Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Комбинация механически изолированной стромальной васкулярной фракции и фибринового гидрогеля: протокол процессинга

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/65860

⸱

17 ноября 2023 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Triemli City Hospital Zurich, 2Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zurich, University of Zurich, 3Institute for Human Tissue Restoration, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Механически изолированная стромальная васкулярная фракция (SVF) в сочетании с фибриновым гидрогелем является простым и эффективным носителем жизнеспособных стромальных клеток, полученных из жировой ткани, по различным показаниям, включая тканевую инженерию и/или цели заживления ран. Здесь мы представляем получение механической конструкции SVF (mSVF)-фибринового гидрогеля для трансляционных исследований и клинического применения.

Аннотация

Регенеративный потенциал стромальных клеток (ASC), полученных из жировой ткани (ASC), привлек значительное внимание в регенеративных и трансляционных исследованиях. В прошлом экстракция этих клеток из жировой ткани требовала многоступенчатого ферментативного процесса, в результате чего получалась гетерогенная клеточная смесь, состоящая из ACS и других клеток, которые совместно называются стромально-васкулярной фракцией (SVF). Недавно представленные протоколы механической изоляции SVF (mSVF) требуют меньше времени и обходят нормативные требования. Недавно мы предложили протокол, который генерирует mSVF, богатую стромальными клетками, на основе комбинации эмульсификации и центрифугирования. Одной из актуальных проблем в применении mSVF для лечения ран является отсутствие каркаса, обеспечивающего защиту от механических манипуляций и высыхания. В прошлом было показано, что гидрогели фибрина являются полезным дополнением к переносу клеток для заживления ран. В данной работе мы описываем этапы подготовки гидрогелевой конструкции mSVF-фибрина в качестве нового подхода к трансляционным исследованиям и клиническому применению.

Введение

За последние несколько лет регенеративная пластическая хирургия стала дополнительным столпом пластической хирургии1. Регенеративная пластическая хирургия направлена на восстановление поврежденных тканей путем переноса растворимых факторов, клеток и тканей, собранных у пациента, для содействия восстановлению тканей минимально инвазивнымспособом. Стволовые клетки (ASC), полученные из жировой ткани, привлекли внимание благодаря своей способности дифференцироваться в несколько мезенхимальных линий, что делает их многообещающим кандидатом для исследований в области регенеративной медицины3. Их цитокиновый профиль проявляет ангиогенное, иммуносупрессивное и антиоксидантное действие4.

Традиционно АСК выделяли из жировой ткани с помощью ферментативного подхода с коллагеназой, в результате чего получали стромальную васкулярную фракцию (СВФ), которую впоследствии культивировали для получения АСЦ. Эти лабораторные технологии являются дорогостоящими, трудоемкими и, что важно, подпадают под строгие нормативные ограничения, что усложняет клинический перевод 5,6,7. В отличие от этого, протоколы с механической изоляцией стромальной васкулярной фракции (mSVF) обеспечивают клинические преимущества не только в обходе регуляторных проблем, но и в минимизации рисков контаминации 8,9.

Описаны многочисленные протоколы механической изоляции SVF10. Среди них протокол смещения, опубликованный Tonnard et al., привлек наибольшее внимание среди регенеративных хирургов. Жир, собранный с помощью стандартных процедур липосакции, известных как липоаспираты, может быть передан между двумя ручными шприцами, прикрепленными к соединительному устройству, в результате чего получается жидкая форма, называемая наножиром. К очевидным преимуществам этих протоколов изоляции mSVF относятся сокращение времени обработки, минимальный риск заражения, поскольку вся процедура проводится в хорошо контролируемой среде, и возможность немедленного клиническогоперевода.

Доклинические и клинические данные указывают на то, что свойства mSVF, включая жизнеспособность клеток и ранозаживляющие свойства, сопоставимы со стандартными методами ферментативного выделения12. Потенциал mSVF в содействии заживлению ран на крысах и мышах был подтвержден в исследованиях in vivo Chen et al. и Sun et al.13,14. Тем не менее, существует нехватка доступных данных о заживлении ран в клинических условиях. Многообещающие результаты были получены при проведении трансплантации аутологичного жира пациенту 83 лет, у которого была рана с открытым имплантатом при открытом переломе нижнейконечности15. Кроме того, Lu et al. провели сравнение между mSVF и терапией ран отрицательным давлением в когорте из 20 пациентов с хроническимиранами. Их результаты показали, что лечение mSVF привело к более высокой скорости заживления ран по сравнению с терапией ран отрицательнымдавлением. В обоих упомянутых исследованиях mSVF вводили отдельно или в комбинации с гелем в целевую область раны15,16.

В реальном сценарии клиническое применение mSVF ограничено из-за непредсказуемых скоростей абсорбции в реципиентных центрах17,18. Скаффолды обещают решение этой проблемы, поскольку они способствуют сохранению клеток, васкуляризации и интеграции в окружающие ткани 19,20,21. Фибриновые гидрогели являются широко используемым, одобренным FDA инструментом, используемым в хирургических дисциплинах, и было показано, что они являются эффективным носителем mSVF19. Фибриновый гель является биополимерным материалом, который обеспечивает ряд преимуществ в функционировании в качестве переносчика клеток: он демонстрирует отличную биосовместимость, способствует прикреплению клеток и способен к контролируемому разложению 22,24,25. Кроме того, он демонстрирует минимальную воспалительную реакцию и реакцию на инородные тела и легко всасывается во время естественного течения заживления ран22. Мы считаем, что разнообразные регенеративные способности упомянутых клеток mSVF и выгодная комбинация с фибриновым гидрогелем могут обеспечить инновационный подход к улучшению процессов заживления ран. В целом, этот подход позволяет эффективно доставлять жизнеспособные клетки mSVF для местного применения. Представляем протокол, который сочетает в себе mSVF с фибриновым гидрогелем, предназначенным для применения в целях заживления ран.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все взрослые доноры предоставили письменное информированное согласие на дальнейшее использование собранных образцов тканей. Протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике исследований человека нашего учреждения.

1. Забор жировой ткани

  1. Забор жировой ткани путем выполнения стандартной липосакции с помощью обычной техники сбора жира, описанной в предыдущих публикациях26,27. Обязательно используйте тумесцентный раствор, который состоит из обычного лактата Рингера и адреналина в соотношении 1:200 000.
  2. Выполните липосакцию с помощью аспирационной канюли диаметром 4 мм под отрицательным давлением и вибрацией в стерильный мешок. Немедленно перенесите собранный жир в лабораторию.

2. mSVF-изоляция

  1. Выполните следующие действия (разделы 2 и 3) в колпаке для клеточных культур, чтобы обеспечить асептическую рабочую зону. Носите обычный лабораторный халат и перчатки для обеспечения уровня биологической безопасности 2.
  2. Приготовьте питательную среду: Добавьте 500 мл модифицированной среды Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы с 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллин-стрептомицина.
  3. Переложите липоаспират в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  4. Переложите липоаспират в стерильный шприц с люэровским замком объемом 20 мл и прикрепите разъем 1,4 мм. Следите за тем, чтобы внутри шприца не было воздуха.
  5. Прикрепите второй шприц люэровского замка объемом 20 мл к противоположной стороне разъема 1,4 мм.
  6. Протолкните жировую ткань из одного шприца в другой в общей сложности 30 раз.
  7. Перелейте эмульгированный жир в свежую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  8. Центрифугируйте эмульгированный жир при давлении 500 х г в течение 10 минут.
  9. После центрифугирования выбросьте маслянистый верхний слой. Затем соберите центральный очищенный mSV-слой. Переложите его в свежую центрифужную пробирку объемом 50 мл и выбросьте водную фазу.
  10. Заполните пробирку центрифуги питательной средой (с шага 2.2) до отметки 40 мл.
  11. Поместите пробирку центрифуги в центрифугу и еще раз центрифугируйте при давлении 500 x g в течение 5 минут.
  12. Соберите полученный mSVF-слой и перенесите его в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл.

3. Производство гидрогеля mSVF-фибрина

  1. Смешайте 100 мкл mSVF с 10 мкл тромбина (100 Ед/мл), 10 мкл CaCl2 (80 мМ) и 70 мкл транексамовой кислоты (100 мг/мл) в стерильной пробирке объемом 1,5 мл.
  2. Используйте свежий наконечник для дозатора, чтобы добавить 10 мкл фибриногена (100 мг/мл) в качестве последнего компонента незадолго до нанесения. Следует иметь в виду, что полимеризация гидрогелем наблюдается в течение примерно 10-30 с.
  3. Для клинического применения выполняйте этот последний шаг незадолго до местного введения, предпочтительно у постели больного. Для аналитических целей переносят в 12-луночный планшет методом пипетирования.

4. Анализ жизнеспособности и гистология

  1. Пипеткой 200 мкл смеси mSVF и гидрогеля с шага 3.3 в одну лунку 12-луночного планшета.
  2. Пипетка 100 мкл mSVF-collection (шаг 2.12.) в одну лунку в качестве положительного контроля.
  3. Пипетка 200 мкл фибрина гидрогеля только в одну лунку в качестве отрицательного контроля.
  4. Поместите 12-луночный планшет в обычный инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 30 минут.
  5. По истечении этого времени добавьте в каждую лунку по 1 мл резазурина (аламарский синий, 10% концентрации, разведенный в питательной среде).
  6. После добавления инкубируйте 12-луночный планшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 часов.
  7. Через 24 ч измерьте первую интенсивность флуоресценции с помощью многорежимного микропланшетного ридера для визуализации клеток с длиной волны возбуждения 555 нм и длиной волны излучения 596 нм.
  8. Проводите последовательные измерения интенсивности флуоресценции на 3 и 7 день.
  9. При необходимости гистологической оценки эксперимент следует прекратить на 1, 3 и 7 сутки и зафиксировать фибриновый гидрогель в 4% параформальдегиде при температуре 4 °C в течение 24 ч. После фиксации добавьте 1% фосфатно-солевой буфер (PBS) и храните при температуре 4 °C.
  10. Гидрогели встраиваются в компаунд с оптимальной температурой резки (OCT) и разрезаются с помощью криостата замороженные блоки толщиной 10 мкм. Окрашивание срезов раствором гематоксилина и эозина (H&E) в соответствии со стандартными протоколами28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ на резазурин
Сначала мы изучили жизнеспособность клеток mSVF in vitro . С этой целью мы проводили анализ жизнеспособности клеток резазурина на 0, 3 и 7 день. Жизнеспособность клеток в 0, 3 и 7 дней из четырех образцов показана на рисунке 1. Значения дня 0 служат базовыми и были установлены равными 100%. На 3-е сутки положительный контроль (mSVF) показал незначительное снижение до 78,92% (± 5,33%), в то время как комбинация mSVF-фибрина гидрогеля осталась н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Механическая изоляция SVF представляет собой элегантную альтернативу традиционному ферментативному подходу и обеспечивает широкий доступ к клиническомуприменению. Фактически, mSVF, как предложено в настоящей рукописи, уже используется в клинической практике для лечения мягких тканей рубцов или в качестве дополнения к косметическимпроцедурам. Представленный здесь протокол обеспечивает простой метод для эффективной местной доставки жизнеспосо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Bong-Sung Kim поддерживается Немецким научно-исследовательским обществом (KI 1973/2-1) и Фондом медико-биологических исследований Novartis (#22A046).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-WellplateSarstedt83.3921
4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)BiochemicaA1001.0010
50 мл-FalconFalcon352070
Впитывающие полотенца, две упаковкифала89701
Аламарский синий 25 млИнвитрогенDAL1025
альбумин, бычий (BSA)VWR0332-500G
Biotek Cytation 5 Многорежимный считыватель микропланшетовAgilent
CaCl2 Sigma-AldrichC5670-500G
КриостатМикротом
DMEM с 4,5 г/л глюкозы, с L-глутамином, с пируватом натрияVWR392-0416
DPBSGibco14190-144
ЭпинефринSigma-AldrichE4250
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаBiowestS181H-500
Фибриноген Плазма Человека 100 мгСигма-Олдрич341576-100 мг
ФормалинFisher ScientificSF100-4
Формалин 4%Формафикс1308069
FSC 22-Эйнбеттмедиум, blauBiosystems3801481S
Гематоксилин & Эозин РастворСигма-ОлдричH3136 / HT110132
Лактатный Рингер s Раствор 1000 млB BraunR5410-01
Mercedes Canjula 4 ммMicroAirePAL-R404LL
NaCl 0,9%Bbraun570160
OCT Embedding Matrix 125 млCellPathKMA-0100-00A
ПараформальдегидFisher Scientific10342243
PBS 1%Sigma-AldrichP4474
PenStrepSigma-AldrichP4333-100ML
Petridish 150mmSarstedt83.1803
Phalloidin-iFluor 488 РеагентAbcamab176753
Стерильный шприц 20 мл LuerHENKE-JECT5200-000V0
Стерильный шприц 30 мл Luer-LockBD10521
Тромбин из плазмычеловекаSigma-AldrichT6884-100UN
Транексамовая кислотаOrpha Swiss6837093
Tulipfilter 1.2Lencion SurgicalATLLLL
Tulipfilter 1.4Lencion SurgicalATLLLL
для визуализации клеток 

Ссылки

  1. Daar, A. S., Greenwood, H. L. A proposed definition of regenerative medicine. J Tissue Eng Regen Med. 1 (3), 179-184 (2007).
  2. Machens, H. G., Mailänder, P. Regenerative medicine and plastic surgery. Chirurg. 76 (5), 474-480 (2005).
  3. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  4. Hassan, W. U., Greiser, U., Wang, W. Role of adipose-derived stem cells in wound healing. Wound Repair Regen. 22 (3), 313-325 (2014).
  5. Gir, P., Oni, G., Brown, S. A., Mojallal, A., Rohrich, R. J. Human adipose stem cells: current clinical applications. Plast Reconstr Surg. 129 (6), 1277-1290 (2012).
  6. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  7. Raposio, E., Ciliberti, R. Clinical use of adipose-derived stem cells: European legislative issues. Ann Med Surg (Lond). 24, 61-64 (2017).
  8. Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plast Reconstr Surg Glob Open. 4 (9), e1017(2016).
  9. Dykstra, J. A., et al. Concise review: Fat and furious: Harnessing the full potential of adipose-derived stromal vascular fraction. Stem Cells Transl Med. 6 (4), 1096-1108 (2017).
  10. Aronowitz, J. A., Lockhart, R. A., Hakakian, C. S. Mechanical versus enzymatic isolation of stromal vascular fraction cells from adipose tissue. Springerplus. 4, 713(2015).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plast Reconstr Surg. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Tiryaki, K. T., Cohen, S., Kocak, P., Canikyan Turkay, S., Hewett, S. In-vitro comparative examination of the effect of stromal vascular fraction isolated by mechanical and enzymatic methods on wound healing. Aesthet Surg J. 40 (11), 1232-1240 (2020).
  13. Sun, M., et al. Adipose extracellular matrix/stromal vascular fraction gel secretes angiogenic factors and enhances skin wound healing in a murine model. Biomed Res Int. 2017, 3105780(2017).
  14. Chen, L., et al. Autologous nanofat transplantation accelerates foot wound healing in diabetic rats. Regen Med. 14 (3), 231-241 (2019).
  15. Lin, Y. N., et al. Fat grafting for resurfacing an exposed implant in lower extremity: A case report. Medicine (Baltimore). 96 (48), e8901(2017).
  16. Deng, C., Wang, L., Feng, J., Lu, F. Treatment of human chronic wounds with autologous extracellular matrix/stromal vascular fraction gel: A STROBE-compliant study. Medicine (Baltimore). 97 (32), e11667(2018).
  17. Chung, M. T., et al. Micro-computed tomography evaluation of human fat grafts in nude mice. Tissue Eng Part C Methods. 19 (3), 227-232 (2013).
  18. Gonzalez, A. M., Lobocki, C., Kelly, C. P., Jackson, I. T. An alternative method for harvest and processing fat grafts: an in vitro study of cell viability and survival. Plast Reconstr Surg. 120 (1), 285-294 (2007).
  19. Kim, B. S., et al. In vivo evaluation of mechanically processed stromal vascular fraction in a chamber vascularized by an arteriovenous shunt. Pharmaceutics. 14 (2), 417(2022).
  20. Dryden, G. W., Boland, E., Yajnik, V., Williams, S. Comparison of stromal vascular fraction with or without a novel bioscaffold to fibrin glue in a porcine model of mechanically induced anorectal fistula. Inflamm Bowel Dis. 23 (11), 1962-1971 (2017).
  21. Mahoney, C. M., Imbarlina, C., Yates, C. C., Marra, K. G. Current therapeutic strategies for adipose tissue defects/repair using engineered biomaterials and biomolecule formulations. Front Pharmacol. 9, 507(2018).
  22. Li, Y., Meng, H., Liu, Y., Lee, B. P. Fibrin gel as an injectable biodegradable scaffold and cell carrier for tissue engineering. ScientificWorldJournal. 2015, 685690(2015).
  23. Malafaya, P. B., Silva, G. A., Reis, R. L. Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications. Adv Drug Deliv Rev. 59 (4-5), 207-233 (2007).
  24. Jackson, M. R. Fibrin sealants in surgical practice: An overview. Am J Surg. 182 (2 Suppl), 1s-7s (2001).
  25. Swartz, D. D., Russell, J. A., Andreadis, S. T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (3), H1451-H1460 (2005).
  26. Alharbi, Z., et al. Conventional vs. micro-fat harvesting: how fat harvesting technique affects tissue-engineering approaches using adipose tissue-derived stem/stromal cells. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 66 (9), 1271-1278 (2013).
  27. Coleman, S. R. Structural fat grafts: the ideal filler. Clin Plast Surg. 28 (1), 111-119 (2001).
  28. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  29. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  30. Pallua, N., Kim, B. S. Microfat and lipoconcentrate for the treatment of facial scars. Clin Plast Surg. 47 (1), 139-145 (2020).
  31. Pallua, N., Grasys, J., Kim, B. S. Enhancement of progenitor cells by two-step centrifugation of emulsified lipoaspirates. Plast Reconstr Surg. 142 (1), 99-109 (2018).
  32. Lehnhardt, M., et al. Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002. Plast Reconstr Surg. 121 (6), 396e-403e (2008).
  33. Shoshani, O., et al. The effect of lidocaine and adrenaline on the viability of injected adipose tissue--an experimental study in nude mice. J Drugs Dermatol. 4 (3), 311-316 (2005).
  34. Girard, A. C., et al. New insights into lidocaine and adrenaline effects on human adipose stem cells. Aesthetic Plast Surg. 37 (1), 144-152 (2013).
  35. Grambow, F., et al. The impact of lidocaine on adipose-derived stem cells in human adipose tissue harvested by liposuction and used for lipotransfer. Int J Mol Sci. 21 (8), 2869(2020).
  36. Xiao, S., et al. Mechanical micronization of lipoaspirates combined with fractional CO2 laser for the treatment of hypertrophic scars. Plast Reconstr Surg. 151 (3), 549-559 (2023).
  37. Zhang, J., et al. Adipose tissue-derived pericytes for cartilage tissue engineering. Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 513-521 (2017).
  38. Yao, Y., et al. Adipose extracellular matrix/stromal vascular fraction gel: A novel adipose tissue-derived injectable for stem cell therapy. Plast Reconstr Surg. 139 (4), 867-879 (2017).
  39. Williams, S. K., Touroo, J. S., Church, K. H., Hoying, J. B. Encapsulation of adipose stromal vascular fraction cells in alginate hydrogel spheroids using a direct-write three-dimensional printing system. Biores Open Access. 2 (6), 448-454 (2013).
  40. Denost, Q., et al. Colorectal wall regeneration resulting from the association of chitosan hydrogel and stromal vascular fraction from adipose tissue. J Biomed Mater Res A. 106 (2), 460-467 (2018).
  41. Nilforoushzadeh, M. A., et al. Engineered skin graft with stromal vascular fraction cells encapsulated in fibrin-collagen hydrogel: A clinical study for diabetic wound healing. J Tissue Eng Regen Med. 14 (3), 424-440 (2020).
  42. Lin, S. D., et al. Injected implant of uncultured stromal vascular fraction loaded onto a collagen gel: In vivo study of adipogenesis and long-term outcomes. Ann Plast Surg. 76 (Suppl 1), S108-S116 (2016).
  43. Lv, X., et al. Comparative efficacy of autologous stromal vascular fraction and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells combined with hyaluronic acid for the treatment of sheep osteoarthritis. Cell Transplant. 27 (7), 1111-1125 (2018).
  44. de Boer, M. T., Boonstra, E. A., Lisman, T., Porte, R. J. Role of fibrin sealants in liver surgery. Dig Surg. 29 (1), 54-61 (2012).
  45. Fuller, C. Reduction of intraoperative air leaks with Progel in pulmonary resection: a comprehensive review. J Cardiothorac Surg. 8, 90(2013).
  46. Ratnalingam, V., Eu, A. L., Ng, G. L., Taharin, R., John, E. Fibrin adhesive is better than sutures in pterygium surgery. Cornea. 29 (5), 485-489 (2010).
  47. Sierra, D. H. Fibrin sealant adhesive systems: a review of their chemistry, material properties and clinical applications. J Biomater Appl. 7 (4), 309-352 (1993).
  48. Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Комбинация механически изолированной стромальной васкулярной фракции и фибринового гидрогеля: протокол процессинга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.