Двухфотонная микроскопия для исследования сухожилий

Краткое содержание

В этой статье описан процесс подготовки, настройки и визуализации сухожилий с помощью многофотонной микроскопии. Кроме того, в нем рассматривается применение ГСП для анализа выравнивания коллагеновых фибрилл и создания 3D-изображения сухожилий. Эта методология оказывается очень ценной для характеристики сухожильных клеток и их ВКМ во время травмы и развития.

Аннотация

Двухфотонная микроскопия стала мощным инструментом для оценки глубоких клеток тканей и определения расположения внеклеточного матрикса (ВКМ) в различных биологических системах. Этот метод основан на нелинейных взаимодействиях света и материи для обнаружения двух различных сигналов: второго диффузионного сигнала, генерируемого гармоникой (ГСП), который облегчает визуализацию коллагеновых волокон и их ориентации, и сигнала возбуждения в ближнем инфракрасном диапазоне для визуализации автофлуоресценции, возбужденной ультрафиолетовым излучением.

Визуализация ГВГ оказывается особенно эффективной при визуализации коллагеновых волокон благодаря нецентросимметричной кристаллической структуре фибриллярного коллагена I. Учитывая, что сухожилия являются богатыми матриксом тканями с ограниченным числом клеток, высокое содержание коллагена в них делает их идеальными кандидатами для анализа с помощью двухфотонной микроскопии. Следовательно, двухфотонная микроскопия является ценным средством для анализа и характеристики коллагеновых аномалий в сухожилиях. Его применение распространяется на изучение развития сухожилий, травм, заживления и старения, что позволяет всесторонне характеризовать клетки сухожилий и их взаимодействие с ECM в различных условиях с помощью инструментов двухфотонной микроскопии. В этом протоколе описывается использование двухфотонной микроскопии в биологии сухожилий и представлена адаптированная методология для достижения эффективной визуализации и характеристики клеток сухожилий во время развития и после травмы. Метод позволяет использовать тонкие микроскопические срезы для создания всеобъемлющего изображения ВКМ внутри сухожилий и клеток, которые взаимодействуют с этой матрицей. В частности, в статье демонстрируется метод создания 3D-изображений с помощью двухфотонной микроскопии на животных моделях.

Введение

Чтобы правильно функционировать и передавать силу от мышц к кости¹, сухожилия полагаются на межмолекулярные и внутримолекулярные связи между коллагеновыми волокнами. Сложная самосборка, сшивание и выравнивание коллагеновых волокон приводят к созданию высокоорганизованной матрицы, которая способствует биомеханической прочности и гибкости сухожильной ткани ^2,3,4. Хотя другие белки ECM также способствуют стабильности фибриллярной сети в сухожилиях⁵, сухая масса сухожилия состоит примерно на 86% из коллагена⁶, при этом коллаген I составляет до 96% от общего содержания коллагена ^7,8. В конечном итоге это делает структуру коллагена ключевым продуктом нормального здоровья и функции сухожилий.

Некоторые методы клинической визуализации, используемые для сухожилий, включают МРТ и/или УЗИ. В то время как ультразвуковая технология позволяет получить изображения пучковой структуры сухожилия и выявить некоторые фибриллярные структуры в ткани⁹, разрешение не является идеальным для количественной оценки. МРТ имеет лучшее пространственное разрешение, чем ультразвуковая визуализация, но все еще ограничено. Однако эти методы также ограничены в потенциальной глубине визуализации через ткань. В более микромасштабе для оценки структуры коллагеновых фибрилл и любых потенциальных аномалий можно использовать мало- и широкоугольное рассеяние света и конфокальную микроскопию.

В отличие от этого, микроскопия генерации второй гармоники (ГВГ) отличается от других методов визуализации тем, что она может захватывать внешнюю оболочку коллагеновых фибрилл. Фибриллы коллагена I в сухожилиях организованы одноосным параллельным образом через сухожильный ВКМ и имеют нецентросимметричную природу ^4,10. Эти свойства могут быть использованы для получения изображений с помощью многофотонного микроскопа, который может получать четкие изображения, которые в 2-3 раза глубже, чем конфокальная визуализация¹¹. Это также позволяет нам создавать оптические участки сухожилия более высокого качества. Когда свет проецируется на интересующий образец, создается сигнал ГВГ, и это рассеяние света может быть зафиксировано. В сухожилиях это дает изображение структуры и выравнивания коллагена, что позволяет нам оценить потенциальные морфологические и патологические последствия тендинопатий, травм и т. д.

Поскольку коллаген составляет большую часть сухой массы сухожилий и способствует функции сухожилий ^6,12, нарушение структуры коллагена может повлиять на биомеханические свойства сухожилий. Таким образом, анализ его структуры может помочь нам лучше понять влияние и тяжесть травм, а также создать метрику эффективности заживления. В этой статье рассматривается метод, который использует многофотонную и ГВГ-микроскопию для анализа того, как развитие и травмы влияют на структуру и выравнивание коллагеновых волокон I, а также для создания 3D-изображений сухожильного ECM на животных моделях. Таким образом, наш метод визуализации сухожилий может помочь исследователям охарактеризовать клетки сухожилий и ЭКМ во время развития или после травмы.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) (протокол #2013N0000062) и рекомендациями AAALAC в Массачусетской больнице общего профиля. BHLHE40 мышей с нулевым нокаутом или гетерозиготными самками на фоне Scx-GFP в возрасте 30 дней. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Препарирование и фиксация тканей

1. Чтобы подготовить ткань, усыпляют мышей в камере_CO2 (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) с последующим вывихом шейки матки.
2. Чтобы уменьшить количество шерсти, которая может прилипнуть к образцу ткани, распыляйте на мышь 70% EtOH до тех пор, пока мех не пропитается. Снимите кожу с задних конечностей, а затем с помощью ножниц удалите две задние конечности, разрезав тазобедренный сустав.
3. Поместите две задние конечности в сцинтилляционный флакон объемом 20 мл и погрузите их в 4% PFA так, чтобы флакон был заполнен. Поместите флаконы при температуре 4 °C с перемешиванием на ночь.
4. Вымойте задние конечности в 1x PBS при комнатной температуре (RT) с перемешиванием в течение 10 минут и повторите в общей сложности 3 раза. Погружение задних конечностей в 0,5 М ЭДТА (pH 8,0) при температуре 4 °C с перемешиванием на срок до 2 недель, заменяя на свежие ЭДТА каждые 2-3 дня.
5. Вымыть задние конечности в 1x PBS at RT с перемешиванием в течение 10 минут, повторяя промывки в общей сложности 3 раза.
6. Погрузите конечности в свежий 1x PBS и храните при температуре 4 °C, пока они не будут использованы для визуализации.

2. Рассечение сухожилия и подготовка тканей к визуализации

1. Удерживая стопу щипцами, просуньте один конец лезвия пружинных ножниц (см. Таблицу материалов) под ахиллово сухожилие и убедитесь, что режет как можно ближе к миотендинозному соединению.
2. Возьмитесь за отрезанный миотендинозный конец сухожилия щипцами и с помощью пружинных ножниц вырежьте сухожилие как можно ближе к кости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте щипцы, чтобы помочь удерживать ахиллово сухожилие подальше от остальной части задней конечности во время первого разреза. Следите за тем, чтобы не раздавить или не повредить ткань, так как это повлияет на выравнивание коллагена во время визуализации.
3. Чтобы проникнуть и получить ядерное противоокрашивание, погрузите рассеченное сухожилие в ПБТ (1% Triton-X в PBS) с 0,1% Draq5 (исходная концентрация, 5 мМ, см. Таблицу материалов). Поместите сухожилие в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и добавьте 1 мкл Draq5 к 1 мл PBT. Инкубируйте за ночь в RT на качалке. Поскольку Draq5 светочувствительный, накройте микроцентрифужные пробирки алюминиевой фольгой и защитите образцы от света.
4. Перед визуализацией удалите раствор Draq5 и замените его на dPBS. Обязательно продолжайте защищать образец от света.
   ВНИМАНИЕ: Draq5 имеет третью категорию токсичности и считается опасным в соответствии со стандартом OSHA Hazard Communication Standard. Избегайте контакта и выбрасывайте его в контейнер для отходов с маркировкой.
5. С помощью инструмента для пробивки биопсии с внутренним диаметром 6 мм вырежьте кусок гелевой пены (см. Таблицу материалов) и поместите его в небольшую чашку Петри размером 60 х 15 мм. Добавьте ddH₂O в форму, чтобы гелевая пена расширилась.
6. Поместите рассеченное ахиллово сухожилие на гелевую пену. С помощью покровного стекла, приклеенного к шайбе, осторожно поместите шайбу на сухожилие до тех пор, пока покровное стекло не соприкоснется с тканью. Во избежание проблем при визуализации убедитесь, что между образцом и покровным стеклом нет пузырьков воздуха. При необходимости добавьте еще ddH₂O в чашку, чтобы покрыть образец, и стиральную машину с покровным стеклом.

3. Визуализация с помощью многофотонного микроскопа

1. С помощью многофотонного лазерного микроскопа FVMPE-RS, объектива с 25-кратным увеличением, который можно погружать в воду, импульсного лазера HPDS-O IR и импульсного лазера IR (см. Таблицу материалов), найдите образец и область интереса, которые будут визуализированы с помощью светового тракта EPI. Как только образец будет найден, установите камеру либо на миотендинозном, либо на энтезиозном конце ахиллова сухожилия.
2. Переключите световой путь на LSH, отрегулируйте настройку ИК-лазера Laser 2 на 840 нм и выполните активное выравнивание. Отрегулируйте силу HV, чтобы иметь возможность видеть ткань и сигнал ГВГ, не превышая 20%. Не регулируйте усиление и держите смещение равным 0.
3. Затем настройте параметры z-stack для получения образцов изображений. Используйте размер сканирования 1024 x 1024 и установите размер шага на 0,4 микрона. Z-стеки в среднем состоят из 150 срезов, и они начинаются от внешней оболочки и движутся к центру сухожилия до тех пор, пока сигнал ГСП не станет нечетким, образуя сагиттальные оптические участки¹³.
4. Отрегулируйте мощность лазера в режим Bright Z , чтобы обеспечить стандартизацию обнаружения сигнала. После того, как параметры запуска/остановки Z-стека установлены, установите интенсивность лазера от 4 в начале визуализации и 6 в конце визуализации. Это помогает поддерживать постоянство передачи сигналов ГСП по мере того, как эндоскоп делает снимки вглубь тканей.
5. После того, как z-стеки будут сгенерированы, обработайте их далее в ImageJ/FIJI для создания фильма оптических сечений в поперечной ориентации. Для этого откройте программное обеспечение ImageJ/FIJI¹⁴ и нажмите на Image > Stacks > Reslice. Это позволит нам иметь поперечный взгляд на ахиллово сухожилие, раскрывая звездчатую морфологию теноцитов и их ориентацию в коллагеновом матриксе.

Результаты

Этот протокол полезен для характеристики сухожильных клеток и их внеклеточного матрикса (ВКМ) после травмы, во время развития или в мутантном состоянии. При тщательном препарировании и подготовке образца через ткань могут быть сгенерированы видеоролики с z-стеком в сагиттальной ориентации (видео 1 и видео 2). С помощью ImageJ/FIJI для обработки и наложения изображений создается поперечное изображение ахиллова сухожилия (Видео 3 и Видео 4). Это раскрывает звездчатую морфологию теноцитов и позволяет нам наблюдать их уникальную архитектуру в плотной коллагеновой матрице.

С помощью многофотонной микроскопии и нецентросимметричных кристаллических свойств фибриллярного коллагена I были получены изображения оптических срезов с высоким разрешением, которые захватывают как клетки сухожилий, так и их матрикс. Эти оптические секции изолированы от z-стеков как для BHLHE40 +/-; Scx-GFP и BHLHE40 -/-; Мыши Scx-GFP (рис. 1A, B соответственно). Срезы берутся из исходного сагиттального z-стека, созданного с помощью 2-P визуализации, и из повторно нарезанного z-стека, сгенерированного с помощью ImageJ/FIJI. В дополнение к этому, мы также можем использовать этот метод визуализации для анализа любых потенциальных различий в организации коллагена, клеточной морфологии и т. д. между двумя мышами.

Рисунок 1: Оптическое сечение BHLHE40 +/-; Scx-GFP и BHLHE40 -/-; Сухожилие мыши Scx-GFP. Z-стек был захвачен с помощью многофотонного микроскопа. (A) Оптические срезы, полученные из Z-стека, показывают сигнал SHG и ячейки GFP+/Draq5+ в BHLHE40 +/-; Scx-GFP (P30, мама, 14,68 г) и (B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP (P30, внутренняя резьба, 12,16 г). Сагиттальные сечения имеют сигнал ГСП, в то время как поперечные сечения не включают. Образцы подвергали компенсационному окрашиванию с помощью Draq5. ГВГ захватывает коллагеновый матрикс в ткани. Масштабная линейка = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Z-стек видео сагиттального вида BHLHE40 +/-; Сухожилие мыши Scx-GFP. Z-стек был захвачен с помощью двухфотонного микроскопа. На видео показан сагиттальный вид ахиллова сухожилия. Образцы подвергали компенсационному окрашиванию с помощью Draq5. ГВГ захватывает коллагеновый матрикс в ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 2: Z-стек видео сагиттального вида BHLHE40 -/-; Ахиллово сухожилие мыши Scx-GFP. Z-стек был захвачен с помощью двухфотонного микроскопа. На видео показан сагиттальный вид ахиллова сухожилия у мыши с BHLHE40 нулевым KO. Образцы подвергали компенсационному окрашиванию с помощью Draq5. ГВГ захватывает коллагеновый матрикс в ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 3: Z-стек видео поперечного вида BHLHE40 +/-; Сухожилие мыши Scx-GFP. Z-стек был захвачен с помощью двухфотонного микроскопа. На видео показан поперечный вид ахиллова сухожилия. Образцы подвергали компенсационному окрашиванию с помощью Draq5. ГВГ захватывает коллагеновый матрикс в ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 4: Z-стек видео поперечного вида BHLHE40 -/-; Ахиллово сухожилие мыши Scx-GFP. Z-стек был захвачен с помощью двухфотонного микроскопа. На видео показан поперечный вид ахиллова сухожилия у мыши с BHLHE40 нулевым нокаутом. Образцы подвергали компенсационному окрашиванию с помощью Draq5. ГВГ захватывает коллагеновый матрикс в ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Обсуждение

В данной статье представлен метод подготовки, препарирования и визуализации ахиллова сухожилия мыши с использованием нецентросимметричных кристаллических свойств ЭКМ сухожилия. Ключевыми этапами подготовки тканей являются пермеабилизация для получения противоответных пятен и обеспечение правильного размещения тканей в чашке Петри во время визуализации. Вместо Draq5 Hoechst 33258 можно использовать при разведении 1:100 000¹³, но Draq5 предпочтительнее из-за его высокой проницаемости, фотостабильности и минимального фотообесцвечивания. Правильное размещение тканей имеет решающее значение для предотвращения образования пузырей между покровным стеклом и сухожилием, так как неправильная ориентация может повлиять на получаемые изображения.

По сравнению с другими методами микроскопии, микроскопия с генерацией второй гармоники (ГВГ) позволяет захватывать коллагеновые фибриллы и сухожильные клетки в матриксе¹⁰. В сочетании с противоотверженными пятнами эти данные позволяют проанализировать, как развитие, травмы или мутации влияют на структуру сухожилий. Создание 3D-изображений сухожильного ECM позволяет наблюдать оптические срезы при их прохождении через сухожилие. Несмотря на то, что многофотонная технология обеспечивает превосходное проникновение в ткани, она все еще имеет ограничения в визуализации всего ахиллова сухожилия, что требует дополнительных методов, таких как разрезание. Тем не менее, этот метод позволяет получать около 150 оптических срезов размером 0,4 микрона с высокой прозрачностью, избегая возмущения тканей при разрезании.

Таким образом, этот метод дает ценную информацию о характеристике развития сухожилий, травм, заживления и старения путем визуализации клеток сухожилий и ЭКМ с помощью многофотонной микроскопии. Использование многофотонной визуализации для оптических срезов и видео с z-стеком по всей ткани обеспечивает лучшее понимание изменений морфологии сухожилий в экспериментальных условиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,5 м ЭДТА pH 8,0	Invitrogen	AM9262
2 мл микроцентрифужные пробирки	США Scientific	1620-2700
20 мл сцинтилляционный флакон	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% параформальдегид	электронная микроскопия Sciences	50-980-487	Используйте ампуоль PFA для создания 4% раствора PFA
6 мм Biopsy Punch Tool	Ted Pella Inc.	15111-60
			Петри 60 x 15 мм
BHLHE40 нулевым нокаутом или гетерозиготными мышами на фоне Scx-GFP	Лаборатория Джексона	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Покровные стекла	Fisher	12-544-F	Можно использовать любые покровные стекла, которые охватывают площадь стиральной машины M20
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Тонкие ножницы 21 мм режущая кромка	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS многофотонный лазер сканирующий микроскоп	Olympus
Gelfoam Sterile Sponge Размер 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL ИК импульсный лазер	Olympus
MaiTai HPDS-O IR импульсный лазер	Olympus
Фосфат-буферный физиологический раствор (1x)	Invitrogen	AM9625	Разбавить 10x PBS в воде milli-Q, чтобы получить 1x раствор
Плоская шайба M20 из нержавеющей стали	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Разбавьте Triton X-100 в dPBS для получения 1% раствора
Весенние ножницы Vannas 4 мм режущей кромки	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens