленных Mbwazirume и M. balbisiana с частотой 14 dpi соответственно (рисунок 4). Инокуляция Xvm вызвала в 1,9–2,8 раза большее производство каллозы по сравнению с контрольными установками (независимый образец t-тест, p < 0,001; Рисунок 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация основных этапов количественной оценки каллозы с помощью нового метода иммунофлуоресцентной спектрофотометрии. Этот рисунок демонстрирует основные этапы количественной оценки каллозы из банановых тканей, включая выращивание растений, полученных из тканевой культуры, инокуляцию Xvm, разрушительный отбор проб тканей клубовины, сублимацию образцов, экстракцию каллозы и количественную оценку каллозы с помощью нового метода иммунофлуоресцентной спектрофотометрии. Эта цифра была переизданав 50 годах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Подробная схематическая иллюстрация метода иммунофлуоресцентной спектрофотометрии для количественной оценки каллозы. Этот рисунок подробно демонстрирует метод иммунофлуоресцентной спектрофотометрии для количественной оценки каллозы, показывающий, как пластина ELISA нагружена различными компонентами и как каллоза в конечном итоге количественно измеряется спектрофотометрией. Эта цифра была переизданав 50 годах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Количественная оценка белка. График Бира-Ламберта, основанный на стандартах ламинарина известных концентраций и показаний поглощения (при 405 нм), используемых для расчёта концентраций каллозы (как ламинариновых эквивалентов, LE) по показаниям поглощения образцов клубовинок. Эта цифра былапереиздана в 49 годах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Сравнение концентрации каллозы. Сравнение средних концентраций каллозы (средняя ± SEM, n = 9) в клубневидках M. balbisiana , и банановых растений Mbwazirume, инокуляционных Xvm , согласно новому методу иммунофлуоресцентной спектрофотометрии (независимый t-тест на образце, α ≤ 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

БуферСоставХранение
Блокирующий буфер10 г бычьей сыворотки альбумина (BSA; 1% в/в), растворённых в 1 литре PBS.-20 °C до 6 месяцев
Буфер покрытия1,59 г карбоната натрия (Na2CO3), 2,93 г бикарбоната натрия (NaHCO 3), 0,2 г азида натрия (NaN 3), растворяются в 1 л деионизированноговодорода 2O, pH 9,6.-20 °C до 12 месяцев
Сопряжённый буфер2 г PVP (2% в/в), растворённые в 1 литре блокирующего буфера.-20 °C до 6 месяцев
Раствор пара-нитрофенилфосфата (pNPP)Растворить пара-нитрофенилфосфат (pNPP) в буфере субстрата до рабочей концентрации 1 мг/мл-20 °C до 12 месяцев
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)8,0 г хлорида натрия (NaCl), 0,2 г монобазового калия фосфата (KH2PO4), 1,15 г дибазисного фосфата натрия (Na2HPO 4), 0,2 г хлорида калия (KCl), 0,2 г азида натрия (NaN 3), растворённых в 1 л деионизированного H2O, pH 7,4.-20 °C до 12 месяцев
Первичное антитело в блокирующем буфереВосстанавливайте лиофилизированные первичные антитела согласно инструкции производителя, чтобы получить концентрированный запас. Разведите полученный восстановленный первичный антител в блокирующем буфере до рабочей концентрации 2 мкг/мл.-20 °C до 6 месяцев
Первичное антитело в буфере покрытияВосстанавливайте лиофилизированные первичные антитела согласно инструкции производителя, чтобы получить концентрированный запас. Разбавьте полученный восстановленный первичный запас антител в буфере покрытия до рабочей концентрации 2 мкг/мл.-20 °C до 6 месяцев
Вторичные антитела1:1000 вторичного концентрата антител: сопряжённый буфер-20 °C до 6 месяцев
Буфер субстрата97 мл диэтаноламина, 0,2 г азида натрия (NaN 3), растворяются в 1 л деионизированного H2O, pH 9,8-20 °C до 12 месяцев
Промывочный буфер0,5 мл из Tween 20 (0,05% v/v), растворённых в 1 л PBS, pH 7,5-20 °C до 12 месяцев

Таблица 1: Рецепт буферов.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод иммунофлуоресцентной спектрофотометрии был применён впервые для количественной оценки каллозы в банановых клубнях. Он основан на ферментном иммуноанализе (EIA), используемом для количественной оценки каллозы в сыром экстракте банана 1 M NaOH с использованием специфических к мозолиантител 47,51,52. Вкратце, этот новый квантовый анализ на основе иммунофлюоресцентной спектрофотометрии и специфический для мозоли включал покрытие микропластины специфическим к мозоли антителом, которое затем связывается с каллозой в растительном экстракте, а затем вторичным антителом, также специфичным для мозолей. Затем добавляется обнаружение антитела, связанного с ферментом (щелочной фосфатазой), которое образует комплекс с вторичным антителом. Затем добавляется субстрат — пара-нитрофенилфосфат (pNPP). Количественная оценка каллозы в образце основана на способности щелочной фосфатазы расщеплять фосфатные группы из молекул pNPP, что приводит к образованию жёлтого соединения (p-нитрофенола). Обнаружение интенсивности жёлтого цвета проводилось с помощью спектрофотометра на расстоянии 405 нм, после чего поглощение коррелировало с активностью щелочной фосфатазы, которая была прямо пропорциональна концентрации кальлозы в образце. Реакцию остановили повышением pH за счёт добавления 0,5 млн NaOH, что предотвратило дальнейшую активность щелочной фосфатазы.

В отличие от эпифлуоресцентной микроскопии, стандартный золотой метод для локализации и количественной оценки каллозы — это метод эпифлуоресцентной микроскопии, хорошо известный метод, основанный на окрашивании каллозы анилин-синимфлуорохромом 53. Кратко говоря, этот метод основан на специфическом связывании анилинового синего красителя с бета-1,3-глюканами (мозолями), образуя комплекс. Анилиновый синий в этом комплексе затем возбуждается ультрафиолетовым светом (длина волны 365–375 нм). Когда анилиновый синий краситель возбуждается, он излучает синюю флуоресценцию, которая захватывается для чёткого визуализации каллозы в растительныхтканях 53. Количественная оценка каллозы с анилиновым синим цветом осуществляется с помощью серии методов визуализации, которые количественно определяют количество флуоресценции, исходящего из тканей растения. Флуоресценция пропорциональна количеству каллозы в тканях растений. Эпифлуоресцентная микроскопия используется для визуализации и количественной оценки каллозы при биотическомстрессе 54.

В отдельном исследовании осаждение каллозы было определено с помощью эпифлуоресцентной микроскопии и иммунофлуоресцентной спектрофотометрии49. Хотя в данных наблюдались некоторые различия, статистический анализ в значительной степени показал соответствие данных эпифлуоресцентной микроскопии и иммунофлуоресцентной спектрофотометрии, что свидетельствует о согласованности двух методов обнаружениякаллоза 49. Хотя результаты двух методов в значительной степени совпадали, рекомендуется дополнять взаимно эпифлуоресцентную микроскопию и иммунофлуоресцентную спектрофотометрию для более надёжной оценки. Хотя метод на основе ELISA специфичен для мозолей, чувствительный и надёжен, изначально он занимает много времени на оптимизацию протокола и получение оптимальной стандартной кривой, соответствующей всем концентрациям и поглощаниям.

Некоторые методы количественного измерения каллозы трудоёмкие17, 32, 55 —трудоёмкие 26, 56, не специфичные для мозолей, так как анилиновый синий может окрашать другие β-1,3-глюканы, кромеcallose 30, требуют дорогого и сложного программного обеспечения для подсчёта каллоз23, 24, 26, требует значительных технических навыков, а высокий фон/автофлуоресценция, связанный с флуоресцентной спектрофотометрией, делает количественную оценку каллозы сложной и ненадёжной26. Методы количественной оценки Callose на основе автоматизированного рабочего процесса анализа изображений, таких как программное обеспечение ImageJ, требуют соответствующего обучения плагина для анализа изображений, например, Trainable Weka Segmentation (TWS) для ImageJ, и это оченьгромоздко, 57.

Анализы на основе иммунофлуоресцентной спектрофотометрии пользуются высокой предпочтительностью благодаря их специфичности, чувствительности, простоте использования и воспроизводимости. Однако важно отметить, что система обнаружения и её чувствительность могут варьироваться в зависимости от конкретного протокола анализа и используемого оборудования.

Здесь описан новый метод количественной оценки каллозы на основе иммунофлуоресцентной спектрофотометрии. Описанный здесь метод может быть применён для количественного определения каллозы в различных растительных тканях и видах с удовлетворительной степенью специфичности к мозолю, высокой точностью и воспроизводимостью. Этот метод является дополнением к различным методам количественной оценки каллозы и может использоваться для мониторинга изменений уровня каллозы во время роста и развития растений, а также в ответ на различные стимулы или обработки. Кроме того, использование 96-луночной пластины снижает субъективный отбор проб и анализ, что делает метод подходящим для высокопроизводительной количественной оценки каллоза. Примечательно, что хотя каллозу можно легко извлечь из свежесобранных растительныхтканей 17, 27 и 55, этап подготовки образцов с сублимацией, включённый в соответствии с новым протоколом, обеспечивает возможность хранить образцы очень долго (до 1 года) и позволяет хранить и отправлять скоропортящиеся биологические образцы между удалёными лабораториями при температуре окружающей среды. Это позволяет повторять экстракцию каллозы без необходимости многократно готовить весь эксперимент к сбору новых образцов.

Иммунофлуоресцентная спектрофотометрия рекомендуется для экспериментов с высокой производительностью каллоза, тогда как эпифлуоресцентная микроскопия и иммунофлуоресцентная микроскопия могут использоваться как для количественной оценки каллозы, так и для гистолокализации каллозы в растительных тканях. Для обеспечения точного, эффективного и надёжного пространственно-временного распределения каллозы в растительных тканях рекомендуется одновременно использовать различные методы количественной оценки каллозы, включая микроскопию, спектрофотометрию и методы активности ферментов. В результате это позволит точно и эффективно понять роль каллозы в различных физиологических и стрессовых реакциях. Будущие исследования могут всесторонне и одновременно оценить несколько методов количественной оценки каллозы, включая эпифлуоресцентную микроскопию, иммунофлуоресцентную микроскопию, флуоресцентную спектрофотометрию, иммунофлуоресцентную спектрофотометрию и методы, основанные на ферментативной активности.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано Фондом Билла и Мелинды Гейтс, номер гранта INV 009894/OPP1134098. Спонсоры не участвовали в разработке исследования; в сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи; или в решении опубликовать результаты.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Алюминиевая фольга Kim-Fay EA Limited, Найроби, Кения
Аналитический баланс  Mettler-Toledo AG, Грайфензе, ШвейцарияML204/01
Beadbeater 96BioSpec Products Inc., Бартлсвилл, Оклахома, США1001EUR
Промокательная бумага Kim-Fay EA Limited, Найроби, Кения
Бычий сывороточный альбумин (BSA) Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАB14
Центрифуга, 5425RЭппендорф, Гамбург, Германия5406000240
Комбинированный холодильник-морозильник (4 градуса; C и & минус; 20 и °; C) Haier Medical and laboratory Co. Ltd., Цинда, КитайHYCD-282
Диетаноламин Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, Испания191287
Digital Shaker, MixMateЭппендорф, Гамбург, Германия5353000529
Ди-натриевой водородфосфат (Na2HPO4)Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, Испания141679
Пластины ELISA, 96-колодца, плоское основание, прозрачные, полистирол, высокое связываниеSarstedt AG & Рота KG, Nü Мбрехт, Германия82.1581.200
Фильтр для считывателя микропластин iMark, iMark 680, 405 нмLasec International Pty. Ltd., Кейптаун, Южная АфрикаBRD1681011
Freeze-dryer, VirTis— BenchTop " K” серии; Модель: 4KBTXLLabWrench, Канада, США448053
Соляная кислота (HCl) Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, Испания141020
Изотермический принудительная конвекционная инкубатор, IFA-54-8Esco Lifesciences Group, Сингапур2100002
Ламинарин Alfa Aesar, Массачусетс, СШАJ66193
Микроцентрифугные трубки 1,5 мл Эппендорф, Гамбург, Германия022363204
Микроцентрифугные трубки 2 мл Genesee Scientific Corp., Калифорния, США24– 283
Микропипетка (30– 300 μ L), 12 каналов, 2100 сериалов  Эппендорф, Гамбург, ГерманияEP-12-300R
Наконечники для микропипеток epT.I.P.S.  СинглыЭппендорф, Гамбург, Германия022363204
Микропипетки (0,5– 1000 & mu; L), исследования  плюсЭппендорф, Гамбург, Германия3123000900
Считыватель поглощения микропластин, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., Калифорния, США1681135EDU
Программное обеспечение Microplate Manager 6 версии 6 и nbsp;Bio-Rad Laboratories, Inc., Калифорния, США1689520
ПарафильмPaul Marienfeld GmbH & Рота KG, Лауда-К&оумл; нигсхофен, Германия740751
Пара-нитрофенилфосфат (пНПП)Merck KGaA, Дармштадт, Германия20-106
pH-метр, HI9126Hanna Instruments, Вунсокет, Род-Айленд, США02310048991
Поливинилпирролидон (PVP) Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, ИспанияA2260
Хлорид калия (KCl)Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, ИспанияA2939
Калий ди-гидрофосфат (KH2PO4) Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, Испания141509
Точная водяная баня, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Ньюинтон, Коннектикут, СШАTSGP10
Первичные антитела (1-3-&бета;-глюкан-ориентированный мышь IgG) Биоматериалы Australia Pty Ltd., Мельбурн, Австралия400-2
Реагентные резервуары Thermo Fisher Scientific Inc., Массачусетс, США15075
Вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой (антимышиная IgG-щелочная фосфатаза) Sigma Life Sciences, Нью-Джерси, СШАA5153
Азид натрия (NaN3) Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, ИспанияA1430
Карбонат натрия (Na2CO3) Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, Испания141648
Хлорид натрия (NaCl) Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, ИспанияA2942
карбонат водорода натрия (NaHCO3) Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, Испания141638
Гидроксид натрия (NaOH)Реагенты PanReac AppliChem ITW, квалифицированные; mica SLU, Барселона, Испания141687.1210
Tween-20Biomatik Corporation, Онтарио, КанадаA4031
Ультрачистая дистиллированная водаThermo Fisher Scientific, Массачусетс, США10-977-015

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи