Мультиплексное иммуногистохимическое окрашивание тканей рака легкого, залитых парафином

Тираминовая амплификация сигнала (TSA), которая имеет более чем 20-летнюю историю, представляет собой класс методов анализа, в которых используется пероксидаза хрена (HRP) для мечения целевых антигенов in situ высокой плотности и широко применяется в иммуноферментных анализах (ИФА), гибридизации in situ (ISH), иммуногистохимии (IHC) и других методах обнаружения биологических антигенов. существенное повышение чувствительности детектируемого сигнала¹. Опаловое полихроматическое окрашивание по технологии TSA было разработано недавно и широко используется в нескольких исследованиях 2,3,4,5. Традиционное иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание предоставляет исследователям простой инструмент для обнаружения и сравнения распределения белков в клетках и тканях различных модельных организмов. Он основан на связывании антитело/антиген-специфического и включает в себя прямой и косвенный подходы⁶. Прямое иммуноокрашивание предполагает использование флуорофор-конъюгированного первичного антитела против интересующего антигена, что позволяет проводить прямое флуоресцентное обнаружение с помощью флуоресцентного микроскопа. Подход непрямого иммуноокрашивания заключается в применении флуорофор-конъюгированного вторичного антитела против неконъюгированного первичного антитела ^6,7.

Традиционные, однометочные, иммунофлуоресцентные методы окрашивания могут окрашивать только один, два или, в некоторых случаях, три антигена в тканях, что является основным ограничением в извлечении богатой информации, содержащейся в срезах тканей. Интерпретация количественных результатов часто зависит от визуального наблюдения и точной количественной оценки с помощью программного обеспечения для визуализации, такого как ImageJ. Существуют технические ограничения, такие как ограничение видов антител, слабые сигналы флуоресцентных меток и наложение цветов флуоресцентных красителей (табл. 1). Методика Opal multiplex IHC (mIHC) основана на производной TSA, которая позволяет проводить мультиплексное окрашивание и дифференциальное мечение более 7-9 антигенов на одном участке ткани, без ограничения происхождения первичного антитела, но требует высокой специфичности соответствующего антитела к антигену. Процедура окрашивания аналогична обычному иммунофлуоресцентному окрашиванию, за исключением двух отличий: каждый раунд окрашивания включает в себя использование только одного антитела и добавляется этап элюирования антител. Антитела, связанные с антигеном нековалентными связями, могут быть удалены микроволновым элюированием, но флуоресцентный сигнал TSA, связанный с поверхностью антигена ковалентными связями, сохраняется.

Активированные молекулы тирамина (Т), меченные красителем, высоко обогащены антигеном-мишенью, что позволяет эффективно усиливать флуоресцентный сигнал. Это позволяет напрямую маркировать антиген без интерференции антител, а затем многоцветное мечение может быть достигнуто после нескольких циклов окрашивания ^8,9,10 (рис. 1). Несмотря на то, что эта технология позволяет получать надежные и точные изображения для изучения заболеваний, создание полезной мультиплексной стратегии флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания (mfIHC) может быть трудоемким и точным из-за необходимости обширной оптимизации и проектирования. Таким образом, этот протокол мультиплексной панели был оптимизирован в автоматизированной окрашивателе IHC с более коротким временем окрашивания, чем у ручного протокола. Этот подход может быть непосредственно применен и адаптирован любым исследователем для иммуноонкологических исследований образцов тканей, зафиксированных формалином и залитых парафином (FFPE) тканей человека¹¹. Кроме того, методы подготовки предметных стекол, оптимизации антител и мультиплексного дизайна будут полезны для получения надежных изображений, представляющих точные клеточные взаимодействия in situ, и для сокращения периода оптимизации для ручного анализа¹².

mfIHC в основном включает в себя получение изображений и анализ данных. С точки зрения получения изображений, многоцветные меченые сложные образцы должны быть обнаружены с помощью профессионального оборудования спектральной визуализации для идентификации различных смешанных цветовых сигналов и получения изображений с высоким соотношением сигнал/шум без помех от тканевой автофлуоресценции. Современное оборудование для спектральной визуализации в основном включает в себя спектральные конфокальные микроскопы и мультиспектральные системы визуализации тканей. Мультиспектральная система визуализации тканей представляет собой профессиональную систему визуализации, предназначенную для количественного анализа срезов тканей, и ее важнейшей особенностью является получение спектральной информации изображения, которая обеспечивает как морфологическую структуру, так и информацию об оптическом картировании образцов биологических тканей^13,14. Любой пиксель в спектральном изображении содержит полную спектральную кривую, и каждый краситель (включая автофлуоресценцию) имеет свой соответствующий характеристический спектр, что позволяет полностью регистрировать и точно идентифицировать смешанные и перекрывающиеся многометочные сигналы.

С точки зрения анализа данных, многоцветные меченые образцы чрезвычайно сложны из-за морфологической структуры и составляющих клеток образцов тканей. Обычное программное обеспечение не может автоматически идентифицировать различные типы тканей. Таким образом, интеллектуальное программное обеспечение для количественного анализа экспрессии антигена в определенных областях 15,16,17,18 используется интеллектуальное программное обеспечение для количественного анализа тканей.

Прежде всего, многометчатое иммунофлуоресцентное окрашивание в сочетании с мультиспектральной визуализацией и технологией количественного анализа патологии обладает такими преимуществами, как большое количество мишеней для обнаружения, эффективное окрашивание и точный анализ, и, следовательно, оно может значительно повысить точность гистоморфологического анализа, выявить пространственные отношения между белками с разрешением на клеточном уровне и помочь извлечь более богатую и надежную информацию из образцов срезов тканей¹⁹ (Таблица 1).

Протокол утвержден руководящими принципами Комитета по этике Западно-Китайского госпиталя Сычуаньского университета, Китай. Образцы ткани рака легких были получены во время операции в Центре рака легких Западно-Китайского госпиталя, и от каждого пациента было получено информированное согласие.

1. Подготовка тканевого среза

1. Подготовка к FFPE
   1. Погрузить клинические ткани в нейтральный раствор формалина более чем на 72 ч.
   2. Завершают процесс обезвоживания тканей с помощью ксилола и градуированных спиртовых растворов²⁰.
   3. Выполняйте ручное заделывание парафина и секционирование тканей при толщине секции 4 мкм. Используйте предметные стекла адгезионного микроскопа, чтобы убедиться, что срезы ткани не выпадают.
   4. Выпекайте предметные стекла в духовке при температуре 65 °C в течение 2 часов, чтобы ткань и предметные стекла высохли. Хранить в коробке для слайдов при комнатной температуре.
2. Предварительная обработка срезов тканей
   1. Предварительно обработайте предметные стекла ткани в духовке при температуре 65 °C в течение 5 мин, а затем последовательно погрузите в растворы ксилола на 2 x 15 мин, безводные растворы этанола на 2 x 15 мин, 90% раствор этанола на 10 мин, 85% раствор этанола на 10 мин, 80% раствор этанола на 10 мин и 75% раствор этанола на 10 мин, Затем промывание предметных стекол стерилизованной водой в течение 3 х 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот экспериментальный метод может быть использован только для тканей FFPE, а не для замороженных или свежих тканей, так как процесс репарации множественными высокотемпературными антигенами приводит к тому, что ткань отпадает от предметного стекла.

2. Оптимизация первичных антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения условий инкубации отдельных антител, в основном включая концентрацию антител и условия репарации антигенов, использовались обычные эксперименты с ИГХ. Обратитесь к условиям, приведенным в инструкции по применению антител.

1. Используйте концентрацию антител немного выше рекомендуемого диапазона концентраций и промежуточных значений.
2. Оптимизируйте процедуры извлечения антигенного буфера PH6 и PH9 в соответствии с локализацией экспрессии белка. Используйте PH9 для белков, экспрессируемых в ядре, и используйте рутину (PH6 или PH9) для других белков.

3. Метод окрашивания mIHC

ПРИМЕЧАНИЕ: Опаловое окрашивание mIHC является одним из доступных методов mIHC. В этом экспериментальном 5-цветном протоколе, поскольку каждый образец ткани должен быть окрашен четырьмя антителами, необходимы четыре инкубации первичных антител, инкубация вторичных антител и хромогенная инкубация с амплификацией сигнала TSA, а также пять реставраций антигенов. Наконец, выполняется окрашивание 4'6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и герметизация антифлуоресцентным разрывным агентом.

1. Приготовление основных реагентов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Определите количество добавляемого реагента в соответствии с размером тканевых предметных стекол. Используйте достаточный объем, чтобы полностью покрыть участок ткани (как правило, 50-150 мкл на предметное стекло). Рабочие растворы, необходимые для эксперимента, готовят следующим образом:
   1. Рабочий раствор буфера для промывки: разбавьте буфер для промывки в 20 раз в соотношении 1:20 водой двойной дистилляции и храните при комнатной температуре.
   2. Буферный рабочий раствор PH6: Разбавьте буфер PH6 в соотношении 1:100 двойной дистиллированной водой. Перед употреблением подготовить и хранить при комнатной температуре.
   3. Буферный рабочий раствор PH9: Разбавьте 50x буфер PH9 в соотношении 1:50 двойной дистиллированной водой. Перед употреблением подготовить и хранить при комнатной температуре.
   4. Полимерный HRP: Готовьте этот готовый к применению раствор только для первичных антител кролика и мышиного происхождения.
   5. Рабочий раствор флуорофора: Восстановите каждый порошок флуорофора (кроме флуорофора 780) в 75 мкл ДМСО. Перед каждой процедурой разбавляйте флуорофор в 1-кратном амплификационном разбавителе в соотношении 1:100. Выбросьте неиспользованную часть рабочего раствора флуорофора.
   6. Рабочий раствор флуорофора 780: Восстановите TSA-DIG в 75 мкл ДМСО и порошок флуорофора 780 в 300 мкл воды двойной дистиллированной воды. Перед процедурой разбавьте TSA-DIG в 1х амплификационном разбавителе в соотношении 1:100 и разбавьте флуорофор 780 разбавителем Ab в соотношении 1:25.
   7. Рабочий раствор DAPI: Разбавьте раствор DAPI в соотношении 1:50 водой двойной дистилляции или PBS. Перед употреблением подготовить и хранить при температуре 4 °C не более 48 ч.
      ЗАМЕТКА. Мойте предметные стекла только двойной дистиллированной водой и свежеприготовленным рабочим раствором буфера для промывки на протяжении всего эксперимента по флуоресцентному окрашиванию с несколькими этикетками. Срезы тканей не должны соприкасаться с водопроводной водой; Загрязняющие вещества в водопроводной воде могут прилипать к срезам тканей и вызывать автофлуоресценцию. Держите образцы вдали от света на протяжении всего эксперимента.
2. Извлечение антигена
   1. Поместите предметные стекла в коробку для окрашивания и ремонта, заполните ее буферным рабочим раствором PH6 или PH9, накройте крышкой и нагревайте в микроволновой печи в течение 2 x 8 минут при 100% мощности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте двойную дистиллированную воду в ремонтную коробку во время процесса нагрева, чтобы предотвратить чрезмерное испарение, которое может привести к высыханию ломтиков.
   2. Дайте предметным стеклам остыть при комнатной температуре, прежде чем продолжить (30-60 минут).
   3. Промойте горки 3 x 2 мин водой двойной дистиллированной воды. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы обхватить участок ткани на предметном стекле.
3. Блокировка
   1. Срезы тканей погрузить в промывочный буфер, покрыть блокирующим раствором и инкубировать предметные стекла в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Инкубация первичных антител
   1. Удалите блокирующий раствор с предметных стекол и покройте участки тканей рабочим раствором первичных антител. Инкубируют предметные стекла в увлажненной камере в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе или в течение ночи при 4 °C в холодильнике.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания слайдов.
5. Внедрение полимерного HRP
   1. Промыть предметные стекла в рабочем растворе промывочного буфера в течение 3 х 2 мин. Добавьте полимер HRP непосредственно по каплям на срезы ткани и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для предметных стекол, хранящихся в холодильнике, держите их при комнатной температуре примерно 30 минут перед стиркой, чтобы удалить первичные антитела.
6. Генерация усиления сигнала тирамина (TSA)
   1. Промыть предметное стекло рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин, добавить рабочий раствор флуорофора непосредственно по каплям в срезы ткани и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть предметное стекло рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин.
7. Специальная процедура для флуорофора 780
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуорофор 780 является слабым и обычно занимает последнее место в схеме подбора цветов во всем эксперименте. Флуорофор 780 обычно не используется в этом экспериментальном протоколе, но из-за его специфичности его экспериментальные этапы перечислены.
   1. Внедрение TSA-DIG
      1. Промыть предметное стекло рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин, добавить рабочий раствор TSA-Drg по каплям в срезы тканей и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
   2. Микроволновая обработка
      1. Промыть предметные стекла рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин.
      2. Поместите предметные стекла в коробку для окрашивания и ремонта, наполните ее ремонтным раствором, накройте крышкой и нагрейте в микроволновой печи в течение 2 x 8 минут при 100% мощности. Дайте предметным стеклам остыть при комнатной температуре, прежде чем продолжить (30-60 минут).
      3. Промойте предметные стекла в течение 3 x 2 мин водой двойной дистиллированной воды.
   3. Генерация сигналов флуорофора 780
      1. Срезы погружают в промывочный буфер, покрывают рабочим раствором флуорофора 780 и выдерживают предметные стекла в увлажненной камере в течение 1 ч при комнатной температуре.
      2. Промыть предметные стекла рабочим раствором промывочного буфера в течение 3 х 2 мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ выполняйте микроволновую обработку после этого шага.
   4. Используйте флуорофор 780 в качестве последнего шага всего рабочего процесса, а затем окрашивайте ядра непосредственно рабочим раствором DAPI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите шаг 3.7, если не используете флуорофор 780.
8. Микроволновая обработка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта микроволновая стадия удаляет первичный-вторичный комплекс HRP и повторно экспонирует антигены, позволяя ввести следующее первичное антитело.
   1. Поместите предметные стекла в коробку для окрашивания и ремонта, наполните ее буферным рабочим раствором PH6 или PH9, накройте крышкой и нагревайте в микроволновой печи в течение 2 x 8 минут при 100% мощности.
   2. Дайте предметным стеклам остыть при комнатной температуре, прежде чем продолжить (30-60 минут). Промыть предметные стекла 3 х 1 мин двойной дистиллированной водой.
   3. Окуните предметные стекла в рабочий раствор промывочного буфера на 2 мин. Выполните следующую инкубацию антител.
9. Следующая инкубация антител
   1. Повторите шаги 3.2-3.8 (кроме шага 3.7).
10. Ядерное окрашивание клеток и герметизация тканей
    1. Срезы тканей покрыть рабочим раствором DAPI и инкубировать предметные стекла в увлажненной камере в течение 5 мин при комнатной температуре. Промойте предметные стекла в течение 3 x 2 мин водой двойной дистиллированной воды.
    2. Удалите капли воды со предметных стекол, добавьте 10-20 мкл антифлуоресцентного гасителя на каждый предметный стеклянный предметный стекла и запечатайте предметные стекла покровным стеклом микроскопа.
    3. Готовые слайды хранить при температуре 4 °C, в защищенном от света месте, более 1 месяца.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха.

4. Настройте отрицательный контроль

1. Обрабатывайте отрицательные контрольные слайды так же, как и тканевые слайды, но без добавления реагентов, таких как первичные антитела, вторичные антитела, реагенты TSA и DAPI, которые используются для удаления тканевой автофлуоресценции при сканировании пленки.

5. Полностью автоматическое сканирование предметных стекол тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование, используемое для спектральной визуализации, представляет собой полностью автоматизированный мультиспектральный анализатор количественного определения тканей, а визуализация и анализ визуализации и анализа 5-цветных слайдов может быть выполнена с использованием эталонной системы (см. таблицу материалов). Система использует мультиспектральную визуализацию для количественного смешивания нескольких флуорофоров и тканевой автофлуоресценции.

1. Вручную установите время экспозиции и программу сканирования для каждого флуоресцентного канала и убедитесь, что прибор выполнил полностью автоматическую экспозицию и сканирование предметных стекол ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность предметного стекла должна быть чистой и очищенной от водяной пленки. Будьте осторожны с количеством герметика: слишком большое количество приведет к тому, что покровный лист соскользнет, а инструмент сообщит об ошибке.

6. Анализ флуоресценции

1. Дважды щелкните программное обеспечение (см. Таблицу материалов), перетащите файл многоцветного флуоресцентного изображения, полученного из исходного скана, в программное обеспечение и установите тип изображения на флуоресценцию.
2. Нажмите кнопку «Яркость и контрастность » и проверьте каналы на панели. Щелкните снаружи, а затем по каналу , чтобы выбрать интересующий канал флуоресценции. Перетащите дисплеи «Мин» и «Максимум », чтобы отрегулировать яркость и контрастность каждого канала.
3. После анализа определите вид для сохранения, нажмите Показать обзор слайда и Показать положение курсора , чтобы удалить эти два содержимого, сохраните масштабную линейку и нажмите Файл | Экспорт снимка | Текущее содержимое средства просмотра для экспорта PNG-файла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый флуоресцентный канал и объединенная фигура должны быть экспортированы для последующего анализа.
4. Для дальнейшего анализа положительного результата клеток-мишеней используйте программное обеспечение для идентификации и сегментации клеток²¹ (см. таблицу материалов).

Оптимизирована схема подбора первичных антител CD8 и флуорофоров. Оба набора результатов флуоресценции соответствовали точно таким же условиям инкубации антител в экспериментальной группе, за исключением изменения флуорофора, соответствующего антителам. Как показано на рисунке 2, была выявлена существенная разница в совпадении каналов CD8+ Т-клеток с флуорофором 480 и флуорофором 690. Канал с флуорофором 690 показывает чрезвычайно сильный флуоресцентный фон - большая область красной нерегулярной флуоресценции в пределах желтого круга показывает цвет, что вызывает большие помехи при анализе локализации CD8+ Т-клеток (рис. 2C,D). Тем не менее, канал с флуорофором 480 показывает очень специфическую позитивность клеточной мембраны CD8 и отсутствие флуоресцентного фона. Таким образом, желтые круги показывают очень четкую положительную клеточную мембрану (рис. 2А), что полностью иллюстрирует важность соответствия антител и флуоресцентных каналов в этом протоколе.

Исследовано распределение макрофагов и цитотоксических Т-клеток в тканях немелкоклеточной плоскоклеточной карциномы легкого, верифицирована экспрессия характерного белка HMGCS1 в опухолевых клетках и иммунных клетках. Как показано на рисунке 3, изображения были получены из QuPath 0.3.2. Панель mIHC состояла из флуорофоров 480, 520, 620, 690 и DAPI, а соответствующими маркерами антител были CK5/6, маркер клеток плоскоклеточной карциномы легкого; CD8 – маркер для Т-клеток; CD68 – маркер макрофагов; и HMGCS1, специфичный для плазмопозитивных опухолевых клеток. Макрофаги и CD8+ Т-клетки демонстрировали сильную инфильтрацию и были распределены вокруг и внутри очагов плоскоклеточной карциномы, в то время как HMGCS1 широко экспрессировался в плазме клеток плоскоклеточной карциномы, демонстрируя сильную позитивность опухолевых клеток.

Рисунок 1: Рабочий процесс мультиплексного иммуногистохимического окрашивания ткани FFPE. Аббревиатура: FFPE = формалин-фиксированный и парафинообразный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Оптимизация протоколов согласования для CD8 и флуорофоров. Выявлена достоверная разница в совпадении каналов CD8+ Т-клеток с флуорофором 480 и флуорофором 690. Масштабные линейки = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Мультиплексное иммуногистохимическое окрашивание при плоскоклеточной карциноме легкого. Распределение макрофагов и цитотоксических Т-клеток в тканях немелкоклеточной плоскоклеточной карциномы легкого и экспрессия характерного белка HMGCS1 в опухолевых клетках и иммунных клетках. CK5/6 является маркером клеток плоскоклеточной карциномы легкого; CD8 является маркером для Т-клеток; CD68 является маркером макрофагов; и HMGCS1 специфичен для плазмапозитивных клеток опухолевых клеток. Масштабные линейки = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение технологии мультимечения иммунофлуоресценции Opal с традиционной технологией иммунофлуоресценции.

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.