Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация индуцированных плюрипотентных iTenoцитов, полученных из стволовых клеток, с помощью комбинированной гиперэкспрессии Склеракса и 2D одноосного натяжения

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65837

⸱

1 марта 2024 г.

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описана процедура получения iTenoцитов путем генерации мезенхимальных стромальных клеток, полученных из iPSC, с комбинированной гиперэкспрессией Scleraxis с использованием лентивирусного вектора и одноосным растяжением через 2D-биореактор.

Аннотация

Сегодняшние проблемы в восстановлении сухожилий и связок требуют определения подходящего и эффективного кандидата для клеточной терапии для стимуляции регенерации сухожилий. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) были изучены как потенциальная стратегия тканевой инженерии для восстановления сухожилий. Несмотря на то, что они мультипотентны и обладают регенеративным потенциалом in vivo, они ограничены в своей способности к самообновлению и демонстрируют фенотипическую гетерогенность. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут обойти эти ограничения благодаря своей высокой способности к самообновлению и беспрецедентной пластичности развития. В развитии теноцитов склераксис (Scx) является важнейшим прямым молекулярным регулятором дифференцировки сухожилий. Кроме того, было показано, что механорегуляция является центральным элементом, управляющим развитием и заживлением эмбриональных сухожилий. Таким образом, мы разработали протокол для инкапсуляции синергетического эффекта биологической и механической стимуляции, который может быть важен для генерации теноцитов. ИПСК индуцировали превращение в мезенхимальные стромальные клетки (МСК) и характеризовали классическими мезенхимальными стромальными клеточными маркерами с помощью проточной цитометрии. Затем с помощью лентивирусного вектора iMSK трансдуцировали для стабильной сверхэкспрессии SCX (iMSCSCX+). Эти клеткиiMSC SCX+ могут быть дополнительно преобразованы в iTenoциты путем одноосного растягивающего нагружения с помощью 2D-биореактора. Полученные клетки характеризовались наблюдением за повышением регуляции ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена. Этот метод генерации iTenoцитов может быть использован для помощи исследователям в разработке потенциально неограниченного готового аллогенного источника клеток для применения в терапии сухожильными клетками.

Введение

Чтобы решить современные проблемы восстановления сухожилий и связок, существует потребность в соответствующем клеточном кандидате, подходящем для клеточной терапии. Одним из направлений исследований в тканевой инженерии для восстановления сухожилий является изучение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (BM-MSCs) и стромальных клеток жировой ткани (ASC) в качестве потенциальных стратегий. Эти клетки обладают мультипотентной способностью, большой численностью и регенеративным потенциалом in vivo. Кроме того, они показали повышенную способность к заживлению и улучшенные функциональные результаты на животных моделях1. Тем не менее, эти клетки демонстрируют ограниченные возможности самообновления, фенотипическое разнообразие и, что примечательно, ограниченную способность к образованию сухожилий. Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) предлагает решение этих ограничений благодаря своей замечательной способности к самообновлению и непревзойденной адаптивности к развитию. Наша исследовательская группа и другие исследователи добились успешной дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальноклеточные образования (МСК)2,3. Таким образом, МСК могут стать аллогенным источником для клеточной терапии сухожилий.

Склераксис (SCX) является транскрипционным фактором, необходимым для развития сухожилий, и считается самым ранним обнаруживаемым маркером дифференцированных теноцитов. Кроме того, SCX активирует маркеры дифференцировки сухожилий, в том числе коллаген 1-го типа (COL1a1), ирокез (MKX) и теномулина (TNMD), среди прочих 4,5,6. Другие гены, экспрессируемые во время созревания сухожилий, включают белка, способствующего полимеризации тубулина, члена семейства 3 (TPPP3) и рецептор тромбоцитарного фактора роста альфа (PDGFRa)7. Хотя эти гены необходимы для развития и созревания сухожилий, они, к сожалению, не уникальны для сухожильной ткани и экспрессируются в других костно-мышечных тканях, таких как кости или хрящи 5,7.

В дополнение к экспрессии маркеров во время развития сухожилий, механостимуляция является важным элементом для эмбрионального развития и заживления сухожилий 4,5,6. Сухожилия механочувствительны, и их модели роста изменяются в ответ на окружающую среду. На молекулярном уровне биомеханические сигналы влияют на развитие, созревание, поддержание и реакции заживления теноцитов8. Для моделирования физиологических нагрузок и биомеханических сигналов используются различные системы биореакторов. Некоторые из этих модельных систем включают в себя нагрузку тканей ex vivo, 2D-системы загрузки клеток, использующие двухосное или одноосное растяжение, и 3D-системы, использующие скаффолды и гидрогели 9,10. 2D-системы полезны при изучении влияния механической стимуляции либо на сухожильные специфические гены, либо на морфологию клеток в контексте клеточной судьбы, в то время как 3D-системы могут более точно воспроизводить взаимодействия между клеткой и ECM 9,10.

В системах 2D-загрузки деформация между клетками и культуральным субстратом однородна, что означает, что приложенная нагрузка на цитоскелет клеток может быть полностью контролируемой. По сравнению с двухосной нагрузкой, одноосная нагрузка более физиологически значима, так как теноциты преимущественно подвергаются одноосной нагрузке из коллагеновых пучков in vivo9. Установлено, что при повседневной деятельности сухожилия подвергаются одноосной растягивающей нагрузке до 6% деформации11. В частности, предыдущие исследования показали, что нагрузка в физиологических пределах 4%-5% способствует дифференцировке теногенов, сохраняя экспрессию маркеров, связанных с сухожилиями, таких как SCX и TNMD, а также увеличивает выработку коллагена 9,10. Штаммы более 10% могут быть травматичными, но не физиологически значимыми12,13.

Здесь представлен протокол, учитывающий синергетический эффект механической и биологической стимуляции, который может иметь существенное значение для генерации теноцитов. Впервые описан воспроизводимый метод индуцирования ИПСК в МСК путем кратковременного воздействия факторов роста на эмбриоидные тельца, подтвержденный поверхностными маркерами МСК с помощью проточной цитометрии. Затем мы подробно описали метод лентивирусной трансдукции, позволяющий сконструировать iMSC со стабильной гиперэкспрессией SCX (iMSCSCX+). Для дальнейшего созревания клеток iMSCSCX+ помещаются в силиконовые пластины с фибронектиновым покрытием и проходят оптимизированный протокол одноосного натяжения с использованием биореактора CellScale MCFX. Теногенный потенциал был подтвержден наблюдением за апрегуляцией ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена14. Этот метод генерации iTenoцитs является доказательством концепции, которая может предложить неограниченный готовый аллогенный источник для применения в терапии сухожильными клетками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол производства iTenoцитов может быть выполнен в три основных этапа: от ИПСК до iМСК (10 дней), от iMSC до iMSCSCX+ (2 недели), от iMSCSCX+ до iTenocytes (минимум 4 дня). Каждый важный шаг в протоколе может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента. Для методов, связанных с культивированием клеток, следует использовать стерильные методы. Все клетки в этом протоколе должны выращиваться при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%.

1. Индукция ИПСК человека в индуцированные мезенхимальные стромальные клетки (МСК)

  1. Подготовка к эксперименту
    1. Подготовьте среду Iscove Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB).
      1. Добавьте 50 мл базальной среды IMDM с 8,5 мл нокаут-заменителя сыворотки, 500 мкл заменимых аминокислот с минимальной незаменимой средой (МЭМ), 0,385 мкл (110 мМ стока) бета-меркаптоэтанола и 500 мкл антибиотико-антимикотического раствора (ААС) (конечные концентрации: 17%, 1%, 110 мкМ, 1% соответственно) (см. таблицу материалов).
    2. Подготовьте среду для мезенхимальных стромальных клеток (МСК).
      1. Добавьте 440 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) с низким содержанием глюкозы Dulbecco с 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл раствора антибиотика-антимикотика (AAS) и 5 мл L-глютамина (конечные концентрации: 10%, 1%, 2 мМ соответственно).
    3. Подготовьте пластины с поли(2-гидроксиэтилметакрилатом) (поли-ГЕМА) покрытием.
      1. Добавьте 10 г poly-HEMA (см. Таблицу материалов) в стерильный флакон.
      2. Добавьте в бутылку магнитную мешалку и, помешивая, медленно добавьте 500 мл 95% EtOH.
      3. После того, как все EtOH будет добавлено, включите режим перемешивания при 1200 об/мин при дополнительном слабом огне не менее 6 часов. Раствор poly-HEMA можно хранить при комнатной температуре до года.
      4. В стерильных условиях добавить 2,5 мкг/см2 в 9 мл в колбу Т75. Отрегулируйте объем в соответствии с размером сосуда для культивирования.
      5. Сохраняя стерильность, дайте сосудам высохнуть на воздухе, чтобы EtOH полностью испарился перед использованием. Обычно это занимает 24-72 часа.
    4. Подготовьте покрытые желатином колбы.
      1. Вымойте стеклянную бутылку с NaOH и посвятите ее приготовлению желатина. Не используйте моющее средство.
      2. Приготовьте 1% раствор желатина (5 г желатина и 500 мл воды, не содержащей эндотоксинов). Автоклавируйте стеклянную бутылку с раствором желатина в течение 30 минут.
      3. Дайте желатиновому раствору остыть, и его можно хранить при комнатной температуре.
      4. Покройте одну колбу T75 5 мл раствора желатина на колбу и инкубируйте не менее 1 ч перед посевом клеток. Колбы с желатиновой глазурью можно приготовить за 1 день.
    5. Подготовьте буфер для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).
      1. Смешайте PBS с 2% бычьим сывороточным альбумином и 0,1% азидом натрия. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Генерация эмбриоидных телец (БЭ)
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК следует культивировать в 6-луночном планшете и достигать 70%-80% слияния перед использованием.
    1. На 0-й день принесите ПЦР-планшет 384 с прозрачным дном в колпаке для культивирования тканей и ультрафиолетовое излучение в течение 15 минут без крышки.
    2. Удалить питательную среду из ИПСК (см. Таблицу материалов) и промыть лунки ПБС.
    3. Добавьте в каждую лунку по 0,5 мл предварительно подогретого щадящего реагента для диссоциации клеток (см. таблицу материалов) и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C. Наблюдайте за клетками каждые 5 мин до тех пор, пока ИПСК не превратятся в единичные клетки или небольшие агрегаты, поднятые во взвешенном состоянии.
    4. Ресуспендированную клеточную суспензию с помощью пипетки объемом 1 мл для получения одноклеточной суспензии.
    5. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте в среде IMDM-EB (шаг 1.1.1) и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
    7. Рассчитайте соответствующий объем клеточной суспензии, необходимый для достижения 5 000-25 000 клеток на лунку 384-луночного планшета с 25 мкл клеточной суспензии на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 2-3 скважины с притоком (70%-80%) из 6-луночного планшета могут создавать ЭП в одной 384-луночной пластине. Размер ячеек на ЭБ будет определен опытным путем. Для всей 384-луночной планшета необходимо использовать 9,6 мл клеточной суспензии, 25 мкл на лунку.
    8. Снова центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    9. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в соответствующем объеме среды IMDM-EB и 10 мкМ дигидрохлорида Y-27632 (запас: 10 мМ, 1000x, см. таблицу материалов) в предварительно охлажденной конической пробирке объемом 15 мл.
    10. Добавьте к конусу холодную растворимую матрицу базальной мембраны (1 мг на 384-луночную пластину EBs) (см. таблицу материалов).
    11. Распределите по 25 мкл клеточной суспензии в каждую лунку. Накройте тарелку стерильной крышкой и вращайте при температуре 450 x g при 4 °C в течение 7 минут. Инкубируют при 37 °C в течение 48 ч.
    12. На 2-й день переложите клетки на 100-миллиметровую пластину с 3 мл предварительно нагретой среды IMDM-EB.
    13. Переложите ЭБ в специальные колбы T75 с полигема-покрытием с 10 мл ИМДМ-ЭБ. Отрегулируйте объем в соответствии с размером сосуда для культивирования. Дайте ЭБ расти в течение 3 дней.
    14. На 5-й день переложите ЭП в подготовленные колбы Т75, покрытые желатином, с 10 мл среды ИМДМ-ЭБ. Отрегулируйте объем в соответствии с размером сосуда для культивирования. Выращивайте ЭБ еще 3 дня во взвешенном состоянии.
    15. На 8-й день убедитесь, что наблюдаются два типа ЭБ: ЭБ, прикрепленные к колбе, и неприкрепленные ЭБ. Вымойте неприкрепленные ЭБ из колбы с помощью ПБС.
    16. К прилагаемым ЭБ добавляют среду IMDM-EB с добавлением TGFβ-1 (10 нг/мл) (см. таблицу материалов) и дают им расти в течение 2 дней.
    17. На 10-й день смените среду на среду МСК. Клетки следует подкармливать два раза в неделю. После слияния на 70% перейдите к «Стандартному протоколу лифтинговых ячеек» для замены пластин клеток. Переложите ячейки на пластины, покрытые желатином.
  3. Стандартный протокол подъемных ячеек
    1. После того, как адгезивные клетки достигнут 70% слияния, аспирируют питательную среду из планшетов и промывают PBS.
    2. Поднимите клетки, добавив 5 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина на каждую 150-миллиметровую пластину, и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C. Отрегулируйте объем трипсина в соответствии с размером сосуда для культивирования.
    3. Под микроскопом убедитесь, что большая часть клеток была извлечена из каждой пластины. Если ячейки все еще прикреплены, осторожно постучите по стенкам пластин, чтобы сместить ячейки.
    4. Соберите клетки в коническую трубку, добавив двойной объем предварительно подогретой питательной среды.
    5. Центрифугируют клетки при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 x g. Удалите надосадочную жидкость и приступайте к следующим действиям.
  4. Оценка экспрессии маркеров МСК методом проточной цитометрии
    ПРИМЕЧАНИЕ: МСК человека, как и МСК костного мозга, следует использовать в качестве положительного контроля.
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек» (шаг 1.3).
    2. Ресуспендируйте надосадочную жидкость с помощью 3 мл буфера FACS и перенесите весь объем в пробирки FACS.
    3. Центрифуга при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 х г. Повторите этап промывки буфером FACS еще два раза.
    4. В окрашенные пробирки добавляют 2 мкл мышиного античеловеческого CD90-FITC, мышиного античеловеческого CD44-APC и античеловеческого CD105-PE (см. таблицу материалов) и инкубируют в течение 45 мин при 4 °C.
    5. К контрольным трубкам изотипа добавьте 20 мкл мышиного IgG2a-FITC, мышиного IgG1-PB и мышиного IgG1-PE (см. таблицу материалов).
    6. Инкубируют в темноте при 4 °С в течение 15 мин. Вымойте все пробирки, добавив 3 мл буфера FACS и центрифугируя в течение 5 минут при 300 x g (при комнатной температуре). Ресуспендируйте ячейки в 250 мкл буфера FACS для каждой пробирки.
    7. Проанализируйте экспрессию поверхностных маркеров МСК с помощью проточной цитометрии14. Длины волн возбуждения и излучения должны быть: CD90-FITC, пик возбуждения на длине волны 495 нм и пик излучения на длине волны 519 нм; CD44-APC, пик возбуждения при 640 нм и пик эмиссии при 660 нм; CD105-PE, пик возбуждения на длине волны 561 нм и пик излучения на длине волны 574 нм.

2. Передача и расширение iMSC

  1. Приготовление реагентов
    1. Подготовьте среду для замораживания МСК.
      1. Смешайте 30 мл ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мл ДМСО и 15 мл ФБС (конечные концентрации: 60%, 10%, 30% соответственно).
      2. Отфильтруйте раствор с помощью стерильного фильтра 0,45 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Пассаж
    ПРИМЕЧАНИЕ: После индукции МСК необходимо выращивать на планшетах с желатиновым покрытием в течение дополнительных 2 проходов, прежде чем отучить от выращивания на пластиковых планшетах для культуры тканей. Кроме того, клетки должны пассировать с соотношением 1:3 при слиянии 70%.
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек» (шаг 1.3).
    2. Ресуспендируйте ячейки в среде МСК и равномерно распределите ячейки по трем новым 150-миллиметровым пластинам из колб T175 по 20 мл среды на колбу. Верните ячейки при температуре 37 °C.
    3. Подкармливайте клетки два раза в неделю, заменяя питательную среду предварительно нагретой средой МСК.
  3. Замораживание
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек».
    2. Ресуспендируйте ячейки в 1 мл среды для замораживания МСК. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в криовиальную камеру и храните в морозильном контейнере в течение 24 ч при -80 °C, прежде чем перенести в жидкий азот для длительного хранения.
  4. Таяние
    1. Приготовьте 10 мл предварительно подогретой среды МСК в конической пробирке объемом 15 мл.
    2. Извлеките криовиал, опустите его в водяную баню с температурой 37 °C и взбалтывайте до тех пор, пока не останется ледяной шарик размером с горошину (примерно 1-2 минуты).
    3. В колпаке для клеточных культур медленно добавьте 1 мл предварительно нагретой среды в криовиальную камеру и пипетку вверх и вниз для перемешивания.
    4. Переложите клеточную суспензию из криовиальной камеры в подготовленную коническую пробирку объемом 15 мл с предварительно нагретой средой и центрифугируйте в течение 5 мин при 300 х г (при комнатной температуре).
    5. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте свежей средой. Добавьте клеточную суспензию в планшет диаметром 150 мм общим объемом 20 мл. Отрегулируйте объем в соответствии с размером колбы для культуры.
    6. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к разделению.

3. Генная инженерия МСК для сверхэкспрессии SCX с использованием лентивирусной трансдукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола занимает две недели.

  1. Приготовление сред и реагентов
    1. Подготовьте HEK293T/17 клеточные среды.
      1. Добавьте 445 мл минимальной эссенциальной среды (EMEM) Eagle с 50 мл FBS и 5 мл AAS (конечные концентрации: 10%, 1% соответственно).
    2. Подготовьте лентиупаковочную среду MSC.
      1. Приготовьте термоинактивированную сыворотку, нагревая 50 мл FBS комнатной температуры на водяной бане 60 °C в течение 30 минут.
      2. Смешайте 445 мл DMEM с низким содержанием глюкозы с инактивированным при нагревании FBS и 5 мл L-глютамина (конечные концентрации: 10%, 2 мМ соответственно).
    3. Приготовьте трансфекционный комплекс.
      1. Позволяют компонентам трансфекционного комплекса (см. Таблицу материалов) оттаять на льду: упаковка плазмид VSV-G и Delta, плазмиды SCX и BioT15,16.
      2. Плавно вихряйте и раскручивайте плазмиды. Измерьте концентрацию ДНК.
      3. Исходя из концентраций ДНК и количества колб, предназначенных для трансфекции, рассчитайте объем каждого необходимого компонента: для одной колбы Т75 трансфекционный комплекс будет состоять из 750 мкл безсывороточной среды (например, безсывороточного DMEM или PBS), 7,5 мкг плазмиды SCX, 0,75 мкг плазмиды VSV-G, 6,75 мкг дельта-плазмиды и 22,5 мкл BioT. Учитывайте дополнительно ошибку пипетирования.
      4. Перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз. Коротко отжмите в центрифуге. Выдержать при комнатной температуре 15 мин и сразу использовать.
  2. Трансфекция и лентивирусная продукция
    ВНИМАНИЕ: Начиная с 3-го дня, протокол предполагает работу с лентивирусом, и, таким образом, работа должна проводиться с использованием операционных процедур уровня сдерживания 2+. Работники должны носить средства индивидуальной защиты, в том числе два слоя перчаток, накладки на запястья, защитные очки, маску, длинные штаны и закрытую обувь. Все отходы и материалы, включая наконечники пипеток, колбы и жидкую среду, должны быть обеззаражены отбеливателем (окончательный 1% гипохлорит натрия) в течение не менее 20 минут. Не используйте пылесос.
    1. Посев HEK293T/17 клеток.
      1. Примерно за 18-24 ч до трансфекции (день 0) поднимите и поместите клетки 293Т в колбы Т75. В следующих томах предполагается, что Т75 является культуральным сосудом. Отрегулируйте объем в соответствии с используемым сосудом для клеточной культуры.
      2. Выньте питательную среду из колб и промойте 5 мл PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки очень легко отрываются от поверхности колбы. Добавьте PBS на стенку колбы и избегайте прямого добавления раствора в ячейки.
      3. Добавьте в каждую колбу 3 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут. Соберите клетки в коническую пробирку и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 x g.
      4. Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте в среде 293T и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
      5. Поместите ячейки на пластины при соотношении 5,3 x 104 клетки/см2 и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
      6. На следующий день (1 день) приготовьте трансфекционный комплекс. Замените питательную среду из клеток 5 мл предварительно подогретой лентиупаковочной среды МСК (шаг 3.1.2).
      7. Добавьте трансфекционный комплекс по каплям к клеткам. Аккуратно наклоните чашку, чтобы обеспечить равномерное воздействие трансфекционного комплекса на клетки. Верните клетки в инкубатор на 48 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Токсичность должна наблюдаться через 24 ч (2-й день).
      8. Через 48 ч (3-й день) осторожно соберите вируссодержащую среду в отдельную коническую пробирку с помощью пипетки и центрифугируйте в течение 5 мин при 300 х г (при комнатной температуре).
      9. Добавьте 5 мл предварительно подогретой лентиупаковочной среды МСК в колбу Т75 с клетками 293Т и верните в инкубатор на ночь.
      10. После центрифугирования отфильтруйте надосадочную жидкость стерильным фильтром 0,45 мкм, напрямую пипетируя надосадочную жидкость через фильтр. Хранить вируссодержащую среду при температуре 4 °C в течение ночи.
      11. Еще через 24 ч (4-й день) еще раз осторожно собирают вируссодержащую среду в отдельную коническую пробирку с помощью пипетки и центрифугируют в течение 5 мин при 300 х г (при комнатной температуре).
      12. Соедините вирус с вирусом предыдущего дня сбора и перемешайте, чтобы получить однородный раствор. На этом этапе протокол может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента. Лентивирус можно аликвотировать и замораживать при -80 °C, или лентивирус можно хранить на льду во время «Трансдукции МСК с помощью SCX» (шаг 3.3).
        ПРИМЕЧАНИЕ: После замораживания и размораживания аликвот лентивируса не замораживайте повторно.
  3. Трансдукция iMSC с помощью SCX
    1. Выполните трансдукцию титровой пластины.
      1. На 0-й день выполните «Стандартный протокол лифтинговых клеток».
      2. Ресуспендируйте клетки в среде МСК и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
      3. В 6-луночную тарелку добавьте 4 x 103 ячейки/см2. Переложите оставшуюся часть в дополнительную 150-миллиметровую пластину с 20 мл среды MSC (это будет контрольная пластина). Инкубируют клетки в течение 24 ч при температуре 37 °C.
      4. На следующий день (день 1) ячейки должны сливаться на ~40%. Разогрейте питательную среду в ленти-упаковке и разморозьте полибрен и примерно 3 мл лентивируса на льду (или, если это делается в тот же день, что и сбор вируса, храните на льду до использования).
      5. Добавляют ленти-упаковывающую питательную среду и лентивирус в лунки в зависимости от желаемых титров (т.е. 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Добавьте 0,5 мкл полибрена для достижения конечной концентрации 5 мкг/мл (концентрация сырья: 10 мг/мл, см. таблицу материалов).
      6. Вращайте пластину, чтобы обеспечить равномерное воздействие на все клетки. Верните планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 48 ч.
    2. Эффективность титра лентивируса SCX оценивают с помощью проточной цитометрии.
      1. Через 48 ч выполните «Стандартный протокол лифтинговых клеток».
      2. Ресуспендируйте клетки в PBS и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток. Центрифугируют клетки при комнатной температуре в течение 5 мин при 300 x g.
      3. Удалите надосадочную жидкость и повторно поместите ее в 3 мл буфера FACS для промывки. Переложите клеточную суспензию в проточные цитометрические пробирки и центрифугу на 5 мин при 300 х г.
      4. Повторите промывку буфером FACS еще два раза и повторно суспендируйте конечные гранулы клеток в 300 мкл буфера FACS. Оценивают экспрессию GFP для каждого титра с помощью аппарата для проточной цитометрии.
      5. Основываясь на титрах и количестве жизнеспособности клеток, определите подходящий титр лентивируса для продолжения трансдукции. На этом этапе протокол может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента.
    3. Выполнение крупномасштабной трансдукции SCX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы указаны для 1x 150 мм пластины или 1x колбы T175. Это может быть скорректировано соответствующим образом в зависимости от желаемого размера сосуда и масштаба трансдукции.
      1. На 0-й день выполните «Стандартный протокол лифтинговых клеток».
      2. Ресуспендируйте клетки в среде МСК и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток. Высевают клетки из расчета 4 x 103 клетки/см2. Инкубируют клетки в течение 24 ч при температуре 37 °C.
      3. На следующий день (день 1) ячейки должны сливаться на ~40%. Предварительно разогрейте ленти-упаковочную питательную среду и разморозьте полибрен и заранее рассчитанное количество лентивируса на льду.
      4. Исходя из выбранного титра, добавляют в лунки нужное количество лентиупаковочной питательной среды и лентивируса. Добавьте 5 мкг/мл полибрена (концентрация запаса: 10 мг/мл).
      5. На 3-й день наблюдают за клетками под флуоресцентным микроскопом. Недавно произведенный iMSCSCX+ должен флуоресцировать GFP. Замените вируссодержащую среду предварительно нагретой средой для МСК. На этом этапе протокол может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента.

4. Передача и расширение iMSCSCX+

  1. Выполняйте передачу, расширение, замораживание и размораживание iMSCSCX+ так же, как и для iMSC, как описано в шаге 2 протокола.

5. Механическое нагружение

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап занимает минимум 4 дня, но может быть дольше в зависимости от того, наблюдается ли сокращение клеток.

  1. Подготовка к эксперименту
    1. Подготовьте силиконовые пластины.
      1. Автоклав 2 силиконовые пластины (см. Таблицу материалов). После, в стерильных условиях, извлеките силиконовые пластины из автоклавного пакета и поместите их в пластины диаметром 150 мм.
      2. Смешайте 130 мкл фибронектина (100x, см. таблицу материалов) с 13 мл стерильного PBS в конической пробирке объемом 15 мл. Переверните пробирку несколько раз, чтобы перемешать.
      3. Добавьте 400 мкл раствора фибронектина в каждую лунку силиконовых пластин. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C не менее 2 часов или в течение ночи.
      4. Перед использованием аспирируйте раствор фибронектина и дайте планшетам высохнуть на воздухе в колпаке для клеточных культур в течение не менее 30 минут, чтобы раствор фибронектина полностью испарился.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор фибронектина можно удалить из лунок заранее, и пластины с покрытием могут находиться при температуре 37 °C до нескольких недель до использования.
    2. Подготовьте стретч-носитель MSC.
      1. Приготовьте МСК для стретч-среды, добавив 140 мкл аскорбиновой кислоты (запас: 100x, конечная концентрация: 50 мкг/мл) к 14 мл предварительно нагретой среды MSC в конической пробирке объемом 15 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Аскорбиновую кислоту необходимо добавлять свежей в среду MSC перед каждой сменой среды.
  2. Засеивание iMSCSCX+ в силиконовые пластины
    1. Выполните «Стандартный протокол лифтинговых ячеек» (шаг 1.3).
    2. Ресуспендируйте клетки в среде МСК и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
    3. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для получения 1,25 х 104 клеток/см2.
    4. Извлеките этот объем эластичного материала MSC из конической пробирки объемом 15 мл. Добавьте целевые ячейки. Инвертируют в однородную новую клеточную суспензию.
    5. Добавьте 400 мкл новой клеточной суспензии в каждую лунку обеих силиконовых пластин.
    6. Накройте крышкой пластины диаметром 150 мм и верните их в инкубатор при температуре 37 °C на 24 часа.
  3. Одноосное растяжение
    1. На следующий день промойте растяжной аппарат (см. Таблицу материалов) ddH2O с последующим добавлением 70% этилового спирта. Протрите аппарат, поместите его в колпак для клеточных культур и ультрафиолетовое излучение в течение 15 минут.
    2. Извлеките засеянные пластины и проверьте лунки на хорошее прикрепление клеток.
    3. Оставьте одну пластину в инкубаторе (статический контроль) и поместите вторую засеянную силиконовую пластину в растяжной аппарат, совместив винты с отверстиями в силиконовой пластине. Закройте крышку на аппарате, чтобы обеспечить стерильность.
    4. Прикрепите аппарат с засеянной силиконовой пластиной к электронному источнику (см. Таблицу материалов) и поместите его в инкубатор при температуре 37 °C.
    5. В программе установите протокол циклического растяжения на 4% синусоидальную нагрузку, 0,5 Гц, 2 ч в сутки. Начните растяжку, нажав кнопку запуска один раз. Растяжка должна начинаться незамедлительно.
    6. Растягивают клетки минимум на 3 дня. Ежедневно наблюдайте за клетками и прекращайте протокол растяжения, если наблюдается сокращение клеток. Меняйте носитель на новый стретч-носитель MSC через день.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Дифференциация ИПСК человека в ИМСК
Как было описано ранее, современный протокол дифференцировки ИПСК в МСК предполагает формирование эмбриоидных тел2. Этот процесс занимает около десяти дней, чтобы индуцировать МСК из ИПСК (рис. 1А). Тем не менее, настоятельно рекомендуется сдавать вновь сгенерированные iMSC не менее двух раз. Это не только устраняет необходимость в пластинах с желатиновым покрытием, но и обеспечивает стабильную экспрессию МСК. Ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе iTenoциты генерируются через три основных этапа: (1) индукция ИПСК в МСК, (2) гиперэкспрессия SCX с использованием лентивирусного вектора и (3) созревание клеток посредством 2D одноосного натяжения.

Представленный протокол дифференциации ИПСК в МСК был ранее описан нашей группой2. С момента публикации было разработано множество протоколов, в том числе установленный протокол использования МСК в клинических исследованиях 21,22,23, а также коммерчески дост...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У всех авторов нет конфликта интересов, подлежащего раскрытию.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано NIH/NIAMS K01AR071512 и CIRM DISC0-14350 Дмитрию Шейну. Две лентивирусные упаковочные плазмиды были подарком лаборатории Саймона Нотта (Департамент биомедицинских наук, Медицинский центр Седарс-Синай).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанол Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920реагент для диссоциации клеток
Антибиотик-антимикотический растворThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC мышь против человека CD44BD Biosciences559942
APC мышь IgG2 K контроль изотипаBD Biosciences555745
BenchMark фетальная бычья сывороткаGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
бычья сыворотка альбуминMillipore SigmaA3733
Коллаген I типа альфа 1 цепь человеческий Такман праймерThermofisherHs00164004_m1
Коллаген тип III альфа 1 цепь человека Такман праймерThermofisherHs00943809_m1
ДиметилсульфоксидMillipore SigmaD8418
DMEM, с низким содержанием глюкозы, пируват, без глутамина, без фенола красныйThermofisher11054020
Eagle's minimum essential media (EMEM)ATCC30-2003
Фибронектин бычьей плазмыSigma AldrichF1141
FITC мышиный античеловеческий CD90BD Biosciences555595
желатин из свиной кожиSigma AldrichG1890
козий анти-мышиный IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, без фенола красногоThermofisher21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Антитело, мышь IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
Замена сывороткиKnockOut Thermofisher10828010
L-аскорбиновой кислотойSigma AldrichA4544
L-глутаминThermofisher2503081
MatrigelCorning354230матрица базальной мембраны
MechanoCulture FXCellScaleN/Aрастягивающий аппарат
MEM раствор заменимых аминокислотThermofisher11140050
Mohawk человеческий праймер Taqman праймерThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Рецептор тромбоцитарного фактора роста A Человеческий праймер TaqmanThermofisherHs00998018_m1
Поли(2-гидроксиэтилметакрилат)Sigma Aldrich192066
Полибреновые реагенты для инфекции/трансфекцииMillipore SigmaTR-1003
Рекомбинантный человек  TGF-beta 1 protein human Taqman primerRnD Systems240-B
Scleraxis human Taqman primerThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) человек меченый ORF клонOriGeneRC224305L4
силиконовые пластиныCellScaleN/A
Азид натрияMillipore SigmaS2002
Tenascin C Праймер Такман для человекаThermofisherHs00370384_m1
Теномодулин Праймер Такман для человекаТермофишерHs00223332_m1
Тромбоспондин 4 Такман для человекаРеагент для
BioTBioland Scientific LLCB01-01
Трипсин-ЭДТА (0.25%)Thermofisher25200072
Член семейства белков, способствующих полимеризации тубулина 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 дигидрохлоридBiogems1293823
трансфекции Thermofisher Hs00170261_m1,

Ссылки

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11(2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905(2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977(2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Индуцированные плюрипотентные стволовые клеткигенерация i-теноцитовмезенхимальные стромальные клеткирегенерация сухожилийклеточная терапиярастяжение в биореактореотложение коллагенаанализ экспрессии генов
Генерация индуцированных плюрипотентных iTenoцитов, полученных из стволовых клеток, с помощью комбинированной гиперэкспрессии Склеракса и 2D одноосного натяжения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.