Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Пространственный анализ высокого разрешения уровней экспрессии генов в сухожилиях

785 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65852

⸱

8 марта 2024 г.

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается, как выполнить оптимизированный протокол in situ для сухожилий. В этом методе обсуждается препарирование тканей, пермеабилизация среза, дизайн зонда и методы усиления сигнала.

Аннотация

В последние годы было разработано множество протоколов для транскриптомики высокого разрешения во многих различных областях медицины и биологии. Тем не менее, богатые матриксом ткани, в частности сухожилия, были оставлены из-за их малого количества клеток, низкого количества РНК на клетку и высокого содержания матрицы, что затрудняло их анализ. Одним из последних и наиболее важных инструментов для работы с одиночными клетками является пространственный анализ уровней экспрессии генов в сухожилиях. Эти пространственные инструменты РНК имеют особенно большое значение для сухожилий для определения местоположения конкретных клеток новых и неизвестных популяций, проверки результатов секвенирования РНК-клеток одиночных клеток и добавления гистологического контекста к данным секвенирования РНК одиночных клеток. Эти новые методы позволят проводить анализ РНК в клетках с исключительной чувствительностью и обнаруживать одномолекулярные РНК-мишени на уровне одной клетки, что поможет молекулярно охарактеризовать сухожилия и будет способствовать исследованию сухожилий.

В этой методической статье мы сосредоточимся на доступных методах анализа пространственных уровней экспрессии генов на гистологических срезах с использованием новых тестов гибридизации in situ для обнаружения целевой РНК в интактных клетках на уровне одиночных клеток. Во-первых, мы сосредоточимся на том, как подготовить ткань сухожилия к различным доступным анализам и как усилить сигналы, специфичные для мишени, без фонового шума, но с высокой чувствительностью и высокой специфичностью. Затем в статье будут описаны конкретные методы пермеабилизации, различные конструкции зондов и стратегии усиления сигнала, доступные в настоящее время. Эти уникальные методы анализа уровней транскрипции различных генов в разрешении одиночных клеток позволят идентифицировать и охарактеризовать клетки сухожильной ткани в молодых и пожилых популяциях различных животных моделей и тканей сухожилий человека. Этот метод также поможет проанализировать уровни экспрессии генов в других богатых матриксом тканях, таких как кости, хрящи и связки.

Введение

Сухожилия – это соединительные ткани, которые обеспечивают передачу силы между мышцами и костью1. В процессе развития осевые теноциты происходят из мезенхимальных клеток в склеротоме сомитов2; сухожилия конечностей отходят от мезодермы латеральной пластины; а краниальные сухожилия возникают из линии черепного нервного гребня 3,4. Сухожилие может характеризоваться экспрессией транскрипционного фактора5 склеракс, хотя несколько маркеров также играют ключевую роль в развитии сухожилий, включая теномодулин, ирокез и раннюю реакцию роста 1/2 6,7,8,9.

Несмотря на небольшое количество известных маркеров сухожилия, в целом, более глубокая характеристика сухожилия остается сложной задачей, поскольку сухожилие содержит клетки, которые охватывают градиент биомеханических свойств. От миотендинозного соединения, сухожильного среднего тела и более кальцинированного энтезиса сухожильные клетки находятся во внеклеточных матрицах, которые различаются по свойствам растяжения. Поскольку сухожилие должно выдерживать растягивающее напряжение, вызванное разницей в механической прочности между мягкими и твердыми тканями, пространственная организация клеток в сухожилии особенно важна для его функции. Тем не менее, мало что известно об этих субпопуляциях сухожилий.

Для начала выяснения субпопуляций клеток можно использовать множество пространственных транскриптомных инструментов с высоким разрешением, включая, помимо прочего, Seq РНК одиночных клеток или гибридизацию in situ . Однако, хотя эти анализы пространственного профилирования помогают выявить экспрессию РНК в ткани после микродиссекции или разреза, эти методы могут быть сложными при выполнении на сухожильной ткани. Сухожилия представляют собой богатые матриксом ткани, состоящие почти на 86% из коллагена по сухоймассе10, что затрудняет извлечение клеток для секвенирования. Из-за сложностей при выделении клеток из матрикса, гипоклеточной природы сухожилия11 и относительно низкого количества РНК, сухожилие является сложной тканью для анализа.

В этой статье мы представляем метод оптимизации новых тестов гибридизации in situ для их использования для сухожилий путем предоставления методов подготовки тканей, пермеабилизации и дизайна зондов. В сочетании с существующими технологиями секвенирования это может помочь исследователям пространственно охарактеризовать субпопуляции сухожилий у развивающихся, взрослых или поврежденных сухожилий с повышенной чувствительностью и специфичностью анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) и AAALAC. Эксперименты проводились в соответствии с утвержденным протоколом #2013N000062 в Массачусетской больнице общего профиля. В этом исследовании использовались мыши C57BL/J6 (в возрасте 5 недель и P0). Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Пробоподготовка и фиксация

  1. Усыпляйте мышей в камереCO2 с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичного метода эвтаназии. Затем с помощью ножниц разрежьте задние конечности мыши вдоль тазобедренного сустава12. В сцинтилляционный флакон погрузите заднюю конечность мыши в достаточное количество 4% раствора параформальдегида (PFA), чтобы полностью покрыть образец, и зафиксируйте ткань на 24 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо 4% PFA для фиксации также можно использовать 10% формалин. После фиксации образец может храниться в фосфатно-солевом буфере (PBS) до дальнейшей обработки. Фиксируя всю заднюю конечность, мы можем сохранить напряжение на сухожилии и имеем возможность исследовать энтезис, сухожилие в средней части тела или миотендинозное соединение.
  2. После извлечения PFA из сцинтилляционного флакона промойте образец в течение 3 x 10 минут 1x PBS, добавив достаточное количество PBS, чтобы покрыть образец. Затем погрузите задние конечности в 0,5 М ЭДТА при температуре 4 °С с перемешиванием в течение 1-2 недель, заменяя на свежие ЭДТА каждые 2-3 дня.
  3. После удаления ЭДТА промойте образец в течение 3 x 10 минут с помощью 1x PBS, обезвожьте образцы в 70% EtOH и погрузите их в парафин в желаемой ориентации. Используйте традиционные методы среза FFPE для разреза ткани толщиной 3 мкм и переноса срезов на обработанное заряженное предметное стекло микроскопа (см. Таблицу материалов)13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы можно хранить при температуре 4 °C перед переходом к следующим этапам.
  4. Депарафинизация
    1. Выпекайте предметные стекла на горячей плите при температуре 60 °C в течение 1 часа, а затем дайте предметным стеклам нагреться до комнатной температуры (RT). Чтобы удалить парафин со слайдов, поместите слайды на решетку для слайдов и опустите их в тарелку для окрашивания, наполненную ксилолом. Повторите в свежем ксилоле в течение 3 х 5 минут.
      ВНИМАНИЕ: Ксилол опасен; Обращайтесь с осторожностью.
    2. Чтобы увлажнить секции, погрузите предметные стекла в следующие виды на 5 минут за промывку, все при RT: простирайте 2 раза в 100% EtOH, 1x в 75% EtOH, разбавленном в dH2O, 1x в 50% EtOH, разбавленном PBS, 1x в 25% EtOH, разбавленном в PBS, и 2x в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы регидратации выполняются с помощью слайдов на решетке для слайдов и с помощью различных растворов EtOH при окрашивании посуды.

2. Адаптация протокола 14 к RNAscope (коммерциализированному ISH)

  1. Подготовка растворов и зондов
    1. Готовят раствор ТЭГ для предварительной обработки срезанных образцов путем соединения 25 мМ Трис-HCl при рН 8, 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы. Сделайте достаточный объем для обработки всех образцов или заготовьте излишки; фильтровать-стерилизовать и хранить при РТ; Перед использованием раствор тщательно перемешать.
    2. Подготовьте достаточное количество буфера для стирки 1x (см. Таблицу материалов) для всех стирок и храните его при RT.
    3. На водяной бане или в инкубаторе при температуре 40 °C прогрейте интересующие зонды в течение 10 минут. Затем подготовьте зонды в соответствии с протоколом ISH14.
  2. Предварительная обработка образцов
    1. Вместо использования рекомендованного раствора для предварительной обработки погрузите предметные стекла в чашку для окрашивания, содержащую буфер TEG, на 4 часа при температуре 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация буфера ТЭГ может быть продлена на срок до 6 часов, если ткань особенно плотная или если извлечение антигена из интересующего вас мотива связывания РНК является сложной задачей. В этом случае здесь можно добавить точку остановки, высушить предметные стекла и хранить их в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи.
    2. Извлеките образцы из буфера и дайте им высохнуть. Затем обведите образцы гидрофобной барьерной ручкой, погрузите их в другую чашку для окрашивания, содержащую протеазу IV, и инкубируйте в духовке в течение 45 минут при 40 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем протеазу внутривенно для взрослых мышей. При использовании более молодых мышей, таких как P0, мы рекомендуем использовать более мягкий фермент, такой как протеаза III, в течение 30 минут. При устранении неполадок для разных возрастов наблюдайте за целостностью сухожилия и проверяйте на деградацию. Если ткань диссоциирует или деградирует, уменьшите время инкубации или измените используемую протеазу.
    3. Снова промойте образцы в буфере TEG в течение 30 минут, а затем гибридизируйте зонды в соответствии с протоколом ISH14.
    4. Добавьте 50-100 мкл монтажного реагента поверх образца. Наденьте покровное стекло поверх образцов для микроскопии. При съемке используйте большое увеличение (объектив 40x или выше) для просмотра сигнала.

3. Адаптация протокола HCR ISH15

  1. Постфиксация
    1. Приготовьте 4% PFA (в PBS), раствор PBT (0,1% Tween-20 в PBS) и протеиназу K в PBS (исходная концентрация 10 мг/мл, конечная концентрация 5 мкг/мл).
    2. Для начала первого постфиксного шага погрузите предметные стекла в посуду для окрашивания, содержащую 4% ПФА, на 5 минут; затем удалите 4% раствор PFA и храните его для использования на последующих этапах. Промойте предметные стекла в течение 2 х 5 минут в растворе PBT и удалите раствор PBT. Поместите предметные стекла в форму для окрашивания, содержащую раствор протеиназы К (5 мкг/мл) на 5 минут и промойте их в растворе PBT 2 x 5 минут.
    3. Начните второй этап постфиксации и погрузите предметные стекла в 4% PFA на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это те же 4% PFA, которые были сэкономлены на шаге 3.1.2.
    4. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в растворе PBT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы постфиксации выполняются с помощью предметных стекол на решетке для слайдов и в окрашивании посуды, содержащей соответствующие растворы.
  2. Ацетилирование
    1. Приготовьте раствор ацетилирования, содержащий 625 мкл ангидрида уксусной кислоты, 3,3 мл буфера 1 М триэтаноламин (TEA) и 246 мл ddH2O. Обязательно хорошо перемешайте и используйте сразу после приготовления.
    2. Поместите предметные стекла в раствор ацетилирования на 10 минут, а затем промойте 3 x 5 минут в растворе PBT. Промойте предметные стекла в ddH2O и дайте им высохнуть на воздухе в течение 30 минут. Затем обведите образцы гидрофобной барьерной ручкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы ацетилирования выполняются с помощью предметных стекол на решетке для слайдов и при окрашивании посуды, содержащей соответствующие растворы
  3. Гибридизация
    1. Разогрейте буфер для гибридизации до 37 °C и прогрейте увлажненную камеру до 37 °C.
      ВНИМАНИЕ: Буфер содержит формамид, опасный материал. Если предметные стекла недостаточно сухие, промокните края лабораторной салфеткой, чтобы удалить излишки dH2O.
    2. Приготовьте зондовые растворы, добавив 0,4 пмоль каждой смеси зондов в 100 мкл буфера для гибридизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании визуализации dHCR используйте более высокую концентрацию зонда для повышения эффективности гибридизации зонда.
    3. Приготовьте 4 л буфера цитрата натрия хлорида натрия (20x SSC), смешав 3 М NaCl (701,1 г NaCl в конечном объеме 4 л) и 0,3 М M Na3CH6H5O7•2H2O (352,8 г), а затем отрегулируйте окончательный pH до 7 путем добавления HCl или 10 N NaOH. Добавьте достаточное количество H2O, чтобы получить 4 л. Приготовьте 5x SSCT, разбавив 20x SSC до 5x и добавив достаточное количество 10% Tween 20, чтобы оно составило 0,1% от общего объема.
    4. Добавьте в образец 200 μл буфера для гибридизации, поместите предметные стекла в увлажненную камеру и дайте предметным стеклам инкубироваться в течение 10 минут. Удалите раствор для гибридизации и слейте лишний буфер на предметном стекле, промокнув края лабораторной салфеткой.
    5. Добавьте 100 μл приготовленного раствора зонда поверх образца и наложите на образец покровную крышку. Выдерживать в духовке в течение ночи или в течение 12-16 часов в камере, увлажненной раствором, содержащим 5x SSC и 50% формамид. Установите температуру на 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку инкубация происходит в течение ночи, добавление покровного стекла необходимо свести к минимуму испарение.
    6. Оставьте аликвоту 5x раствора SSCT на водяной бане при температуре 37 °C, а вторую аликвоту при RT. Предусмотрите необходимые объемы этих аликвот на основе количества образцов и количества стирок на следующем этапе.
  4. Стирка
    1. Используя предварительно нагретый раствор 5x SSCT, приготовьте 75% буфер для стирки / 25% 5x SSCT, 50% буфер для стирки / 50% 5x SSCT и 25% буфер для стирки / 75% 5x SSCT.
    2. Чтобы удалить излишки щупов, погрузите предметные стекла последовательно на 15 минут за промывку при температуре 37 °C в 75% буфер для стирки/25% 5x SSCT, 50% буфер для стирки/50% 5x SSCT и 25% буфер для стирки/75% 5x SSCT. Дайте покровным листам отплыть от образцов.
    3. Инкубируйте предметные стекла 2 x 15 минут со 100% 5x SSCT, а затем погрузите их в 5x SSCT на 5 минут при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы мытья можно выполнять с помощью предметных стекол на решетке для слайдов и при окрашивании посуды, содержащей соответствующие растворы или добавленные растворы в виде капель.
  5. Усиление
    1. Приготовьте 6 пмоль шпильки h1 и 6 пмоль шпильки h2 путем мгновенного охлаждения 2 мкл 3 мкМ материала (нагрейте при 95 °C в течение 90 с и охладите до температуры RT). Во время этого процесса беречь шпильки от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шпильки HCR h1 и h2 поставляются в буфере для хранения шпилек и готовы к мгновенному охлаждению. Защелкните охлажденные шпильки h1 и h2 в отдельных пробирках.
    2. Высушите предметные стекла, промокнув их края лабораторной салфеткой. Затем добавьте 200 мкл амплификационного буфера поверх образца и поместите его в увлажненную камеру на 30 мин при RT. Приготовьте смесь шпилек, добавив шпильки с защелкой h1 и шпильки с защелкой h2 с защелкой к 100 мкл буфера для амплификации при RT.
    3. Снимите буфер для усиления и слейте лишнюю жидкость с предметного стекла, промокнув края лабораторной салфеткой. Добавьте 100 μЛ приготовленной ранее шпильной смеси и положите поверх образца парапленку. Инкубируйте предметные стекла в течение не менее 4 часов или в течение ночи в темной, увлажненной камере в режиме RT.
    4. Чтобы удалить лишние шпильки, погрузите предметные стекла в 5x SSCT в форму для окрашивания и выдерживайте при RT в течение 30 минут. Повторите стирку в свежем 5x SSCT в течение 30 минут, а третий раз в течение 5 минут.
    5. Высушите предметные стекла, промокнув края лабораторной салфеткой, и добавьте 50-100 мкл монтажного реагента поверх образца. Наденьте покровное стекло поверх образцов для микроскопии. При съемке используйте большое увеличение (объектив 40x или выше) для просмотра сигнала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

figure-results-1
Рисунок 1: Экспрессия Poly A РНК в ахилловом сухожилии взрослой мыши с помощью RNAScope. Репрезентативное изображение успешного мечения Poly A в ахилловом сухожилии мыши (левая панель) с использованием коммерциализированного анализа ISH. Колокализация с DAPI подтверждает специфику преобразователя (средняя и правая панели), позволяя контролировать ф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы описываем модификации, сделанные для использования существующих инструментов ISH таким образом, чтобы их можно было использовать в сухожильной ткани с высокой степенью специфичности и чувствительности. Поскольку сухожилие является тканью с высокой плотностью матрикса, часто необходимо вносить коррективы в протокол для достижения одинаковой степени проникновения и специфичности зонда. Эти специфические методы пермеабилизации и стратегии усиления сигнала сухожильной ткани ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Авторы благодарят Дженну Гэллоуэй и сотрудников Galloway Lab за их поддержку и поощрение в разработке и устранении неполадок этих протоколов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 М триэтаноламин буфер
10% раствор
10% Tween-20
20x Солевой цитрат натрия буфер
4% PFA
ACD RNAскоп Флуоресцентный мультиплексный флуоресцентный набор реагентов V2ACD323100
Уксусный Ангидридный
Axio Imager МикроскопZEISS
C57BL/J6 мыши JAX ID: 000664
CoverslipsFisher 12-541-042
ddH2O
ETDAThermofisherAM9262
EtOH
ГлюкозаVWR Chemicals BDHBDH9230-500G
HCR РНК-FISH BundleMolecular Instruments Inc.
Система гибридизации HybEZ IIACD
Immedge Barrier PenVector LaboratoriesH4000
Leica SPE Конфокальный микроскопLeica
Fisher
Фосфатно-солевой буфер (PBS, 1x)InvitrogenAM9625Разбавить 10x PBS в воде milli-Q для получения 1x раствора
Протеаза IV
протеиназа KRoche3115836001
РНКскоп H2O2 и реагенты протеазыACDPN 322381включены в состав ACD RNAscope Флуоресцентный мультиплексный флуоресцентный набор реагентов V3
RNAscope Multiplex Fluorescent Detection KitACDPN 323110Входит в состав ACD RNAscope Набор флуоресцентных мультиплексных флуоресцентных реагентов V2
RNAscope Целевые реагентыACD322000Входит в состав ACD RNAscope Набор флуоресцентных мультиплексных флуоресцентных реагентов V4
RNAscope Промывочный буферACDPN 310091Входит в состав ACD RNAscope Флуоресцентный мультиплексный набор флуоресцентных реагентов V5
RNAscope  Зонд РазбавительACD300041
Держатель предметного стеклаStatLab4465A Чашка
для окрашивания с крышкойStatLabLWS20WH
Superfrost Plus Предметные стеклаFisher1255015обработанные, заряженные предметные стекла
Tris-HCl
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
формалина SPE Парапленка Leica

Ссылки

  1. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
  2. Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
  3. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  4. Chen, J. W., Galloway, J. L. The development of zebrafish tendon and ligament progenitors. Development. 141 (10), 2035-2045 (2014).
  5. Schweitzer, R., et al. Analysis of the tendon cell fate using Scleraxis, a specific marker for tendons and ligaments. Development. 128 (19), 3855-3866 (2001).
  6. Tsai, S., Nödl, M., Galloway, J. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics. 250 (3), 393-413 (2021).
  7. Kannus, P., et al. Location and distribution of non-collagenous matrix proteins in musculoskeletal tissues of rat. The Histochemical Journal. 30 (11), 799-810 (1998).
  8. Kannus, P. Structure of the tendon connective tissue. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 10 (6), 312-320 (2000).
  9. Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
  10. Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
  11. Grinstein, M., et al. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
  12. Villaseñor, S., Grinstein, M. Two-photon microscopy for the study of tendons. Journal of Visualized Experiments. , e65853(2023).
  13. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  14. Wang, F., et al. RNAscope®: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  15. Choi, H. M. T., et al. Third-generation situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), 165753(2018).
  16. Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc Lymnaea stagnalis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53968(2016).
  17. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Пространственная экспрессия геновткань сухожилиягибридизация in situРНК одного कोशिकाметоды транскриптомикиусиление сигналадизайн зондовтканибогатые матриксомгистологические срезыанализ экспрессии генов

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.