В данной работе мы представляем модель крысы с закрытой черепно-мозговой травмой (мЧМТ) и ее валидацию, демонстрирующую значительное сходство с ЧМТ человека в отношении поведенческих проявлений на острой и подострой стадиях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Крысиная модель закрытой черепно-мозговой травмы легкой степени тяжести и ее валидация
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Животные модели имеют решающее значение для углубления нашего понимания легкой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и руководства клиническими исследованиями. Для получения значимых выводов необходимо разработать стабильную и воспроизводимую модель животного. В этом исследовании мы сообщаем подробное описание модели мЧМТ с закрытой головкой и репрезентативный метод валидации с использованием крыс Спрэга-Доули для проверки эффекта моделирования. Модель предполагает сброс массы массой 550 г с высоты 100 см прямо на голову крысы на разрушаемой поверхности с последующим поворотом на 180 градусов. Чтобы оценить травму, крысы прошли серию нейроповеденческих оценок через 10 минут после травмы, включая время потери сознания, время первого поиска, способность к бегству и тест на способность балансировать на бревне. Во время острой и подострой стадий после травмы были проведены поведенческие тесты для оценки способности к координации движений (задание Beam), тревожности (тест Open Field), а также способностей к обучению и памяти (тест Morris Water Maze). Модель ЧМТ с закрытой головкой обеспечивала последовательную реакцию на травму с минимальной смертностью и воспроизводила реальные жизненные ситуации. Метод валидации эффективно верифицировал разработку модели и обеспечил стабильность и непротиворечивость модели.
Введение
Легкая черепно-мозговая травма (ЧМТ), или сотрясение мозга, является наиболее распространенным типом травмы и может приводить к различным кратковременным и хроническимсимптомам1. Эти симптомы могут включать головокружение, головные боли, депрессию и ангедонию, среди прочего, что приводит к значительным страданиям людей, страдающих ЧМТ2. Поскольку большинство ЧМТ вызваны травмой тупым предметом3, становится обязательным разработать модели животных, которые точно имитируют такие травмы. Эти модели необходимы для лучшего понимания травмы и лежащих в ее основе механизмов, предлагая контролируемую среду с меньшей вариабельностью и гетерогенностью по сравнению с исследованиями на людях.
Для черепно-мозговой травмы (ЧМТ) было разработано множество хорошо зарекомендовавших себя моделей грызунов, включая перкуссионное повреждение (FPI)4, контролируемое корковое воздействие (CCI)5, травму падением веса6, взрывную черепно-мозговую травму7 и другие. Однако эти модели в первую очередь ориентированы на воспроизведение сценариев ЧМТ средней и тяжелой степени. В отличие от этого, экспериментальные модели, специально разработанные для моделирования ЧМТ, привлекли относительно меньше внимания и остаются малоизученными8. Таким образом, существует острая необходимость в создании стабильной и воспроизводимой модели животных, которая точно представляет мЧМТ. Такая модель значительно расширила бы наше понимание нейробиологических и поведенческих последствий, связанных с ЧМТ.
Невозможно отличить функциональный дефицит у крыс с ЧМТ по сравнению с нормальными крысами при случайном наблюдении после того, как действие анестезии прошло. Поэтому необходимо проводить специфические тесты. У людей для оценки пациентов используется широкий спектр клинических оценок 9,10,11. Аналогичным образом, создание успешной модели на крысах также требует использования инструментов быстрой оценки для определения ее валидности.
В этом исследовании мы представляем модель крысы с закрытой головой с мЧМТ, позволяющую исследовать мЧМТ способом, максимально приближенным к человеческому состоянию. Подробное описание модели и процедуры ее валидации дает всестороннее представление об экспериментальном подходе, используемом при изучении ЧМТ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию при Центрально-Южном университете. Все исследования проводились в соответствии с принципами благополучия и этики лабораторных животных.
1. Кормление и обезболивание животных
- Групповое содержание 280-320 г крыс-самцов Спрэг-Доули и содержание их в цикле 12 ч/12 ч свет/темнота с доступом к пище и воде вволю. Исследование проводят после того, как крысы акклиматизируются в течение 6 дней.
- Обезболивайте крысу 3% изофлураном при потоке воздуха 0,6 л/мин в индукционной коробке до тех пор, пока она не перестанет реагировать на пощипывание лапы или хвоста. Поддерживайте скорость потока в течение 30 с.
Примечание: Обезболивающие препараты не использовались, так как они могли повлиять на реакцию крысы в нейроповеденческих оценках.
2. Предоперационная подготовка
- Поместите губку с твердостью 35D (вес губки 35 кг/м3), одинаковой длины и ширины, но толщиной 12 см, в акриловую коробку (15 см x 22 см x 43 см) без верхней крышки.
- Обрежьте оловянную фольгу (толщиной 20 мкм) и прикрепите ее к акриловой коробке с помощью клейкой ленты, чтобы сформировать разрушаемую поверхность, способную выдержать вес крысы. Кроме того, отметьте линию разреза размером примерно 10 см, чтобы она была обозначенным местом для размещения головы крысы.
- С помощью железной подставки прочно закрепите трубку из ПВХ на месте. Приготовьте перфорированную гирю, весом 550 грамм с диаметром 18 миллиметров. Прикрепите груз к леске на высоте 1 метра внутри трубки из поливинилхлорида или ПВХ. и отрегулируйте положение направляющей трубки на 3 сантиметра выше фольги.
- Подготовьте шлем и подушку. Сделайте шлем, используя диск из нержавеющей стали диаметром 10 мм и толщиной 3 мм. Подготовьте клиновидную губчатую подушку, чтобы положить ее под голову крысы, следя за тем, чтобы она была перпендикулярна направлению силы тяжести.
ПРИМЕЧАНИЕ: Принципиальная схема ударного аппарата представлена на рисунке 1. Шлем служит для определения места удара и улучшения распределения внешней силы. Подушка используется для обеспечения равномерного и стабильного повреждения.
3. Индукция ЧМТ
- Быстро положите крысу под наркозом на грудь на оловянную фольгу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для индукции ЧМТ требуются два оператора - один для подготовки, а другой для верификации. - Подготовка: Подложите подушку под крысу, убедившись, что ее голова параллельна фольгированной бумаге. Совместите шлем с ушами крысы и закрепите его на месте.
- Проверка: Убедитесь, что труба из ПВХ расположена прямо над шлемом. После того, как оба оператора подтвердят правильность настройки, переходите к следующему шагу.
- Индукция вращения головы: отпустите груз, позволив ему упасть и ударить по голове крысы, вызвав падение на губку и поворот на 180°.
- Положите крысу на спину в чистую клетку.
4. Фиктивная индукция
- Относитесь к крысе так же, как и к предыдущему описанию индукции ЧМТ, но не подвергайте ее удару головой.
5. Процедура валидации: Острая нейроповеденческая оценка
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие оценки были изменены на основе шкалы неврологической тяжести9 и протокола Flierl et al.10. Все эти оценки проводили через 10 минут после того, как у крысы восстановился рефлекс выпрямления.
- Время потери сознания: Запишите продолжительность с момента, когда крыса находится под наркозом, до момента, когда у нее восстанавливается рефлекс выпрямления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс выпрямления - это процесс, при котором крыса переворачивается, когда ее кладут на спину. Потеря рефлекса выпрямления должна рассматриваться как гуманная конечная точка, и животное должно быть усыплено в соответствии с рекомендациями учреждения. - Время первого поискового поведения: Запишите время с момента, когда крыса находится под наркозом, до момента, когда она впервые демонстрирует поисковое поведение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поисковое поведение является признаком интереса к окружающей среде, физиологической реакцией. - Возможность побега
- Поместите крысу в середину круглого аппарата (диаметром 0,5 м и высотой 0,3 м) с выходом (длиной 12,5 см и шириной 9 см).
- Запишите время, необходимое крысе, чтобы выйти из круга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если крыса не выходит из круга в течение 180 с, запишите время как 180 с.
- Испытание на способность к балансировке балки
- Поместите крысу на балку шириной 3 см, 2 см и 1,5 см на 1 минуту соответственно.
- Если крыса сохраняет равновесие с устойчивым положением на бревне, оценка равна 0.
- Если крыса ухватилась за боковую сторону балки, поставьте оценку 1. Если крыса обнимает бревно и одна конечность падает с него, оценивайте это как 2.
- Если крыса обнимает балку, и две конечности падают с нее или вращаются на ней (>60 с), оценивайте ее как 3.
- Если крыса пытается балансировать на бревне, но падает (> 40 с), оценивайте это как 4.
- Если крыса пытается балансировать на бревне, но падает (>20 с), оценивайте это как 5.
- Если крыса не пытается удержать равновесие или повиснуть на бревне и падает в течение 20 с, оценивайте ее в 6 баллов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Испытание баланса балки не требует предварительного испытания.
6. Процедура валидации: Оценка нейроповедения
Примечание: До проведения поведенческих экспериментов крыс обрабатывали в течение 2 минут ежедневно в течение 3 дней подряд, чтобы свести к минимуму стресс и нарушение новизны. Все поведенческие эксперименты проводились путем помещения животных в тестовую среду за 60 минут до начала эксперимента.
- Координация движений (задание «Луч»)
- Экспериментальная установка
- Поместите крыс на один конец бревна (длиной 1,5 м и высотой 75 см над полом). Поместите на другой конец ящик для побега (домашнюю клетку с наклонной подстилкой).
- Расположите пенопластовую прокладку под балкой, чтобы снизить потенциальный риск травмирования крыс в случае падений во время испытания.
- Включите видеокамеру.
- Запланируйте дни тестирования в определенные моменты времени после травмы или после симуляции лечения (например, день 1, день 3 и день 7).
- Тренировочный этап (2 дня)
- Обучите крыс пересекать балку шириной 4 см 3 раза подряд, а затем два раза на балке шириной 2 см.
- Во время дрессировки осторожно направляйте крыс через балку до тех пор, пока они не смогут легко пересечь ее без помех.
- Эксперимент с балансиром
- Поместите крыс на балку шириной 2 см в течение 5 последовательных попыток.
- Записывайте начало и конец каждого испытания, когда нос крысы пересекает линию старта и финиша соответственно.
- Верните крыс в клетки по окончании эксперимента.
- Базовое тестирование
- Проведите эксперимент на бревне перед травмой или лечением.
- Рассчитайте средние значения из этих 5 последовательных испытаний, чтобы установить исходный уровень для каждой крысы.
- Анализ данных
- Проанализируйте время, необходимое для пересечения луча, и общее количество скольжений задней лапы с помощью видеоанализа, проведенного исследователями, не обращающими внимания на условия эксперимента.
- Экспериментальная установка
- Тревожность (тест в открытом поле)
- Экспериментальная установка
- Подготовьте арену для открытого поля, убедившись, что она чистая и без каких-либо предыдущих запахов. Разделите арену на три зоны: центральную внутреннюю зону (33 см х 33 см), среднюю зону (66 см х 66 см) и внешнюю зону.
- Этап тестирования
- Поместите крысу в центр арены открытого поля и запустите таймер. Дайте крысе свободно исследовать арену в течение 5 минут. Через 5 мин осторожно и аккуратно верните крысу в домашнюю клетку.
- Сбор данных
- Измерьте общее расстояние, пройденное крысой за 5-минутный период исследования. Определите время, которое крыса проводит в центральной внутренней, средней и внешней зонах.
- Анализ данных
- Используйте общее пройденное расстояние в качестве меры общего исследовательского поведения и двигательных способностей. Рассчитайте время, проведенное в центральной внутренней зоне, как показатель тревожных реакций.
- Экспериментальная установка
- Способность к обучению и памяти (тест водного лабиринта Морриса)
- Убедитесь, что устройство водного лабиринта находится в надлежащем состоянии. Покрасьте воду в черный цвет и расставьте кии по четырем сторонам света. Расположите платформу на 2,5 см ниже поверхности воды.
- Настройте систему мониторинга для записи и наблюдения за поведением крыс.
- Трейл-день
- Быстро поместите крысу в водный лабиринт. Если крыса не доберется до платформы в течение 2 минут, осторожно направьте ее деревянной палкой.
- Дайте крысе ознакомиться с окружением лабиринта, стоя на платформе в течение 20 секунд, затем уберите ее. Как только крыса окажется на платформе, дайте ей постоять 20 секунд, затем удалите ее.
- Ежедневное повторение
- Повторите процедуру тренировочного дня, помещая крысу в воду из разных квадрантов. Повторите шаг 6.3.3. Продолжайте тренировку в течение 5 дней подряд.
- Тестовый день с помощью зонда: На6-й день снимите платформу и поместите крысу в тот же квадрант на 2 минуты.
- Наблюдение и запись: Используйте систему мониторинга для наблюдения за поведением крысы в дни испытаний и зондовых испытаний.
- Очистка: После извлечения крысы из водного лабиринта используйте полотенце, чтобы тщательно высушить ее.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Аппарат, использованный в этой работе, представлял собой модифицированную версию модели Кейна и педиатрической модели11,12 Ришель Михасюк. В этом исследовании крысы SD были распределены в группы с симуляцией и ЧМТ. Чтобы продемонстрировать воспроизводимость этой модели, мы провели три независимых повторения этой модели вместе с острой нейроповеденческой оценкой, в каждом эксперименте участвовало 8-12 крыс. В этом исследовании мы и...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта модель успешно имитирует ЧМТ с закрытой головкой без необходимости разреза кожи головы или вскрытия черепа, обеспечивая более точное представление сценария воздействия, наблюдаемого в случаях с людьми. Избегание разреза кожи головы помогает предотвратить воспалительные реакции, которые могут не соответствовать реальной ситуации. По сравнению с педиатрической моделью12 Ришель Михасюк, модель, используемая в этом исследовании, специально адаптирована для взрослых крыс весом от 280 до 320 г, что ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют финансовой заинтересованности в раскрытии информации.
Благодарности
Мы хотим поблагодарить всех стипендиатов кафедры лабораторных животных Центрального Южного университета. Исследование выполнено при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (No 81971791); Шанхайская ключевая лаборатория судебной медицины, Ключевая лаборатория судебной медицины, Министерство юстиции, Китай (Академия судебной экспертизы) (No. KF202104).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Акриловая коробка | собственного производства | Н/Д | 15 см x 22 см x 43 см |
| Наркозный аппарат | RWD Life Science Co. | R540 Мыши и Маска для анестезии | |
| Собственный | Н/Д | Диск из нержавеющей стали диаметром 10 мм и толщиной 3 мм | |
| Водный лабиринт Morris | RWD Life Science Co. | Диаметр 150 см, высота 50 см, диаметр платформы 35 см | |
| Открытое поле | RWD Life Science Co. | 63007 | Ширина100 см, высота 40 см |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Перфорированный груз | Н/ | Д | Нет Вес 550 г и диаметр 18 мм |
| Подушка | Нет У Н | /Д | Клиновидная губка для размещения под головой крысы |
Ссылки
- Silverberg, N. D., Duhaime, A. C., Iaccarino, M. A. Mild traumatic brain injury in 2019-2020. JAMA. 323 (2), 177-178 (2020).
- Kim, K., Priefer, R. Evaluation of current post-concussion protocols. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110406(2020).
- Peeters, W., et al. Epidemiology of traumatic brain injury in Europe. Acta Neurochirurgica (Wien). 157 (10), 1683-1696 (2015).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Smith, D. H., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. Journal of Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Research. 211 (1), 67-77 (1981).
- Cernak, I., et al. The pathobiology of blast injuries and blast-induced neurotrauma as identified using a new experimental model of injury in mice. Neurobiology of Disease. 41 (2), 538-551 (2011).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76 (Pt B), 396-414 (2017).
- Chen, J., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 32 (4), 1005-1011 (2001).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neuroscience Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
- Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: A novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).
- Jacotte-Simancas, A., Molina, P., Gilpin, N. W. Repeated mild traumatic brain injury and JZL184 produce sex-specific increases in anxiety-like behavior and alcohol consumption in Wistar rats. Journal of Neurotrauma. , (2023).
- Levin, H. S., et al. Association of sex and age with mild traumatic brain injury-related symptoms: A TRACK-TBI study. JAMA Network Open. 4 (4), e213046(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
