Методическая статья
Здесь мы представляем протокол визуализации транспорта монокарбоксилатов, глюкозы и АТФ в глиальных клетках и нейронах с использованием генетически закодированных датчиков резонансной передачи энергии Фёрстера в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo .
Высокая потребность мозга в энергии из-за электрической активности является одной из его наиболее отличительных особенностей. Этим требованиям удовлетворяет производство АТФ из глюкозы и ее метаболитов, таких как монокарбоксилаты лактат и пируват. До сих пор неясно, как регулируется этот процесс и кто является ключевыми игроками, особенно в случае с дрозофилами.
Используя генетически закодированные датчики переноса энергии резонанса Фёрстера, мы представляем простой метод измерения транспорта монокарбоксилатов и глюкозы в глиальных клетках и нейронах в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo . Протокол описывает, как препарировать и прикрепить мозг личинки, экспрессирующий один из датчиков, к стеклянному покровному стеклу.
Мы представляем результаты целого эксперимента, в котором транспорт лактата измерялся в мозге личинок путем сбивания ранее идентифицированных монокарбоксилатных транспортеров в глиальных клетках. Кроме того, мы демонстрируем, как быстро повысить нейронную активность и отслеживать метаболитные изменения в активном мозге. Описанный метод, дающий всю необходимую информацию, может быть использован для анализа других живых тканей дрозофилы .
Мозг предъявляет высокие потребности в энергии из-за высоких затрат на восстановление ионных градиентов в нейронах, вызванных генерацией и передачей нейрональных электрических сигналов, а также синаптической передачей 1,2. Долгое время считалось, что эта высокая потребность в энергии удовлетворяется за счет непрерывного окисления глюкозы с образованиемАТФ3. Специфические транспортеры на гематоэнцефалическом барьере переносят глюкозу из крови в мозг. Постоянный уровень гликемии гарантирует, что мозг получает стабильное поступление глюкозы4. Интересно, что растущее....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
1. Поддержание штамма мух и синхронизация личинок
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В течение 1 ч эта процедура позволяет легко измерять внутриклеточные изменения флуоресценции монокарбоксилатных и глюкозных сенсоров. Как показано на рисунке 4, лаконичные сенсоры как в глиальных клетках, так и в двигательных нейронах реагируют на лактат 1 мМ с одинаковой скоростью в начале импульса, но двигательные нейроны достигают более высокого увеличения по сравнению с исходным уровнем в течение 5-минутного импульса,как было продемонстрировано ранее. Эта концентр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Использование модели дрозофилы для изучения метаболизма мозга являетсяотносительно новым, и было показано, что она имеет больше общих характеристик с метаболизмом млекопитающих, чем ожидалось, который в основном изучался in vitro в культурах первичных нейронов или срезах мозга. Дрозофила преуспевает в экспериментах in vivo благодаря батарее генетических инструментов и генетически закодированных сенсоров, которые позволяют исследователям визуализировать в режиме .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.
Мы благодарим всех сотрудников Sierralta Lab. Эта работа была поддержана FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGG) и FONDECYT Regular 1210586 (JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (датчик глюкозы) был любезно предоставлен Пьером-Ивом Пласе (Pierre-Yves Plaçais) и Томасом Преатом (Thomas Preat), CNRS-Paris.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD камера ORCA-R2 | Hamamatsu-Cell-R | ||
| Программное обеспечение | |||
| Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver | |
| Dumont # 5 Щипцы | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-эмиссионная система расщепления | Фотометрия-Стеклянные | ||
| покровные стекла (диаметр 25 мм) | Marienfeld | 111650 | |
| Германия Глюкоза | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Версия программного обеспечения | 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ программное обеспечение | Национальные институты здравоохранения | Версия 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 водный иммерсионный объектив | Olympus-Methylparaben | ||
| Sigma | H5501 | ||
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Драйвер моторных нейронов | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | ВНИМАНИЕ-Смертельный исход при проглатывании |
| Poly-L-лизин | Sigma | P4707 | |
| Пропионовая кислота | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Драйвер глиальных клеток (все) |
| Лактат натрия | Sigma | 71718 | |
| Пируват натрия | Sigma | P2256 | |
| Флуоресцентный микроскоп с вращающимся диском BX61WI | Olympus-Sucrose | ||
| Sigma | S0389 | ||
| Трегалоза | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Киотский фондовый центр дрозофилы | 117012 | датчик АТФ |
| UAS-CHK RNAi GD1829 | Венский ресурсный центр дрозофилы | v37139 | Chk RNAi линия |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Датчик глюкозы |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Датчик кальция |
| UAS-Laconic | Sierralta | Lab-Lactate | сенсор |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paris | ||
| UMPlanFl 20x/0.5 объектив погружения в воду | Olympus | - |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение